CN106434796A - 一种制备糖基化橙皮苷的方法 - Google Patents
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Abstract
一种制备糖基化橙皮苷的方法，属于黄酮化合物改性制备技术领域。本发明以橙皮苷、α‑或β‑或γ‑环糊精为原料，以α‑环糊精葡萄糖基转移酶为催化剂，经过配制橙皮苷待反应溶液，制备糖基化橙皮苷反应液，制备脱酶滤过液，装配MCI GEL CHP精细填料柱系统，制备糖基化橙皮苷精细分离液，制备糖基化橙皮苷冻干粉的步骤，制备出纯度超过98％的糖基化橙皮苷冻干粉。本发明所采用的催化剂，能实现橙皮苷的完全糖基化，催化效率高且稳定；采用MCI GEL CHP精细分离填料，具有分离精度高、产品纯度高的优势；采用多种现代化工技术和设备，具有操作简便，条件温和，节约能源，生产成本低等特点；并且生产过程无“三废”产生，是典型的绿色生产工艺，便于推广应用。
Description
一、技术领域
本发明属于黄酮化合物改性制备技术领域，具体涉及一种制备糖基化橙皮苷的方法。
二、背景技术
橙皮苷具有抗氧化、抗癌、抗肿瘤、抗炎症、抗过敏、预防循环系统疾患和提高机体免疫能力等作用，广泛应用于医药、食品、日化品、饲料等领域，附加值较高。然而，橙皮苷在水中的溶解度仅为2mg/100g，其应用领域受到限制，必须对其进行改性，以拓展橙皮苷在食品、化妆品和医药领域的应用。有关橙皮苷改性的报道较多，主要分为化学改性和生物酶法改性。由于酶的专一性强，条件温和，无“三废”产生，成为改性橙皮苷的主要方法。
现有酶改性制备橙皮苷的方法，例如赵春花等于2015年申请的申请号为201510175651.9的发明专利，该专利公开了以β-环糊精转葡萄糖基酶为催化剂，以低纯度橙皮苷和β-环糊精为原料合成水溶性橙皮苷的方法。该方法的缺陷是：①使用浓度高达1mol/L的氢氧化钠水溶液溶解橙皮苷，并用盐酸调节pH至6～8，致使大量的橙皮苷析出，在非均相状态下进行酶的转糖基化反应，水溶性单糖基橙皮苷的转化率仅为63.5～71.7％，而且，需要通过离心回收未溶解的橙皮苷沉淀，造成无谓的能耗和原料损失；②没有回收被β-环糊精转葡萄糖基酶断键的β-低聚葡萄糖，浪费了可作为水溶性膳食纤维的宝贵材料，增加了生产成本。又例如盛占武等于2010年4月在中国食品学报第10卷8期发表了《响应面法优化橙皮苷酶法改性工艺研究》的论文，该论文公开了用环糊精葡萄糖基转移酶改性橙皮苷的优化工艺条件为：温度55℃、pH7、加酶量800U/g；通过验证试验得出转化率为78.03％。该方法的不足之处是：①使用的是实验室研制的环糊精葡萄糖基转移酶和环糊精，而非市售的环糊精葡萄糖基转移酶，难以实现工业化生产，即使加酶量高达800U/g橙皮苷，其最高转化率也仅为78.03％；②以甘氨酸-氢氧化钠等缓冲溶液溶解橙皮苷、控制反应pH且不回收，由于甘氨酸价格高，用量大，因此，生产成本高；③未回收β-低聚葡萄糖等，造成资源浪费和环境污染；④尚未对改性橙皮苷进行分离纯化，产品纯度低，杂质含量高。
三、发明内容
本发明是针对现有酶改性橙皮苷技术的不足之处，提供一种制备糖基化橙皮苷的方法。该方法具有操作简单、高效、连续性强、β-低聚葡萄糖可回收综合利用，产品纯度高且稳定等特点。
本发明的原理是：橙皮苷是二氢黄酮类化合物，其环上4位羟基最活泼，在环糊精葡萄糖基转移酶作用下，将环糊精分子内部的一个葡萄糖残基切割下来，并转移到橙皮苷分子中的芦丁糖第四位羟基上，形成糖苷键，于是就合成了糖基化橙皮苷和开环β-低聚葡萄糖；环糊精葡萄糖基转移酶分子量高达数万Da，糖基化橙皮苷分子量为772Da，而开环α-、β-或γ-低聚葡萄糖均为线性分子，其分子量分别为900、1062或1224Da，差异显著，可通过超滤膜将环糊精葡萄糖基转移酶与糖基化橙皮苷及开环β-低聚葡萄糖予以分离；而糖基化橙皮苷及开环β-低聚葡萄糖的分子量差异同样明显，通过特定孔径的凝胶树脂耗费的时间不同，可用基于分子筛原理的MCI凝胶树脂予以精细分离；分离后的糖基化橙皮苷及开环β-低聚葡萄糖分别可用纳滤膜进行浓缩，最后进行冷冻干燥，就分别制备出高纯度的糖基化橙皮苷和水溶性膳食纤维β-低聚葡萄糖。
本发明的目的是通过以下途径实现的，一种制备糖基化橙皮苷的方法，以橙皮苷、α-或β-或γ-环糊精为原料，以α-环糊精葡萄糖基转移酶为催化剂，经过配制橙皮苷待反应溶液，制备糖基化橙皮苷反应液，制备脱酶滤过液，装配MCI GEL CHP精细填料柱系统，制备糖基化橙皮苷精细分离液，制备糖基化橙皮苷冻干粉，制备β-低聚葡萄糖水溶性膳食纤维粉的步骤，快速制备出纯度超过98％的糖基化橙皮苷冻干粉。其具体的工艺步骤如下：
(1)配制橙皮苷待反应溶液
先在反应釜中将质量百分浓度为30～50％的离子膜液体烧碱用纯净水稀释成质量百分浓度为0.1～0.4％的氢氧化钠水溶液，再将质量百分含量为95～98％橙皮苷加入，其中质量百分含量为95～98％橙皮苷的质量与质量百分浓度为0.1～0.4％的氢氧化钠水溶液的体积之比(kg/L)为1∶50～200。在搅拌下溶解15～30min后用质量百分浓度为3～6％的稀盐酸调节pH至4～5，接着，在搅拌下加入α-或β-或γ-环糊精，α-或β-或γ-环糊精的加入摩尔数为已经加入的橙皮苷摩尔数的1.2～1.5倍。最后，向反应釜夹层通入温度为45～50℃的恒温循环水，就配制出橙皮苷待反应溶液，用于下步制备糖基化橙皮苷反应液。
