CN115521390A - 一种糖基化芦丁的制备方法 - Google Patents

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    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0009—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid alpha-D-Glucans, e.g. polydextrose, alternan, glycogen; (alpha-1,4)(alpha-1,6)-D-Glucans; (alpha-1,3)(alpha-1,4)-D-Glucans, e.g. isolichenan or nigeran; (alpha-1,4)-D-Glucans; (alpha-1,3)-D-Glucans, e.g. pseudonigeran; Derivatives thereof
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Abstract

一种糖基化芦丁的制备方法，所述的糖基化芦丁为葡糖基芦丁，其制备包括步骤如下：(1)糖基受体芦丁溶液制备；(2)糖基供体溶液制备；(3)糖基化反应；(4)反应液脱酶处理；(5)脱酶处理液的分离纯化；(6)浓缩，冷冻干燥。制备出含量96～99％，总收率95～102％的葡糖基芦丁冻干粉，方法简便。

Description

一种糖基化芦丁的制备方法
技术领域
一种糖基化芦丁的制备方法。
背景技术
葡糖基芦丁(Glucosylrutin)分子式C33H40O21，分子量772.65800，CAS号：130603-71-3英文同词：a-Glucosylrutin；4(G)-alpha-glucopyranosyl-rutin；4H-1-Benzopyran-4-one，3-[(O-6-deoxy-α-L-mannopyranosyl-(1→6)-O-[α-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranosyl)oxy]-2-(3，4-dihydroxyphenyl)-5，7-dihydroxy-；3-(6-O-(6-Deoxy-alpha.-L-mannopyranosyl-O-(alpha.-D-glucopyranosyl)-(beta.-D-glucopyranosyl)oxy)-2-(Chemicalbook3，4-dihydroxyphenyl)5，7-dihydroxy-4H-1-benzopyran-4-on；2-(3，4-dihydroxyphenyl)-3-[(2S，3R，4R，5S，6R)-3，4-dihydroxy-5-[(2R，3R，4S，5S，6R)-3，4，5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[[(2R，3R，4R，5R，6S)-3，4，5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxymethyl]oxan-2-yl]oxy-5，7-dihydroxychromen-4-one
葡糖基芦丁的水溶性是芦丁的1.2万倍，具有极强的活性氧消除能力，具有极强的自由基清除能力。皮肤的光老化导致失去弹性蛋白和胶原蛋白，伴随这黑斑、细纹、皱纹和皮肤弹性的丧失，让我们失去了自然年轻的外观。葡糖基芦丁结合紫外线吸收的特性，可以保护表皮和真皮免受紫外线的伤害，减少红斑、皱纹，让皮肤不会再受紫外线影响的困扰。葡糖基芦丁是预防皮肤光老化和延缓衰老以及抗蓝光的的理想化合物，在抗衰老的化妆品和保健品中有非常广泛的运用。在化妆品里的运用：眼霜、晚霜、精华、面膜、防晒类产品、晒后损伤修复、水溶性防晒产品等。
Figure BSA0000278466280000011
全球范围内，葡糖基芦丁核心厂商主要包括浙江英沃迪、安易科、广州家化化学和Toyo Sugar Refining Grou等。2021年，全球第一梯队厂商主要有浙江英沃迪、安易科、广州家化化学和Toyo Sugar Refining Grou。CFDA已批准使用的化妆品原料名称目录(第一批)。利用生物酶工程技术-糖苷化技术对芦丁分子结构进行修饰而制得葡糖基芦丁，使水溶性提高，更有利于应用。应用于法国仙婷SETHIC RUTINAGE P/安肤芦丁。葡糖基芦丁是高度稳定、无味的芦丁衍生物，具有较高的水溶性。第一个已知的通过抑制PLE皮肤对紫外线的反应来预防日光性过敏反应的成分。
发明内容
一种糖基化芦丁的制备方法，所述的糖基化芦丁为葡糖基芦丁，其制备包括步骤如下：(1)糖基受体芦丁溶液制备；(2)糖基供体溶液制备；(3)糖基化反应；(4)反应液脱酶处理；(5)脱酶处理液的分离纯化；(6)浓缩，冷冻干燥。
所述的糖基化芦丁的制备方法，步骤(1)中糖基受体芦丁溶液制备，糖基受体芦丁溶于二甲基亚砜中，配成初始浓度为1～2mg·mL-1。
所述的糖基化芦丁的制备方法，步骤(2)中糖基供体溶液制备，最佳糖基供体为α-或β-或γ-环糊精，溶于pH7.4磷酸缓冲盐溶液中，配成初始浓度为30～40mg·mL-1。
所述的糖基化芦丁的制备方法，步骤(3)中糖基化反应，糖基受体芦丁与糖基供体在环糊精葡萄糖基转移酶催化下进行糖基化反应，反应结束后灭酶处理，得到糖基化反应液；
