CN106478836A - 一种枸杞多糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枸杞多糖制备新方法，属化学工程技术领域。本发明的特征在于利用亚临界萃取、低温提取、管式离心、膜过滤及喷雾干燥等集成技术制备枸杞多糖，整个工艺过程包括枸杞子清洗→粉碎过筛→亚临界萃取→剪切破壁→低温提取→离心除渣→膜浓缩→醇沉→干燥。还可以根据需要，对枸杞多糖进行纯化，从而满足不同的需求。此方法高效节能、环保便捷、极易工业化，运行成本低。制备的枸杞多糖纯度高(＞50％)，活性结构完整，理化性质稳定。

Description

一种枸杞多糖的制备方法

技术领域

本发明属于化合物提取制备技术领域，具体涉及一种枸杞多糖的制备方法。

背景技术

枸杞子是茄科植物枸杞(Lycium barbartum L.)的干燥成熟果实，为我国传统名贵中药材，同时又是国家卫生部第一批列为药食同源品种之一，在我国已有2000多年的食用历史，也是享誉海内外的滋补食疗珍品。其味甘，性平，有滋补肝肾，益精明目的功效和调节机体免疫力、延缓衰老、抗脂肪肝等功能，被历版《中国药典》收载。现代医学、营养学和药理学研究发现枸杞子中含有人体所需的多糖、氨基酸、维生素、微量元素等，被广泛用于抗衰老、抗肿瘤、及抗心血管疾病等，具有极高的药用价值和营养价值。

枸杞多糖(LBP)是枸杞子的主要活性成分之一，占干果的5％～8％。枸杞多糖是一种水溶性蛋白多糖，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖和鼠李糖6种单糖组成。已经被研究证实具有抗衰老、提高免疫力、降血脂、抗脂肪肝等功效。随着人们对枸杞多糖食用、药用价值重视程度的提高，枸杞多糖的提取方法也成为近年来研究的热点。据文献调研，目前常见的枸杞多糖的提取方法主要包括传统水煎法、超声波法、微波法、酶解法等。其中传统水煎法虽然工艺简单，易于操作，但是其提取效率低，并且过高的温度容易破坏或分解多糖的结构，降低多糖的生活活性；超声提取法虽然提高了提取效率，缩短了提取时间，保护了多糖的活性结构，但是杂质和多糖会被一起提出，使其纯度和品质下降，并且超声提取需要较大的超声功率，生产成本偏高；微波提取法具有节能高效，便利环保等优点，但是由于其微波对人体有伤害，微波泄漏频发等问题，限制了其在天然物质有效成分提取方面的广泛引用；酶解法具有提取率高，提取时间短等优点，但是酶解会导致将木质素等物质分解成糖类，是枸杞多糖的含量出现假阳性升高现象，并且在提取后期要高温灭酶，致使枸杞多糖的活性结构分解或破坏，降低枸杞多糖的生物活性和品质。

发明内容

本发明的目的是提供一种枸杞多糖的制备方法，本发明的方法制备的枸杞多糖纯度高，活性结构完整，理化性质稳定，从而弥补现有技术的缺陷和不足。

本发明的制备方法，具体包括如下步骤：

1)将枸杞子粉碎后过筛，加入有机溶剂后进行亚临界萃取，获得枸杞脂溶性成分和枸杞子渣；

所述的有机溶剂为丙烷、丁烷或二甲醚；

作为实施例的一种具体记载，所述的亚临界萃取条件如下：枸杞子和萃取剂比例为：1:3～5(重量体积比g:ml)，充氮气10～20min后，萃取压力5～20MPa，萃取时间10～60min；