(2)制备糖基化橙皮苷反应液
待第(1)步制备的橙皮苷待反应溶液温度达到45～50℃时，向其中加入活力为70～90U/mL的α-环糊精转葡萄糖基酶溶液，其中活力为70～90U/mL的α-环糊精转葡萄糖基酶溶液的体积与橙皮苷待反应溶液的体积之比(L/L)为1∶1200～1500。在60～150r/min的搅拌速度下进行糖基化反应20～24h，即制备出糖基化橙皮苷反应液，用于下步制备脱酶滤过液。
(3)制备脱酶滤过液
第(2)步完成后，将第(2)步制备的糖基化橙皮苷反应液泵入截留分子量为10000～50000Da的超滤器中，在表压为0.05～0.2MPa的压力下进行第一次超滤，直至第一次超滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶8～9时停止第一次超滤。分别收集第一次超滤的滤过液和截留液，对收集的第一次超滤的截留液，向其中加入其体积3～6倍的纯净水溶液，再次进行第二次超滤，第二次超滤所用膜的截留分子量及超滤压力均与第一次超滤相同，直至第二次超滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶8～9时停止第二次超滤。分别收集第二次超滤的滤过液和截留液，对收集的第二次超滤的滤过液，与第一次超滤的滤过液进行合并，即制备出脱酶滤过液，用于制备糖基化橙皮苷精细分离液；对收集的第二次超滤的截留液，尚存部分酶活力，可部分水解饲料中纤维素的β-糖苷键，用于配制反刍动物饲料。
(4)装配MCI GEL CHP精细填料柱系统
第(3)步完成后，将新购的粒径为75～150微米的MCI GEL CHP 20P或63～150微米的MCI GEL CHP 20SS精细分离填料先用质量百分浓度为0.1～0.4％的氯化钠水溶液分散，再装入中压层析柱并通过蠕动泵与紫外检测器和收集器连接，就装配出MCI GEL CHP精细填料柱系统，用于下步制备糖基化橙皮苷精细分离液。
(5)制备糖基化橙皮苷精细分离液
第(4)步完成后，先向第(4)步制备的MCI GEL CHP精细填料柱系统中泵入质量百分浓度为0.1～0.4％的氯化钠水溶液，泵入该氯化钠水溶液的流速为0.5～2倍树脂柱体积/小时，该氯化钠水溶液的泵入体积为MCI GEL CHP精细填料柱体积的1～2倍。泵入完成后，即制备出活化MCI GEL CHP精细填料柱。活化MCI GEL CHP精细填料柱制备完成后，将第(3)步制备的脱酶滤过液泵入到活化MCI GEL CHP精细填料柱中，泵入的脱酶滤过液与活化MCI GEL CHP精细填料柱体积之比(L/L)为1∶10～15，泵入流速为活化MCI GEL CHP精细填料柱体积的1～2倍/小时。脱酶滤过液泵入后，分别收集荷载糖基化橙皮苷的MCI GEL CHP精细填料柱和过柱流出液。对收集的过柱流出液，为质量百分浓度为0.1～0.4％的氯化钠水溶液，用于下批次活化MCI GEL CHP精细填料柱；对收集的荷载糖基化橙皮苷的MCI GELCHP精细填料柱，泵入质量百分浓度为0.1～0.4％的氯化钠水溶液，泵入该氯化钠水溶液的体积为该树脂柱体积的2～5倍，泵入该氯化钠水溶液的流速为该树脂柱体积的1～2倍/小时。分别收集有260～300nm紫外吸收的洗脱流出液、无260～300nm紫外吸收的洗脱流出液以及脱附糖基化橙皮苷和β-低聚葡萄糖的MCI GEL CHP精细填料柱，对收集的脱附糖基化橙皮苷和β-低聚葡萄糖的MCI GEL CHP精细填料柱，用1～2倍该树脂柱体积的质量百分浓度为0.1～0.4％的氯化钠水溶液平衡后可再次用于下批次制备糖基化橙皮苷精细分离液；对收集的有260～300nm紫外吸收的洗脱流出液，为糖基化橙皮苷精细分离液，用于下步制备糖基化橙皮苷冻干粉；对收集的无260～300nm紫外吸收的洗脱流出液，含β-低聚葡萄糖，用于制备β-低聚葡萄糖水溶性膳食纤维粉。
(6)制备糖基化橙皮苷冻干粉
第(5)步完成后，将第(5)步收集的糖基化橙皮苷精细分离液泵入截留分子量为200～600Da的纳滤器中，在表压为0.5～0.8MPa的压力下进行第一次纳滤，直至第一次纳滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶5～8时停止第一次纳滤。分别收集第一次纳滤的滤过液和截留液，对收集的第一次纳滤的截留液，向其中加入其体积3～6倍的纯净水溶液，再次进行第二次纳滤，第二次纳滤所用纳滤膜的截留分子量及纳滤压力均与第一次纳滤相同，直至第二次纳滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶8～9时停止第二次纳滤。分别收集第二次纳滤的滤过液和截留液，对收集的第二次纳滤的滤过液，与第一次纳滤的滤过液进行合并，泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的第二次纳滤的截留液，先送入低温冰箱于-40～-30℃下进行预冻16～24h，再送入冷冻干燥机中，在表压为20～50Pa、温度为-50～-40℃下进行冷冻干燥30～36h，即制备出纯度高达98～99％、总收得率高达90～95％的糖基化橙皮苷冻干粉。