所述的糖基化催化剂为环糊精葡萄糖基转移酶；
所述的糖基受体与糖基供体体积比为2∶6；
所述的最适反应温度45～60℃，最佳反应体系pH值为6.0～8.0，最优反应时间为24～30h；
所述的α-环糊精葡萄糖基转移酶溶液活力为80～100U/mL；
所述的灭酶80～90℃，时间5～15min。
所述的糖基化芦丁的制备方法，步骤(4)中反应液脱酶处理，将步骤(3)所得糖基化反应液经两次超滤，去除反应液中的酶，合并滤过液，得到脱酶反应液；
所述的超滤膜截留分子量为10000～50000Da；
所述的超滤压力为0.06～0.22MPa；
所述的第一次超滤截留液与滤过液的体积比为1∶6～7(v/v)；
所述的第二次超滤截留液与滤过液的体积比为1∶7～10(v/v)。
所述的糖基化芦丁的制备方法，步骤(5)中脱酶处理液的分离纯化，以大孔树脂吸附分离，大孔树脂湿法装入树脂柱，水洗涤平衡后，将脱酶处理液加入树脂柱，以0.5mL/min的上样速度上样，静态吸附30～50min，吸附饱和后，用水和洗脱液梯度洗脱，收集洗脱液；
所述的梯度洗脱，采用2.0～4.0BV的pH值5～7，温度15～25℃的纯化水洗涤，去除杂质，直至洗脱液清亮；
再用5～10wt％乙醇溶液2.0～4.0BV洗脱大孔树脂吸附柱，得组分1；
接着用20～60wt％的乙醇溶液2.0～5.0BV洗脱大孔树脂吸附柱，得组分2；
最后用70～80wt％乙醇溶液2.0～4.0BV洗脱大孔树脂吸附柱，得组分3；
所述的大孔树脂，AB-8、D101、D140、DM130或D201中之一；
收集240～310nm有紫外吸收的组分2，为糖基化芦丁分离液。
所述的糖基化芦丁的制备方法，步骤(6)中浓缩，冷冻干燥，将步骤(5)中得到的糖基化芦丁分离液浓缩，冷冻干燥；
所述的的糖基化芦丁分离液浓缩，在真空度-(82.7～90.6)KPa，温度50～60℃下浓缩成相对比重1.00～1.10；
所述的冷冻干燥，先送入低温冰箱于-(40～30)℃下进行预冻14～22h，再送入冷冻干燥机中，在压力30～60Pa，温度为-(45～40)下进行冷冻干燥32～38h。
具体实施方式
pH7.4磷酸盐缓冲溶液配制：磷酸二氢钾0.24g、磷酸氢二钠1.44g、氯化钠8g、氯化钾0.2g，加去离子水约800mL，充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。糖基受体芦丁溶于DMSO中，配成芦丁浓度为1～2mg·mL-1的糖基受体芦丁溶解液，α-环糊精溶于pH7.4磷酸缓冲盐溶液中，配成浓度为30～40mg·mL-1的溶液，糖基受体芦丁溶解液和糖基配体液均加入到三口瓶中，水浴加热，待溶液温度达到45～60℃时，向其中加入活力为80～100U/mL的α-环糊精葡萄糖基转移酶溶液，再用稀盐酸溶液调节pH为6.0～8.0，其中活力为80～100U/mL的α-环糊精葡萄糖基转移酶溶液的体积为糖基受体芦丁溶解液体积的1/1000～1/1500，在60～150r/min的搅拌速度下恒温搅拌反应24～30h，制备出糖基化芦丁反应液，反应完成后升温至80～90℃，保持5～15min，使酶失活，超滤除去反应液中的酶。
将制备的糖基化芦丁反应液泵入截留分子量为10000～50000Da的超滤器中，在0.05～0.2MPa的压力下进行第一次超滤，第一次超滤截留液与滤过液的体积比为1∶6～7(v/v)时停止超滤，收集第一次超滤的滤过液和截留液，向第一次超滤的截留液中加入3～5倍(w/w)的纯化水，进行第二次超滤，所用膜的截留分子量及超滤压力均与第一次超滤相同，第二次超滤截留液与滤过液的体积比为1∶7～10(v/v)时停止超滤，收集第二次超滤的滤过液和截留液，对第二次和第一次超滤的滤过液合并，制备出脱酶滤过液。
取DM130大孔树脂用90～95％乙醇浸泡24h，充分溶胀，用无水乙醇淋洗至无浑浊，去离子水冲洗至流出液无白色浑浊，清亮为止，采用柱径高比为1∶10～15的层析柱，将处理后的DM130大孔树脂为填料，加入到层析柱中，水洗涤平衡。将以0.5mL/min的上样速度上样，静态吸附30～50min，采用2.0～4.0倍树脂体积的pH值为4～6，温度为15～25℃的水进行快速洗涤，去除杂质，直至洗脱液清亮。再用2.0～4.0倍树脂体积的5～10wt％的乙醇溶液洗脱DM130大孔树脂，得组分1；接着用2.0～4.0倍树脂体积的20～60wt％体积溶度的乙醇溶液洗脱树脂柱，得组分2；再用2.0～4.0倍树脂体积的70～90wt％体积溶度的乙醇溶液洗脱树脂柱，得组分3；收集240～310nm有紫外吸收的组分2，为糖基化芦丁分离液。
所得的糖基化芦丁分离液在真空度-(82.7～90.6)KPa，温度50～60℃下浓缩成相对比重1.00～1.10，浓缩液先送入低温冰箱于-(40～30)℃下进行预冻14～24h，再送入冷冻干燥机中，在压力为30～60Pa、温度为-(45～40)下进行冷冻干燥32～38h，制备出含量96～99％，总收率95～102％的葡糖基芦丁冻干粉。HPLC法的色谱条件为：色谱柱使用Agilent公司ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.5mm×150mm，5μm)，流动相为乙腈-超纯水-甲酸(18∶81.9∶0.1，v/v/v)，流动相流速为0.8mL/min，紫外检测波长为254nm，柱温30℃，进样量5μL。