2)将上述枸杞子渣加入去离子水，用高速剪切机进行剪切获得枸杞子浸泡液；

3)将步骤2)剪切的枸杞子浸泡液加入去离子水后再次进行提取一次或以上；将提取液离心后获得提取液Ⅰ；

4)将步骤3)获得的提取液Ⅰ通过微滤膜系统，收集透过微滤膜的提取液，得提取液Ⅱ；

5)将提取液Ⅱ通过超滤膜系统进行浓缩，收集超滤膜截留的提取液，得提取液Ⅲ；

6)提取液Ⅲ进行浓缩后，加入乙醇进行静止沉淀；

7)沉淀物加入70％～90％的乙醇洗涤，干燥得到枸杞多糖。

作为实施例中的一种具体操作，步骤4)所述的微滤膜系统中微滤膜分子量为30万及其以上，压力为1～10bar，温度为25～50℃。

上述步骤5)所述的超滤膜分子量为180～3000，压力5～30bar，温度25～50℃。

上述步骤7)所述的干燥为冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥、鼓风干燥中的一种。

所述喷雾干燥的最优条件为：进风温度：120～180℃，出风温度：80～120℃，料液密度0.9～1.1。

所述冷冻干燥的最优条件为：冷冻温度-60℃～-80℃，固形物60％～80％。

上述步骤7)制备的枸杞多糖，选用大孔吸附树脂系统(MAR系统)进一步纯化；

所述的MAR系统中包含有2～4根MAR柱；每根MAR柱之间即可串联也可并联，其中至少有2根MAR柱串联，MAR柱径高比为1:4～1:12；；流速为2～10BV/HR(柱体积，简称BV)，收集吸附残液；吸附结束后，用10～30BV的纯化水进行洗脱，流速为5～10BV/HR，收集洗脱液，将洗脱液和吸附残液合并，超滤膜浓缩、干燥后得到枸杞多糖；

MAR柱使用的树脂为NKA-9、DA201、X-5、NKA、ADS-7、S-8、XDA-1、AB-8、HPD-100、HPD-600、XDA-8、D101、LX-68、LX-68B中一种或几种。

优选的混合树脂比例为：XDA-8:AB-8:D101的质量比为2:2:5。

所述的灭菌方式包括Co-60辐射灭菌、紫外照射灭菌、电子束灭菌中的一种或者几种，灭菌时间为10～20min。

本发明具有以下显著优点：

1)本发明应用了高速剪切技术辅助提取枸杞多糖，高速剪切破除了枸杞表面的蜡质层和细胞壁，使枸杞多糖最大程度得释放出来，极大地提高了枸杞多糖的提取率，同时明显缩短了提取时间，节约能源。

2)本发明全程所有步骤均在低温(60℃以下)下进行，最大程度保留了枸杞多糖的活性结构和热敏性有效成分，使得枸杞多糖的品质提高。

3)本发明使用了超滤膜系统对枸杞提取液进行浓缩，除去了水溶性黄酮苷、色素、寡糖以及小分子多糖，使单位质量中活性大分子枸杞多糖的含量增加，保证了枸杞多糖的生物活性。

4)本发明使用大孔吸附树脂的方法，不仅解决了枸杞多糖粘性大的问题，还提高了枸杞多糖的纯度。

具体实施方式

以下为本发明的实施例，对本发明的上述内容做进一步的详细说明。但不应该就此理解为本发明上述主体的范围仅限于以下的实施例。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。

本发明的枸杞多糖含量测定方法如下：

1.标准曲线的绘制

精密称取105℃干燥恒重的标准葡萄糖0.1g(精确到0.0001g)，加水溶解并定容至1000mL即得。精密吸取此标准溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分置于具塞试管中，各加蒸馏水使体积为2.0mL，再各加苯酚液1.0mL，摇匀，迅速滴加硫酸5.0mL，摇匀后放置5min，置沸水浴中加热15min，取出冷却至室温；另以蒸馏水2mL，加苯酚和硫酸，同上操作为空白对照。于490nm处测定吸光度，绘制标准曲线。

2.试样的测定

准确吸取待测液一定量(视待测液含量而定)，加蒸馏水至2mL，以下操作按标准曲线绘制下的方法测定吸光度，根据标准曲线查出显色液中葡萄糖含量。

3.测定结果的计算

式中：ρ——显色液中葡萄糖的含量，μg；

f——3.19葡萄糖换算多糖的换算因素，

m——试样质量，g；

V——吸取待测液的体积，mL。

4.重复性

每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为测定结果，允许相对偏差为5％

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：

1)将5公斤枸杞子依次用自来水、纯净水清洗，干燥后粉碎，过15目筛。

2)将粉碎过筛的枸杞子加入亚临界提取装置中，再加入25m³的丁烷。充氮气10min后，进行亚临界萃取。萃取压力5MPa，萃取时间30min。脱溶剂，收集枸杞脂溶性成分和枸杞子渣。

3)将上述枸杞子渣，加入5倍去离子水，用高速剪切机剪切30min获得枸杞子浸泡液，剪切的转速为10000rpm；

4)将上述经剪切的枸杞子浸泡液转移到提取罐，再加入7倍体积的去离子水提取2h，提取温度60℃；第2次提取加入10倍量的去离子水。提取结束后用管式离心机离心，离心转速为16000rpm。2次提取后合并得到提取液Ⅰ；

5)将上述提取液Ⅰ通过分子量为100万的微滤膜系统，过膜温度50℃，压力为2bar。收集透过微滤膜的提取液，得提取液Ⅱ；

6)将上述提取液Ⅱ通过分子量为1000的超滤膜系统进行浓缩，过滤温度30℃，压力为10bar。收集超滤膜截留的提取液，得提取液Ⅲ；

7)将提取液Ⅲ继续减压浓缩，温度小于60℃。当浓缩至体积为枸杞子原料质量的2.5倍时，将其置于醇沉罐。一边搅拌一边加入乙醇，使其乙醇的浓度达到75％后，继续搅拌30min。静止8h；