(7)制备β-低聚葡萄糖水溶性膳食纤维粉
第(5)步完成后，将第(5)步收集的无260～300nm紫外吸收的洗脱流出液泵入截留分子量为600～1000Da的纳滤器中，在表压为0.5～0.8MPa的压力下进行第一次纳滤，直至第一次纳滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶5～8时停止第一次纳滤。分别收集第一次纳滤的滤过液和截留液，对收集的第一次纳滤的截留液，向其中加入其体积3～6倍的纯净水溶液，再次进行第二次纳滤，第二次纳滤所用纳滤膜的截留分子量及纳滤压力均与第一次纳滤相同，直至第二次纳滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶8～9时停止第二次纳滤。分别收集第二次纳滤的滤过液和截留液，对收集的第二次纳滤的滤过液，与第一次纳滤的滤过液进行合并，泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的第二次纳滤的截留液，送入喷雾干燥机进行喷雾干燥，喷雾干燥的条件为：进风温度为150～180℃、出风温度为85～95℃、喷雾离心机转速为5000～8000r/min，即制备出纯度高达90～95％、总收得率高达92～95％的β-低聚葡萄糖水溶性膳食纤维粉。
本发明采用了上述技术手段后主要产生了以下效果：
1、本发明方法在生产过程中使用酶催化、MCI GEL CHP精细分离填料、超滤、纳滤、冷冻干燥和喷雾干燥等现代化工技术和设备，具有操作简便，分离精准，条件温和，节约能源，生产成本低等特点；
2、本发明采用工业化生产的α-环糊精转葡萄糖基酶为催化剂，实现橙皮苷的完全糖基化，糖基化橙皮苷的转化率达100％，具有催化效率高且稳定等优点；
3、本发明采用MCI GEL CHP精细分离填料分离糖基化橙皮苷和β-低聚葡萄糖，分离获得的糖基化橙皮苷纯度高达98～99％、总收得率高达90～95％；分离获得的β-低聚葡萄糖水溶性膳食纤维纯度高达90～95％、总收得率高达92～95％，具有分离精度高、产品纯度高的优势；
4、本发明使用超滤分离α-环糊精转葡萄糖基酶，以纳滤分离氯化钠及浓缩糖基化橙皮苷和β-低聚葡萄糖，分离精度较高，能耗低，节能效果显著；
5、本发明生产过程中产生的副产物，均得到有效利用，无“三废”产生，是典型的绿色生产工艺，便于推广应用。
四、具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步说明本发明。
实施例1
(1)配制橙皮苷待反应溶液
先在反应釜中将质量百分浓度为30％的离子膜液体烧碱用纯净水稀释成质量百分浓度为0.1％的氢氧化钠水溶液，再将质量百分含量为95％橙皮苷加入，其中质量百分含量为95％橙皮苷的质量与质量百分浓度为0.1％的氢氧化钠水溶液的体积之比(kg/L)为1∶50。在搅拌下溶解15min后用质量百分浓度为3％的稀盐酸调节pH至4，接着，在搅拌下加入α-环糊精，α-环糊精的加入摩尔数为已经加入的橙皮苷摩尔数的1.2倍。最后，向反应釜夹层通入温度为45℃的恒温循环水，就配制出橙皮苷待反应溶液，用于下步制备糖基化橙皮苷反应液。
(2)制备糖基化橙皮苷反应液
待第(1)步制备的橙皮苷待反应溶液温度达到45℃时，向其中加入活力为70U/mL的α-环糊精转葡萄糖基酶溶液，其中活力为70U/mL的α-环糊精转葡萄糖基酶溶液的体积与橙皮苷待反应溶液的体积之比(L/L)为1∶1200。在60r/min的搅拌速度下进行糖基化反应20h，即制备出糖基化橙皮苷反应液，用于下步制备脱酶滤过液。
(3)制备脱酶滤过液
第(2)步完成后，将第(2)步制备的糖基化橙皮苷反应液泵入截留分子量为10000Da的超滤器中，在表压为0.05MPa的压力下进行第一次超滤，直至第一次超滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶8时停止第一次超滤。分别收集第一次超滤的滤过液和截留液，对收集的第一次超滤的截留液，向其中加入其体积3倍的纯净水溶液，再次进行第二次超滤，第二次超滤所用膜的截留分子量及超滤压力均与第一次超滤相同，直至第二次超滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶8时停止第二次超滤。分别收集第二次超滤的滤过液和截留液，对收集的第二次超滤的滤过液，与第一次超滤的滤过液进行合并，即制备出脱酶滤过液，用于制备糖基化橙皮苷精细分离液；对收集的第二次超滤的截留液，尚存部分酶活力，可部分水解饲料中纤维素的β-糖苷键，用于配制反刍动物饲料。
(4)装配MCI GEL CHP精细填料柱系统