Claims (7)

1.一种糖基化芦丁的制备方法，所述的糖基化芦丁为葡糖基芦丁，其制备包括步骤如下：(1)糖基受体芦丁溶液制备；(2)糖基供体溶液制备；(3)糖基化反应；(4)反应液脱酶处理；(5)脱酶处理液的分离纯化；(6)浓缩，冷冻干燥。
2.一种糖基化芦丁的制备方法，其特征在于，步骤(1)中糖基受体芦丁溶液制备，糖基受体芦丁溶于二甲基亚砜中，配成初始浓度为1～2mg·mL-1。
3.一种糖基化芦丁的制备方法，其特征在于，步骤(2)中糖基供体溶液制备，最佳糖基供体为α-或β-或γ-环糊精，溶于pH7.4磷酸缓冲盐溶液中，配成初始浓度为30～40mg·mL-1。
4.一种糖基化芦丁的制备方法，其特征在于，步骤(3)中糖基化反应，糖基受体芦丁与糖基供体在环糊精葡萄糖基转移酶催化下进行糖基化反应，反应结束后灭酶处理，得到糖基化反应液；
所述的糖基化催化剂为环糊精葡萄糖基转移酶；
所述的糖基受体与糖基供体体积比为2∶6；
所述的最适反应温度45～60℃，最佳反应体系pH值为6.0～8.0，最优反应时间为24～30h；
所述的α-环糊精葡萄糖基转移酶溶液活力为80～100U/mL；
所述的灭酶80～90℃，时间5～15min。
5.一种糖基化芦丁的制备方法，其特征在于，步骤(4)中反应液脱酶处理，将步骤(3)所得糖基化反应液经两次超滤，去除反应液中的酶，合并滤过液，得到脱酶反应液；
所述的超滤膜截留分子量为10000～50000Da；
所述的超滤压力为0.06～0.22MPa；
所述的第一次超滤截留液与滤过液的体积比为1∶6～7(v/v)；
所述的第二次超滤截留液与滤过液的体积比为1∶7～10(v/v)。
6.一种糖基化芦丁的制备方法，其特征在于，步骤(5)中脱酶处理液的分离纯化，以大孔树脂吸附分离，大孔树脂湿法装入树脂柱，水洗涤平衡后，将脱酶处理液加入树脂柱，以0.5mL/min的上样速度上样，静态吸附30～50min，吸附饱和后，用水和洗脱液梯度洗脱，收集洗脱液；
所述的梯度洗脱，采用2.0～4.0BV的pH值5～7，温度15～25℃的纯化水洗涤，去除杂质，直至洗脱液清亮；
再用5～10wt％乙醇溶液2.0～4.0BV洗脱大孔树脂吸附柱，得组分1；
接着用20～60wt％的乙醇溶液2.0～5.0BV洗脱大孔树脂吸附柱，得组分2；
最后用70～80wt％乙醇溶液2.0～4.0BV洗脱大孔树脂吸附柱，得组分3；
所述的大孔树脂，AB-8、D101、D140、DM130或D201中之一；
收集240～310nm有紫外吸收的组分2，为糖基化芦丁分离液。
7.一种糖基化芦丁的制备方法，其特征在于，步骤(6)中浓缩，冷冻干燥，将步骤(5)中得到的糖基化芦丁分离液浓缩，冷冻干燥；
所述的的糖基化芦丁分离液浓缩，在真空度-(82.7～90.6)KPa，温度50～60℃下浓缩成相对比重1.00～1.10；
所述的冷冻干燥，先送入低温冰箱于-(40～30)℃下进行预冻14～22h，再送入冷冻干燥机中，在压力30～60Pa，温度为-(45～40)下进行冷冻干燥32～38h。
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