8)分离并回收上清液，沉淀物鼓风干燥12h，干燥温度65℃。得棕色枸杞多糖。

上述产品用苯酚硫酸法进行含量测定，枸杞多糖的含量为50％。

实施例2：

1)将40公斤枸杞子粉碎，加入亚临界提取装置中，再将丁烷持续反复通入亚临界装置中进行萃取。整个萃取过程中压力为5～10MPa，萃取时间60min。脱溶剂，收集枸杞脂溶性成分和枸杞子渣。

2)将上述枸杞子渣，加入5倍去离子水，用高速剪切机剪切30min获得枸杞子浸泡液，剪切的转速为10000rpm；

3)将上述经剪切的枸杞子浸泡液转移到超声逆流循环提取罐中，再加入7倍体积的去离子水提取1h，提取温度60℃，超声功率1200W，循环转速150rpm；第2次提取加入10倍量的去离子水。提取结束后用管式离心机离心，离心转速为16000rpm。2次提取后合并得到提取液Ⅰ；

4)将上述提取液Ⅰ通过分子量为100万的微滤膜系统，过膜温度50℃，压力为2bar。收集透过微滤膜的提取液，得提取液Ⅱ；

5)将上述提取液Ⅱ通过分子量为1000的超滤膜系统进行浓缩，过滤温度30℃，压力为10bar。收集超滤膜截留的提取液，得提取液Ⅲ；

6)将提取液Ⅲ继续减压浓缩，温度小于60℃。当浓缩至体积为枸杞子原料质量的3倍时，将其置于醇沉罐。一边搅拌一边加入乙醇，使其乙醇的浓度达到75％后，继续搅拌30min。静止8h；

7)分离并回收上清液，沉淀物加入去离子水，使其固形物含量在75％，冷冻干燥12h，冷冻干燥温度为-70℃。得米白色枸杞多糖。

上述产品用苯酚硫酸法进行含量测定，枸杞多糖的含量为60％。

实施例3：

1)将清洗过的20公斤枸杞子干燥，使其含水量小于10％。粉碎过15目筛后置于亚临界提取装置中，再将二甲醚持续反复通入亚临界装置中进行萃取。整个萃取过程中压力为5MPa，萃取时间60min。脱溶剂，收集枸杞脂溶性成分和枸杞子渣。

2)将枸杞渣加入12倍去离子水，用高速剪切机剪切45min，剪切转速为10000rpm；

3)剪切结束后将枸杞水混合液转移到提取罐，再加入7倍体积的去离子水提取2h，提取温度60℃；第2次提取加入10倍量的去离子水。提取结束后用三足式离心和管式离心机偶联系统进行离心，离心转速为16000rpm。2次提取后合并得到提取液Ⅰ；

4)将提取液Ⅰ通过孔径为1mm的微滤膜系统，过膜温度50℃，压力为2～3bar。

5)将透过微滤膜的提取液再用5nm的超滤膜系统进行浓缩，过滤温度35～40℃，压力为15～20bar。收集超滤膜截留的提取液，将得到的提取继续减压浓缩，浓缩温度不超过60℃。当浓缩至体积为枸杞子原料质量的3倍时，将其置于醇沉罐。一边搅拌一边加入乙醇，使其乙醇的浓度达到80％后，继续搅拌30min。静止8h；

6)分离并回收上清液，将沉淀物加入5L80％的乙醇中，搅拌60min，静置6h后分离回收上清液。将沉淀物溶于5L温度为50℃的去离子水，趁热过滤。滤液喷雾干燥得米白色枸杞多糖，进风温度为140℃，出风温度为120℃。

上述产品用苯酚硫酸法进行含量测定，枸杞多糖的含量为68％。

实施例4：

将实施例2中醇沉后得到的枸杞多糖溶解在去离子水中，配成50％的多糖溶液，体积为1BV(柱体积，简称BV)。称取10kg D101树脂，湿法串联装入2根内径15cm、柱高150cm的不锈钢柱子。上样流速为2BV/HR，收集吸附残液；吸附结束后，用10BV的纯化水进行洗脱，流速为5BV/HR，收集洗脱液，将洗脱液和吸附残液合并，减压浓缩，温度60℃，喷雾干燥后得到米白色枸杞多糖；喷雾干燥的进风温度为150℃，出风温度为125℃。

树脂的再生采用乙醇梯度洗脱，流速为10BV/HR，乙醇浓度为30～90％，然后再用去离子水冲洗，流速为20BV/HR。

上述产品用苯酚硫酸法进行含量测定，枸杞多糖的含量为70％。

实施例5：

1)将实施例2中醇沉后得到的枸杞多糖溶解在去离子水中，配成35％的多糖溶液，体积为2BV(柱体积，简称BV)。

2)分别称取2kg XDA-8，2kg AB-8和5kg D101树脂，湿法并联装入2根内径15cm、柱高150cm的不锈钢柱子。从罐底进水，控制流速约2-4BV/HR，从顶部开始排液后持续约1hr。反洗结束后，关闭进水阀，静止0.5h，待树脂落下方可进行正洗，从罐顶进水，流速约4-6BV/HR，从罐底排出，持续1hr时正洗结束。

3)用等于3倍树脂体积的4％NaOH的溶液，以1.5BV/h的流速通过树脂层，全部通入后，将液面放至树脂层上20cm处保留溶液3小时，然后用去离子水冲洗至pH 8为止。

4)用3倍树脂体积的4％的HCl溶液，按上述通过NaOH的方法通入，然后去离子水冲洗，直到出水pH 7即可。

5)用95％以上的乙醇浸泡3h，后用2BV的量以1BV/hr的速度过柱(如有气泡产生，须赶出气泡)，至流出液在试管中用水一倍稀释不浑浊时为止。最后用水以1BV/hr的速度淋洗2hr，洗涤至乙醇含量小于1％或无明显乙醇气味后即可用于生产。

6)步骤1)配好的多糖溶液，用泵泵入树脂柱，上样流速为2BV/h，收集吸附残液；吸附结束后，用15BV的去离子水进行洗脱，流速为5BV/h，收集洗脱液，将洗脱液和吸附残液合并，减压浓缩，温度60℃，喷雾干燥后得到白色枸杞多糖；喷雾干燥的进风温度为150℃，出风温度为125℃。

树脂的再生采用乙醇梯度洗脱，流速为10BV/h，乙醇浓度为30～90％，然后再用去离子水冲洗，流速为20BV/h。

上述产品用苯酚硫酸法进行含量测定，枸杞多糖的含量为78％。

上述结果表明经过混合树脂纯化的枸杞多糖含量比单一树脂或二次醇沉纯化的枸杞多糖含量高，主要是因为枸杞提取液中脂溶性的物质极性宽，用混合树脂可以将不同极性的脂溶性成分更加完全的吸附，从而提高了多糖的纯度。

Claims (9)

1.一种枸杞多糖的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

1)将枸杞子粉碎后过筛，加入有机溶剂后进行亚临界萃取，获得枸杞脂溶性成分和枸杞子渣；

2)将上述枸杞子渣加入去离子水，用高速剪切机进行剪切获得枸杞子浸泡液；

3)将步骤2)剪切的枸杞子浸泡液加入去离子水后再次进行提取一次或以上；将提取液离心后获得提取液Ⅰ；

4)将步骤3)获得的提取液Ⅰ通过微滤膜系统，收集透过微滤膜的提取液，得提取液Ⅱ；

5)将提取液Ⅱ通过超滤膜系统进行浓缩，收集超滤膜截留的提取液，得提取液Ⅲ；

6)提取液Ⅲ进行浓缩后，加入乙醇进行静止沉淀；

7)沉淀物加入70％～90％的乙醇洗涤，干燥得到枸杞多糖。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的亚临界萃取条件如下：枸杞子和萃取剂的重量体积比为：1:3～5，充氮气10～20min后，萃取压力5～20MPa，萃取时间10～60min。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中的有机溶剂为丙烷、丁烷或二甲醚。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤4)中的微滤膜系统中微滤膜分子量为30万或以上，压力为1～10bar，温度为25～50℃。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤5)中的超滤膜分子量为180～3000，压力5～30bar，温度25～50℃。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤7)中的干燥为冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥、鼓风干燥中的一种。

7.一种枸杞多糖的纯化方法，其中枸杞多糖是使用权利要求1-6任一项所述的方法提取的；其特征在于，选用大孔吸附树脂系统MAR系统对枸杞多糖进行纯化；

所述的MAR系统中包含有2～4根MAR柱；每根MAR柱之间即可串联也可并联，其中至少有2根MAR柱串联，MAR柱径高比为1:4～1:12；；流速为2～10BV/HR，收集吸附残液；吸附结束后，用10～30BV的纯化水进行洗脱，流速为5～10BV/HR，收集洗脱液，将洗脱液和吸附残液合并，超滤膜浓缩、干燥后得到枸杞多糖。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，其中MAR柱使用的树脂为NKA-9、DA201、X-5、NKA、ADS-7、S-8、XDA-1、AB-8、HPD-100、HPD-600、XDA-8、D101、LX-68、LX-68B中一种或几种。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，其中的树脂为XDA-8、AB-8和D101，的质量比为2:2:5。