第(3)步完成后，将新购的粒径为75～150微米的MCI GEL CHP20P精细分离填料先用质量百分浓度为0.1％的氯化钠水溶液分散，再装入中压层析柱并通过蠕动泵与紫外检测器和收集器连接，就装配出MCI GEL CHP精细填料柱系统，用于下步制备糖基化橙皮苷精细分离液。
(5)制备糖基化橙皮苷精细分离液
第(4)步完成后，先向第(4)步制备的MCI GEL CHP精细填料柱系统中泵入质量百分浓度为0.1％的氯化钠水溶液，泵入该氯化钠水溶液的流速为0.5倍树脂柱体积/小时，该氯化钠水溶液的泵入体积为MCI GEL CHP精细填料柱体积的1倍。泵入完成后，即制备出活化MCI GEL CHP精细填料柱。活化MCI GEL CHP精细填料柱制备完成后，将第(3)步制备的脱酶滤过液泵入到活化MCI GEL CHP精细填料柱中，泵入的脱酶滤过液与活化MCI GEL CHP精细填料柱体积之比(L/L)为1∶10，泵入流速为活化MCI GEL CHP精细填料柱体积的1倍/小时。脱酶滤过液泵入后，分别收集荷载糖基化橙皮苷的MCI GEL CHP精细填料柱和过柱流出液。对收集的过柱流出液，为质量百分浓度为0.1％的氯化钠水溶液，用于下批次活化MCIGEL CHP精细填料柱；对收集的荷载糖基化橙皮苷的MCI GEL CHP精细填料柱，泵入质量百分浓度为0.1％的氯化钠水溶液，泵入该氯化钠水溶液的体积为该树脂柱体积的2倍，泵入该氯化钠水溶液的流速为该树脂柱体积的1倍/小时。分别收集有260～300nm紫外吸收的洗脱流出液、无260～300nm紫外吸收的洗脱流出液以及脱附糖基化橙皮苷和β-低聚葡萄糖的MCI GEL CHP精细填料柱，对收集的脱附糖基化橙皮苷和β-低聚葡萄糖的MCI GEL CHP精细填料柱，用1倍该树脂柱体积的质量百分浓度为0.1的氯化钠水溶液平衡后可再次用于下批次制备糖基化橙皮苷精细分离液；对收集的有260～300nm紫外吸收的洗脱流出液，为糖基化橙皮苷精细分离液，用于下步制备糖基化橙皮苷冻干粉；对收集的无260～300nm紫外吸收的洗脱流出液，含β-低聚葡萄糖，用于制备β-低聚葡萄糖水溶性膳食纤维粉。
(6)制备糖基化橙皮苷冻干粉
第(5)步完成后，将第(5)步收集的糖基化橙皮苷精细分离液泵入截留分子量为200Da的纳滤器中，在表压为0.5MPa的压力下进行第一次纳滤，直至第一次纳滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶5时停止第一次纳滤。分别收集第一次纳滤的滤过液和截留液，对收集的第一次纳滤的截留液，向其中加入其体积3倍的纯净水溶液，再次进行第二次纳滤，第二次纳滤所用纳滤膜的截留分子量及纳滤压力均与第一次纳滤相同，直至第二次纳滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶8时停止第二次纳滤。分别收集第二次纳滤的滤过液和截留液，对收集的第二次纳滤的滤过液，与第一次纳滤的滤过液进行合并，泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的第二次纳滤的截留液，先送入低温冰箱于-40℃下进行预冻16h，再送入冷冻干燥机中，在表压为20Pa、温度为-50℃下进行冷冻干燥30h，即制备出纯度高达98～99％、总收得率高达90～95％的糖基化橙皮苷冻干粉。
(7)制备β-低聚葡萄糖水溶性膳食纤维粉
第(5)步完成后，将第(5)步收集的无260～300nm紫外吸收的洗脱流出液泵入截留分子量为600Da的纳滤器中，在表压为0.5MPa的压力下进行第一次纳滤，直至第一次纳滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶5时停止第一次纳滤。分别收集第一次纳滤的滤过液和截留液，对收集的第一次纳滤的截留液，向其中加入其体积3倍的纯净水溶液，再次进行第二次纳滤，第二次纳滤所用纳滤膜的截留分子量及纳滤压力均与第一次纳滤相同，直至第二次纳滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶8时停止第二次纳滤。分别收集第二次纳滤的滤过液和截留液，对收集的第二次纳滤的滤过液，与第一次纳滤的滤过液进行合并，泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的第二次纳滤的截留液，送入喷雾干燥机进行喷雾干燥，喷雾干燥的条件为：进风温度为150℃、出风温度为85℃、喷雾离心机转速为5000r/min，即制备出纯度高达90～95％、总收得率高达92～95％的β-低聚葡萄糖水溶性膳食纤维粉。
实施例2
(1)配制橙皮苷待反应溶液
先在反应釜中将质量百分浓度为40％的离子膜液体烧碱用纯净水稀释成质量百分浓度为0.25％的氢氧化钠水溶液，再将质量百分含量为98％橙皮苷加入，其中质量百分含量为98％橙皮苷的质量与质量百分浓度为0.25％的氢氧化钠水溶液的体积之比(kg/L)为1∶125。在搅拌下溶解22min后用质量百分浓度为5％的稀盐酸调节pH至4.5，接着，在搅拌下加入β-环糊精，β-环糊精的加入摩尔数为已经加入的橙皮苷摩尔数的1.4倍。最后，向反应釜夹层通入温度为47℃的恒温循环水，就配制出橙皮苷待反应溶液，用于下步制备糖基化橙皮苷反应液。
(2)制备糖基化橙皮苷反应液
待第(1)步制备的橙皮苷待反应溶液温度达到47℃时，向其中加入活力为80U/mL的α-环糊精转葡萄糖基酶溶液，其中活力为80U/mL的α-环糊精转葡萄糖基酶溶液的体积与橙皮苷待反应溶液的体积之比(L/L)为1∶1350。在105r/min的搅拌速度下进行糖基化反应22h，即制备出糖基化橙皮苷反应液，用于下步制备脱酶滤过液。
(3)制备脱酶滤过液
第(2)步完成后，将第(2)步制备的糖基化橙皮苷反应液泵入截留分子量为30000Da的超滤器中，在表压为0.12MPa的压力下进行第一次超滤，直至第一次超滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶8.5时停止第一次超滤。分别收集第一次超滤的滤过液和截留液，对收集的第一次超滤的截留液，向其中加入其体积4.5倍的纯净水溶液，再次进行第二次超滤，第二次超滤所用膜的截留分子量及超滤压力均与第一次超滤相同，直至第二次超滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶8.5时停止第二次超滤。分别收集第二次超滤的滤过液和截留液，对收集的第二次超滤的滤过液，与第一次超滤的滤过液进行合并，即制备出脱酶滤过液，用于制备糖基化橙皮苷精细分离液；对收集的第二次超滤的截留液，尚存部分酶活力，可部分水解饲料中纤维素的β-糖苷键，用于配制反刍动物饲料。
(4)装配MCI GEL CHP精细填料柱系统
第(3)步完成后，将新购的粒径为63～150微米的MCI GEL CHP 20SS精细分离填料先用质量百分浓度为0.25％的氯化钠水溶液分散，再装入中压层析柱并通过蠕动泵与紫外检测器和收集器连接，就装配出MCI GEL CHP精细填料柱系统，用于下步制备糖基化橙皮苷精细分离液。
(5)制备糖基化橙皮苷精细分离液
第(4)步完成后，先向第(4)步制备的MCI GEL CHP精细填料柱系统中泵入质量百分浓度为0.25％的氯化钠水溶液，泵入该氯化钠水溶液的流速为1.2倍树脂柱体积/小时，该氯化钠水溶液的泵入体积为MCI GEL CHP精细填料柱体积的1.5倍。泵入完成后，即制备出活化MCI GEL CHP精细填料柱。活化MCI GEL CHP精细填料柱制备完成后，将第(3)步制备的脱酶滤过液泵入到活化MCI GEL CHP精细填料柱中，泵入的脱酶滤过液与活化MCI GELCHP精细填料柱体积之比(L/L)为1∶12.5，泵入流速为活化MCI GEL CHP精细填料柱体积的1.5倍/小时。脱酶滤过液泵入后，分别收集荷载糖基化橙皮苷的MCI GEL CHP精细填料柱和过柱流出液。对收集的过柱流出液，为质量百分浓度为0.25％的氯化钠水溶液，用于下批次活化MCI GEL CHP精细填料柱；对收集的荷载糖基化橙皮苷的MCI GEL CHP精细填料柱，泵入质量百分浓度为0.25％的氯化钠水溶液，泵入该氯化钠水溶液的体积为该树脂柱体积的3.5倍，泵入该氯化钠水溶液的流速为该树脂柱体积的1.5倍/小时。分别收集有260～300nm紫外吸收的洗脱流出液、无260～300nm紫外吸收的洗脱流出液以及脱附糖基化橙皮苷和β-低聚葡萄糖的MCI GEL CHP精细填料柱，对收集的脱附糖基化橙皮苷和β-低聚葡萄糖的MCIGEL CHP精细填料柱，用1.5倍该树脂柱体积的质量百分浓度为0.25％的氯化钠水溶液平衡后可再次用于下批次制备糖基化橙皮苷精细分离液；对收集的有260～300nm紫外吸收的洗脱流出液，为糖基化橙皮苷精细分离液，用于下步制备糖基化橙皮苷冻干粉；对收集的无260～300nm紫外吸收的洗脱流出液，含β-低聚葡萄糖，用于制备β-低聚葡萄糖水溶性膳食纤维粉。
(6)制备糖基化橙皮苷冻干粉
第(5)步完成后，将第(5)步收集的糖基化橙皮苷精细分离液泵入截留分子量为400Da的纳滤器中，在表压为0.65MPa的压力下进行第一次纳滤，直至第一次纳滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶6.5时停止第一次纳滤。分别收集第一次纳滤的滤过液和截留液，对收集的第一次纳滤的截留液，向其中加入其体积4.5倍的纯净水溶液，再次进行第二次纳滤，第二次纳滤所用纳滤膜的截留分子量及纳滤压力均与第一次纳滤相同，直至第二次纳滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶8.5时停止第二次纳滤。分别收集第二次纳滤的滤过液和截留液，对收集的第二次纳滤的滤过液，与第一次纳滤的滤过液进行合并，泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的第二次纳滤的截留液，先送入低温冰箱于-35℃下进行预冻20h，再送入冷冻干燥机中，在表压为35Pa、温度为-45℃下进行冷冻干燥33h，即制备出纯度高达98～99％、总收得率高达90～95％的糖基化橙皮苷冻干粉。
(7)制备β-低聚葡萄糖水溶性膳食纤维粉
第(5)步完成后，将第(5)步收集的无260～300nm紫外吸收的洗脱流出液泵入截留分子量为800Da的纳滤器中，在表压为0.65MPa的压力下进行第一次纳滤，直至第一次纳滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶6.5时停止第一次纳滤。分别收集第一次纳滤的滤过液和截留液，对收集的第一次纳滤的截留液，向其中加入其体积4.5倍的纯净水溶液，再次进行第二次纳滤，第二次纳滤所用纳滤膜的截留分子量及纳滤压力均与第一次纳滤相同，直至第二次纳滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶8.5时停止第二次纳滤。分别收集第二次纳滤的滤过液和截留液，对收集的第二次纳滤的滤过液，与第一次纳滤的滤过液进行合并，泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的第二次纳滤的截留液，送入喷雾干燥机进行喷雾干燥，喷雾干燥的条件为：进风温度为165℃、出风温度为90℃、喷雾离心机转速为6500r/min，即制备出纯度高达90～95％、总收得率高达92～95％的β-低聚葡萄糖水溶性膳食纤维粉。
实施例3
(1)配制橙皮苷待反应溶液
先在反应釜中将质量百分浓度为50％的离子膜液体烧碱用纯净水稀释成质量百分浓度为0.4％的氢氧化钠水溶液，再将质量百分含量为95％橙皮苷加入，其中质量百分含量为95％橙皮苷的质量与质量百分浓度为0.4％的氢氧化钠水溶液的体积之比(kg/L)为1∶200。在搅拌下溶解30min后用质量百分浓度为6％的稀盐酸调节pH至5，接着，在搅拌下加入γ-环糊精，γ-环糊精的加入摩尔数为已经加入的橙皮苷摩尔数的1.5倍。最后，向反应釜夹层通入温度为50℃的恒温循环水，就配制出橙皮苷待反应溶液，用于下步制备糖基化橙皮苷反应液。
(2)制备糖基化橙皮苷反应液
待第(1)步制备的橙皮苷待反应溶液温度达到50℃时，向其中加入活力为90U/mL的α-环糊精转葡萄糖基酶溶液，其中活力为90U/mL的α-环糊精转葡萄糖基酶溶液的体积与橙皮苷待反应溶液的体积之比(L/L)为1∶1500。在150r/min的搅拌速度下进行糖基化反应24h，即制备出糖基化橙皮苷反应液，用于下步制备脱酶滤过液。
(3)制备脱酶滤过液
第(2)步完成后，将第(2)步制备的糖基化橙皮苷反应液泵入截留分子量为50000Da的超滤器中，在表压为0.2MPa的压力下进行第一次超滤，直至第一次超滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶9时停止第一次超滤。分别收集第一次超滤的滤过液和截留液，对收集的第一次超滤的截留液，向其中加入其体积6倍的纯净水溶液，再次进行第二次超滤，第二次超滤所用膜的截留分子量及超滤压力均与第一次超滤相同，直至第二次超滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶9时停止第二次超滤。分别收集第二次超滤的滤过液和截留液，对收集的第二次超滤的滤过液，与第一次超滤的滤过液进行合并，即制备出脱酶滤过液，用于制备糖基化橙皮苷精细分离液；对收集的第二次超滤的截留液，尚存部分酶活力，可部分水解饲料中纤维素的β-糖苷键，用于配制反刍动物饲料。
(4)装配MCI GEL CHP精细填料柱系统
第(3)步完成后，将新购的粒径为75～150微米的MCI GEL CHP 20P精细分离填料先用质量百分浓度为0.4％的氯化钠水溶液分散，再装入中压层析柱并通过蠕动泵与紫外检测器和收集器连接，就装配出MCI GEL CHP精细填料柱系统，用于下步制备糖基化橙皮苷精细分离液。
(5)制备糖基化橙皮苷精细分离液
第(4)步完成后，先向第(4)步制备的MCI GEL CHP精细填料柱系统中泵入质量百分浓度为0.4％的氯化钠水溶液，泵入该氯化钠水溶液的流速为2倍树脂柱体积/小时，该氯化钠水溶液的泵入体积为MCI GEL CHP精细填料柱体积的2倍。泵入完成后，即制备出活化MCI GEL CHP精细填料柱。活化MCI GEL CHP精细填料柱制备完成后，将第(3)步制备的脱酶滤过液泵入到活化MCI GEL CHP精细填料柱中，泵入的脱酶滤过液与活化MCI GEL CHP精细填料柱体积之比(L/L)为1∶15，泵入流速为活化MCI GEL CHP精细填料柱体积的2倍/小时。脱酶滤过液泵入后，分别收集荷载糖基化橙皮苷的MCI GEL CHP精细填料柱和过柱流出液。对收集的过柱流出液，为质量百分浓度为0.4％的氯化钠水溶液，用于下批次活化MCI GELCHP精细填料柱；对收集的荷载糖基化橙皮苷的MCI GEL CHP精细填料柱，泵入质量百分浓度为0.4％的氯化钠水溶液，泵入该氯化钠水溶液的体积为该树脂柱体积的5倍，泵入该氯化钠水溶液的流速为该树脂柱体积的2倍/小时。分别收集有260～300nm紫外吸收的洗脱流出液、无260～300nm紫外吸收的洗脱流出液以及脱附糖基化橙皮苷和β-低聚葡萄糖的MCIGEL CHP精细填料柱，对收集的脱附糖基化橙皮苷和β-低聚葡萄糖的MCI GEL CHP精细填料柱，用2倍该树脂柱体积的质量百分浓度为0.4％的氯化钠水溶液平衡后可再次用于下批次制备糖基化橙皮苷精细分离液；对收集的有260～300nm紫外吸收的洗脱流出液，为糖基化橙皮苷精细分离液，用于下步制备糖基化橙皮苷冻干粉；对收集的无260～300nm紫外吸收的洗脱流出液，含β-低聚葡萄糖，用于制备β-低聚葡萄糖水溶性膳食纤维粉。
(6)制备糖基化橙皮苷冻干粉
第(5)步完成后，将第(5)步收集的糖基化橙皮苷精细分离液泵入截留分子量为600Da的纳滤器中，在表压为0.8MPa的压力下进行第一次纳滤，直至第一次纳滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶8时停止第一次纳滤。分别收集第一次纳滤的滤过液和截留液，对收集的第一次纳滤的截留液，向其中加入其体积6倍的纯净水溶液，再次进行第二次纳滤，第二次纳滤所用纳滤膜的截留分子量及纳滤压力均与第一次纳滤相同，直至第二次纳滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶9时停止第二次纳滤。分别收集第二次纳滤的滤过液和截留液，对收集的第二次纳滤的滤过液，与第一次纳滤的滤过液进行合并，泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的第二次纳滤的截留液，先送入低温冰箱于-30℃下进行预冻24h，再送入冷冻干燥机中，在表压为50Pa、温度为-40℃下进行冷冻干燥36h，即制备出纯度高达98～99％、总收得率高达90～95％的糖基化橙皮苷冻干粉。
(7)制备β-低聚葡萄糖水溶性膳食纤维粉
第(5)步完成后，将第(5)步收集的无260～300nm紫外吸收的洗脱流出液泵入截留分子量为1000Da的纳滤器中，在表压为0.8MPa的压力下进行第一次纳滤，直至第一次纳滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶8时停止第一次纳滤。分别收集第一次纳滤的滤过液和截留液，对收集的第一次纳滤的截留液，向其中加入其体积6倍的纯净水溶液，再次进行第二次纳滤，第二次纳滤所用纳滤膜的截留分子量及纳滤压力均与第一次纳滤相同，直至第二次纳滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶9时停止第二次纳滤。分别收集第二次纳滤的滤过液和截留液，对收集的第二次纳滤的滤过液，与第一次纳滤的滤过液进行合并，泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的第二次纳滤的截留液，送入喷雾干燥机进行喷雾干燥，喷雾干燥的条件为：进风温度为180℃、出风温度为95℃、喷雾离心机转速为8000r/min，即制备出纯度高达90～95％、总收得率高达92～95％的β-低聚葡萄糖水溶性膳食纤维粉。
Claims (1)
1.一种制备糖基化橙皮苷的方法，其特征在于具体的工艺步骤如下：
(1)配制橙皮苷待反应溶液
先在反应釜中将质量百分浓度为30～50％的离子膜液体烧碱用纯净水稀释成质量百分浓度为0.1～0.4％的氢氧化钠水溶液，再将质量百分含量为95～98％橙皮苷加入，其中质量百分含量为95～98％橙皮苷的质量与质量百分浓度为0.1～0.4％的氢氧化钠水溶液的体积之比(kg/L)为1∶50～200，在搅拌下溶解15～30min后用质量百分浓度为3～6％的稀盐酸调节pH至4～5，接着，在搅拌下加入α-或β-或γ-环糊精，α-或β-或γ-环糊精的加入摩尔数为已经加入的橙皮苷摩尔数的1.2～1.5倍，最后，向反应釜夹层通入温度为45～50℃的恒温循环水，就配制出橙皮苷待反应溶液，用于下步制备糖基化橙皮苷反应液；
(2)制备糖基化橙皮苷反应液
待第(1)步制备的橙皮苷待反应溶液温度达到45～50℃时，向其中加入活力为70～90U/mL的α-环糊精转葡萄糖基酶溶液，其中活力为70～90U/mL的α-环糊精转葡萄糖基酶溶液的体积与橙皮苷待反应溶液的体积之比(L/L)为1∶1200～1500，在60～150r/min的搅拌速度下进行糖基化反应20～24h，即制备出糖基化橙皮苷反应液，用于下步制备脱酶滤过液；
(3)制备脱酶滤过液
第(2)步完成后，将第(2)步制备的糖基化橙皮苷反应液泵入截留分子量为10000～50000Da的超滤器中，在表压为0.05～0.2MPa的压力下进行第一次超滤，直至第一次超滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶8～9时停止第一次超滤，分别收集第一次超滤的滤过液和截留液，对收集的第一次超滤的截留液，向其中加入其体积3～6倍的纯净水溶液，再次进行第二次超滤，第二次超滤所用膜的截留分子量及超滤压力均与第一次超滤相同，直至第二次超滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶8～9时停止第二次超滤，分别收集第二次超滤的滤过液和截留液，对收集的第二次超滤的滤过液，与第一次超滤的滤过液进行合并，即制备出脱酶滤过液，用于制备糖基化橙皮苷精细分离液；对收集的第二次超滤的截留液，尚存部分酶活力，可部分水解饲料中纤维素的β-糖苷键，用于配制反刍动物饲料；
(4)装配MCI GEL CHP精细填料柱系统
第(3)步完成后，将新购的粒径为75～150微米的MCI GEL CHP 20P或63～150微米的MCI GEL CHP 20SS精细分离填料先用质量百分浓度为0.1～0.4％的氯化钠水溶液分散，再装入中压层析柱并通过蠕动泵与紫外检测器和收集器连接，就装配出MCI GEL CHP精细填料柱系统，用于下步制备糖基化橙皮苷精细分离液；
(5)制备糖基化橙皮苷精细分离液
第(4)步完成后，先向第(4)步制备的MCI GEL CHP精细填料柱系统中泵入质量百分浓度为0.1～0.4％的氯化钠水溶液，泵入该氯化钠水溶液的流速为0.5～2倍树脂柱体积/小时，该氯化钠水溶液的泵入体积为MCI GEL CHP精细填料柱体积的1～2倍，泵入完成后，即制备出活化MCI GEL CHP精细填料柱，活化MCI GEL CHP精细填料柱制备完成后，将第(3)步制备的脱酶滤过液泵入到活化MCI GEL CHP精细填料柱中，泵入的脱酶滤过液与活化MCIGEL CHP精细填料柱体积之比(L/L)为1∶10～15，泵入流速为活化MCI GEL CHP精细填料柱体积的1～2倍/小时，脱酶滤过液泵入后，分别收集荷载糖基化橙皮苷的MCI GEL CHP精细填料柱和过柱流出液，对收集的过柱流出液，为质量百分浓度为0.1～0.4％的氯化钠水溶液，用于下批次活化MCI GEL CHP精细填料柱；对收集的荷载糖基化橙皮苷的MCI GEL CHP精细填料柱，泵入质量百分浓度为0.1～0.4％的氯化钠水溶液，泵入该氯化钠水溶液的体积为该树脂柱体积的2～5倍，泵入该氯化钠水溶液的流速为该树脂柱体积的1～2倍/小时，分别收集有260～300nm紫外吸收的洗脱流出液、无260～300nm紫外吸收的洗脱流出液以及脱附糖基化橙皮苷和β-低聚葡萄糖的MCI GEL CHP精细填料柱，对收集的脱附糖基化橙皮苷和β-低聚葡萄糖的MCI GEL CHP精细填料柱，用1～2倍该树脂柱体积的质量百分浓度为0.1～0.4％的氯化钠水溶液平衡后可再次用于下批次制备糖基化橙皮苷精细分离液；对收集的有260～300nm紫外吸收的洗脱流出液，为糖基化橙皮苷精细分离液，用于下步制备糖基化橙皮苷冻干粉；对收集的无260～300nm紫外吸收的洗脱流出液，含β-低聚葡萄糖，用于制备β-低聚葡萄糖水溶性膳食纤维粉；
(6)制备糖基化橙皮苷冻干粉
第(5)步完成后，将第(5)步收集的糖基化橙皮苷精细分离液泵入截留分子量为200～600Da的纳滤器中，在表压为0.5～0.8MPa的压力下进行第一次纳滤，直至第一次纳滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶5～8时停止第一次纳滤，分别收集第一次纳滤的滤过液和截留液，对收集的第一次纳滤的截留液，向其中加入其体积3～6倍的纯净水溶液，再次进行第二次纳滤，第二次纳滤所用纳滤膜的截留分子量及纳滤压力均与第一次纳滤相同，直至第二次纳滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶8～9时停止第二次纳滤，分别收集第二次纳滤的滤过液和截留液，对收集的第二次纳滤的滤过液，与第一次纳滤的滤过液进行合并，泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的第二次纳滤的截留液，先送入低温冰箱于-40～-30℃下进行预冻16～24h，再送入冷冻干燥机中，在表压为20～50Pa、温度为-50～-40℃下进行冷冻干燥30～36h，即制备出纯度高达98～99％、总收得率高达90～95％的糖基化橙皮苷冻干粉；
(7)制备β-低聚葡萄糖水溶性膳食纤维粉
第(5)步完成后，将第(5)步收集的无260～300nm紫外吸收的洗脱流出液泵入截留分子量为600～1000Da的纳滤器中，在表压为0.5～0.8MPa的压力下进行第一次纳滤，直至第一次纳滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶5～8时停止第一次纳滤，分别收集第一次纳滤的滤过液和截留液，对收集的第一次纳滤的截留液，向其中加入其体积3～6倍的纯净水溶液，再次进行第二次纳滤，第二次纳滤所用纳滤膜的截留分子量及纳滤压力均与第一次纳滤相同，直至第二次纳滤截留液与滤过液的体积比(L/L)为1∶8～9时停止第二次纳滤，分别收集第二次纳滤的滤过液和截留液，对收集的第二次纳滤的滤过液，与第一次纳滤的滤过液进行合并，泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的第二次纳滤的截留液，送入喷雾干燥机进行喷雾干燥，喷雾干燥的条件为：进风温度为150～180℃、出风温度为85～95℃、喷雾离心机转速为5000～8000r/min，即制备出纯度高达90～95％、总收得率高达92～95％的β-低聚葡萄糖水溶性膳食纤维粉。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |