CN101255200B - 以大蒜为原料生产大蒜多糖和蒜氨酸酶的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明以新鲜大蒜为原料，通过洗涤、去杂、破碎取汁、过滤、调节汁液pH值，离心得到粗蒜氨酸酶，再经溶解、超滤、冷冻干燥获得高纯度的蒜氨酸酶产品；离心后的上清液过阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱得大蒜多糖精制液，再经过浓缩、气流干燥等工序得到高纯度的大蒜多糖产品。本发明利用同一批原料生产蒜氨酸酶、大蒜多糖两种有价值的活性物质，大大提高了大蒜资源的利用率，减轻了生产单一产品时造成的环境污染，降低了制造成本，可使采用本发明技术的生产企业比单独生产大蒜多糖或蒜氨酸酶的效益成倍增长。
Description
技术领域
本发明属于天然产物的提取、分离和纯化领域，特别涉及到一种以鲜大蒜为原料联合制备蒜氨酸酶与大蒜多糖的方法。
背景技术
大蒜(Allium sativum L.)多糖占大蒜干物质的70％-80％，是大蒜含量最高的成分，属于果聚多糖。CN1239719A报道大蒜多糖的分子量为3500，含量为80％的杂果聚糖，有希望代替珍贵的牛膝多糖用于医药。现已研究证实了果聚多糖具有控制血脂、降低血糖、促进矿物质吸收、增殖肠道双歧杆菌、防便秘及治疗肥胖症等多种生理功能。最近还研究证实大蒜多糖具有保肝护肝作用，对实验性小鼠病毒心肌炎有治疗作用。因此，为发挥大蒜多糖的保健、药用价值，有必要对其工业化生产进行研究。CN1555728、CN1556102报道了联产大蒜精油和大蒜多糖、联产蒜氨酸和大蒜多糖方面的专利，但在这些生产技术中均未提到如何利用其中的重要生物活性物质蒜氨酸酶，在这些生产技术中，均将其作为杂质或废弃物丢掉了。
蒜氨酸酶是一种糖蛋白，有二聚体，三聚体，四聚体等形式。它能催化大蒜的蒜氨酸生成具有多种药用和保健作用的大蒜素(烯丙基二硫亚砜)。研究表明：蒜氨酸酶对A549人肺腺癌和P388小鼠白血病有体外抗肿瘤活性，有抗血小板凝聚作用。鉴于蒜氨酸酶的重要作用，可以利用蒜氨酸和蒜氨酸酶生产治疗肿瘤的复合胶囊或注射针剂；也可以利用蒜氨酸酶生产能够检测大蒜及其制品中的蒜氨酸含量的新一代生物传感器；以色列魏茨曼研究所科学家利用蒜氨酸酶和蒜氨酸治疗癌症；蒜氨酸酶又称C-S键裂解酶，有多种底物如S-甲基、S-乙基、S-丙基、S-丁基和S-烯丙基半胱氨酸亚砜都可作该酶的底物，S-烯丙基半胱氨酸亚砜即蒜氨酸酶是天然底物之一。由于蒜氨酸酶对C-S键裂解的高度专一型和高活力，有望在相关的化学反应或生化反应中发挥巨大的作用。
虽然蒜氨酸酶具有很大的现实和潜在的利用价值，但是目前还没有工业化生产蒜氨酸酶方面的报道。
发明内容
本发明旨在提供一种生产工艺，用同一批原料，同时生产蒜氨酸酶和大蒜多糖两种产品，以充分利用大蒜资源，尽可能多的提取大蒜中具有生物活性或保健作用的天然产物，以满足医药和保健品行业对蒜氨酸酶和大蒜多糖需求，提高大蒜原料的利用率。
为达上述目的，本发明的以大蒜为原料生产大蒜多糖和蒜氨酸酶的生产工艺，包括如下步骤：
A、预处理：将大蒜用水浸泡，洗去杂质，除去蒜皮；用打浆机将去皮大蒜破碎得蒜浆液，过滤除去杂质，滤渣用水洗涤，合并滤液得大蒜汁液；
B、分离蒜氨酸酶：向上述大蒜汁液中加入酸溶液，并搅拌，使其pH降至3～5，离心，得到的沉淀即为蒜氨酸酶粗品；将蒜氨酸酶粗品用磷酸盐缓冲溶液溶解，采用截留分子量为3～6万道尔顿的超滤设备超滤，除去小分子杂质，将截留液冷冻干燥后，即得到精制的蒜氨酸酶产品；
C、制取大蒜多糖提取液：将步骤B中离心后的上清液分别通过阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱，或者直接将阴、阳离子交换树脂分别加入到大蒜粗提液中，分离出阴、阳离子交换树脂后得大蒜多糖提取液，调节所得大蒜多糖提取液的pH至中性，经活性炭吸附后得到精制的大蒜多糖提取液；
D、大蒜多糖产品的获得：在温度为60～80℃的真空条件下，将大蒜多糖精制液浓缩、干燥，得到白色的大蒜多糖产品。
所述步骤A中，用打浆机将所述去皮大蒜破碎成粒度60～300目的蒜浆液。
所述步骤B中，所述的酸为食用酸，以逐滴加入的形式加入到所述大蒜粗提液中。所述酸优选食用级盐酸、醋酸、磷酸、柠檬酸或乳酸等。
所述步骤B中，磷酸盐缓冲溶液是pH为6.0～8.0的磷酸盐缓冲溶液。
所述步骤C中，当将所述上清液过阳离子交换树脂柱，控制流速为0.5～10mL/min·100克树脂，样品上样后立即收取流出液，然后再将收取的流出液通过阴离子交换树脂柱脱色，控制流速为0.5～10mL/min·100克树脂，再用去离子水洗脱2～3个色谱柱体积，收集流出液和洗脱液，调节其pH至中性，再通过活性炭吸附柱，或者用0.1～0.2％活性炭吸附20～24小时后，得到精制的大蒜多糖溶液。
所述步骤C中，当直接将阴、阳离子交换树脂先后加入到大蒜粗提液中时，每公斤上清液先后分别添加100～600克阳离子交换树脂和100～600克阴离子交换树脂，并分别在25～200rpm的转速下吸附0.5～5小时。
所述步骤D中，采用喷雾干燥或烘房干燥得到大蒜多糖产品。
采用本发明的生产工艺所得产品性质的测定：
一、大蒜多糖的提取率测定
参考专利文献：CN1555728
二、蒜氨酸酶活性测定
酶活性测定采用测丙酮酸法：
取蒜氨酸溶液1ml，加入1ml酶液，在25ml具塞试管中反应3min后立即加入2ml 10％三氯乙酸终止反应，加入1ml 2，4-二硝基苯肼，25℃保温5min，然后加入5ml 2.5mol/L NaOH，反应10min后于520nm比色(以钝化酶、底物、2，4-二硝基苯肼、NaOH反应体系为参比液)。
酶活性定义：以在25℃条件下，每分钟产生1μmol丙酮酸为1个活力单位(U)。定义为一个酶活单位)
经测定，采用本发明的生产工艺所获得蒜氨酸酶的比活为：72U/mg；活力回收62％。
本发明最大优点之一是利用同一批原料生产蒜氨酸酶和大蒜多糖两种有价值的产品，目前未见有这两种物质综合提取的研究报道，与过去利用大蒜原料只生产大蒜精油(如CN1049272A)或只生产大蒜多糖(CN1239719A，JP10158306A)相比，充分地利用了大蒜资源；这在一定程度上降低了生产成本，减轻了生产单一产品时造成的环境污染，可使生产企业比单独生产大蒜多糖的效益翻番。同联合制备大蒜精油与大蒜多糖的方法(CN1555728)和联合制备蒜氨酸与大蒜多糖的方法(CN1556102)等已有的关于大蒜联合提取有效成分方面的专利相比，本技术路线首次提出了联合提取蒜氨酸酶和大蒜多糖的方法，因此，本发明具有极高的生产应用价值，填补了蒜氨酸酶工业化提取上的空白。
其次，本发明的蒜氨酸酶的提取方法，只是通过改变pH值和离心的方法便可以得到蒜氨酸酶的粗成品，方法简单，酶活力回收高，回收率达到62％，可应用于工业化生产。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。
实施例1：
以新鲜大蒜为原料，联合制备蒜氨酸酶与大蒜多糖的方法，具体按下述步骤进行：
第一步进行预处理：将鲜蒜瓣置于质量约为其6倍的饮用水中，浸泡2小时，流动水洗涤去皮，控干明水，置于打浆机中破碎成粒度200目的蒜浆。蒜浆用板式过滤机挤压过滤。滤渣用水洗涤2～3次，合并滤液，取滤液备用。
第二步分离蒜氨酸酶：向所得蒜提取液中逐滴加入食用级盐酸，并快速搅拌，使提取液的pH降为3.0，离心，得到的沉淀用pH为6的磷酸盐缓冲溶液溶解，采用截留分子量为3～6万道尔顿的各种超滤膜超滤，将截留液冷冻干燥后，即得到精制的蒜氨酸酶产品。
第三步大蒜多糖粗提液的精制：将第二步中离心后的上清液过732型阳离子交换树脂；控制流速为1ml/min·100克树脂，样品上样后立即收取流出液，然后将其快速通过阴离子交换树脂，控制流速为1ml/min·100克树脂，再用无离子水洗脱2～3个色谱柱体积，收集流出液和洗脱液，混合，加入适量的NaHCO3溶液，调节其pH为中性，再用0.1～0.2％活性炭吸附20～24小时后，得到精制的大蒜多糖溶液。
第四步获得大蒜多糖产品：在真空条件(温度60℃)下，将精制大蒜多糖溶液浓缩至多糖含量在35％，再进行喷雾干燥，得白色粉状的大蒜多糖。采用的喷雾压力为0.25MPa，进入喷雾塔的热空气温度为160℃，出口温度为90℃，所得干粉即为大蒜多糖。
实施例2：
以新鲜大蒜为原料，联合制备蒜氨酸酶与大蒜多糖的方法，具体按下述步骤进行：
第一步进行预处理：将鲜蒜瓣置于质量约为其4倍的饮用水中，浸泡2小时，流动水洗涤去皮，控干明水，置于打浆机上破碎成粒度300目的蒜浆。蒜浆用板式过滤机挤压过滤。滤渣用水洗涤2～3次，合并滤液，取滤液备用。
第二步分离蒜氨酸酶：向所得蒜提取液中逐滴加入磷酸，并快速搅拌，使提取液的pH降为5.0，离心，得到的沉淀用pH为6的磷酸盐缓冲溶液溶解，采用截留分子量为3～6万道尔顿的各种超滤膜超滤，将截留液冷冻干燥后，即得到精制的蒜氨酸酶产品。
第三步大蒜多糖粗提液的精制：将第二步中离心后的上清液过732型阳离子交换树脂；控制流速为5ml/min·100克树脂，样品上样后立即收取流出液，然后将其快速通过阴离子交换树脂脱色，控制流速为5ml/min·100克树脂，再用无离子水洗脱2～3个色谱柱体积，收集流出液和洗脱液，加入适量的NaHCO3溶液，调节其pH为中性，再通过活性炭吸附柱后，得到精制的大蒜多糖溶液。
第四步获得大蒜多糖产品：在真空条件(温度70℃)下，将精制大蒜多糖溶液浓缩至多糖含量在50％，再进行喷雾干燥，得白色粉状的大蒜多糖。采用的喷雾压力为0.25MPa，进入喷雾塔的热空气温度为160℃，出口温度为90℃，所得干粉即为大蒜多糖。
实施例3：
以新鲜大蒜为原料，联合制备蒜氨酸酶与大蒜多糖的方法，具体按下述步骤进行：
第一步进行预处理：将鲜蒜瓣置于质量约为其3倍的饮用水中，浸泡2小时，流动水洗涤去皮，控干明水，置于打浆机上破碎成粒度300目的蒜浆。蒜浆用板式过滤机挤压过滤。滤渣用水洗涤2～3次，合并滤液，取滤液备用。
第二步分离蒜氨酸酶：向蒜提取液中逐滴加入柠檬酸或乳酸，并快速搅拌，使提取液的pH降为4，离心，得到的沉淀用pH为7的磷酸盐缓冲溶液溶解，采用截留分子量为3～6万道尔顿的各种超滤膜超滤，将截留液冷冻干燥后，即得到精制的蒜氨酸酶产品。
第三步大蒜多糖粗提液的精制：将第二步中离心后的上清液过732型阳离子交换树脂；控制流速为10ml/min·100克树脂，样品上样后立即收取流出液，然后将其快速通过阴离子交换树脂脱色，控制流速为10ml/min·100克树脂，再用无离子水洗脱2～3个色谱柱体积，收集流出液和洗脱液，加入适量的NaOH溶液，调节其pH为中性，再通过活性炭吸附柱，或者用0.1～0.2％活性炭吸附20～24小时后，得到精制的大蒜多糖溶液。
第四步获得大蒜多糖产品：在真空条件(温度60℃)下，将精制大蒜多糖溶液浓缩至多糖含量在75％，再进行喷雾干燥，得白色粉状的大蒜多糖。采用的喷雾压力为0.25MPa，进入喷雾塔的热空气温度为160℃，出口温度为90℃，所得干粉即为大蒜多糖。
实施例4：
以新鲜大蒜为原料，联合制备蒜氨酸酶与大蒜多糖的方法，具体按下述步骤进行：
第一步进行预处理：将鲜蒜瓣置于质量约为其4倍的饮用水中，浸泡2小时，流动水洗涤去皮，控干明水，置于打浆机上破碎成粒度300目的蒜浆。蒜浆用板式过滤机挤压过滤。滤渣用水洗涤2～3次，合并滤液，取滤液备用。
第二步分离蒜氨酸酶：向所得蒜提取液中逐滴加入磷酸或醋酸，并快速搅拌，使提取液的pH降为5.0，离心，得到的沉淀用pH为6的磷酸盐缓冲溶液溶解，采用截留分子量为3～6万道尔顿的超滤膜超滤，将截留液冷冻干燥后，即得到精制的蒜氨酸酶产品。
第三步大蒜多糖粗提液的精制：以阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、上清液的体积比为1∶1∶8的比例，将阳离子交换树脂加入到第二步离心后的上清液中；在100rpm的转速下吸附2.5小时，分离出阳离子交换树脂后，再将阴离子交换树脂加入到提取液中，在100rpm的转速下吸附2.5小时，分离出阴离子交换树脂后，调节提取液pH为中性，再通过活性炭吸附柱，或者用0.1～0.2％活性炭吸附20～24小时后，得到精制的大蒜多糖溶液。
第四步获得大蒜多糖产品：在真空条件(温度70℃)下，将精制大蒜多糖溶液浓缩至多糖含量在50％，再进行喷雾干燥，得白色粉状的大蒜多糖。采用的喷雾压力为0.25MPa，进入喷雾塔的热空气温度为160℃，出口温度为90℃，所得干粉即为大蒜多糖。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1. 一种以大蒜为原料生产大蒜多糖和蒜氨酸酶的生产工艺，其特征在于包括如下步骤：
A、预处理：将大蒜用水浸泡，洗去杂质，除去蒜皮；用打浆机将去皮大蒜破碎得蒜浆液，过滤除去杂质，滤渣用水洗涤，合并滤液得大蒜汁液；
B、分离蒜氨酸酶：向上述大蒜汁液中加入酸溶液，并搅拌，使其pH降至3～5，离心，得到的沉淀即为蒜氨酸酶粗品；将蒜氨酸酶粗品用磷酸盐缓冲溶液溶解，采用截留分子量为3～6万道尔顿的超滤设备超滤，除去小分子杂质，将截留液冷冻干燥后，即得到精制的蒜氨酸酶产品；
C、制取大蒜多糖提取液：将步骤B中离心后的上清液分别通过阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱，或者直接将阴、阳离子交换树脂先后加入到大蒜粗提液中，分离出阴、阳离子交换树脂后得大蒜多糖提取液，调节所得大蒜多糖提取液的pH至中性，经活性炭吸附后得到精制的大蒜多糖提取液；
D、大蒜多糖产品的获得：在温度为60～80℃的真空条件下，将大蒜多糖精制液浓缩、干燥，得到白色的大蒜多糖产品。
2. 根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于：所述步骤A中，用打浆机将所述去皮大蒜破碎成粒度60～300目的蒜浆液。
3. 根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于：步骤B中，所述的酸为食用酸，以逐滴加入的形式加入到所述大蒜粗提液中。
4. 根据权利要求3所述的生产工艺，其特征在于：所述酸是指食用级盐酸、醋酸、磷酸、柠檬酸或乳酸。
5. 根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于：步骤B中，所述磷酸盐缓冲溶液是pH为6.0～8.0的磷酸盐缓冲溶液。
6. 根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于：所述步骤C中，将所述上清液过阳离子交换树脂柱，控制流速为0.5～10mL/min·100克树脂，样品上样后立即收取流出液，然后再将收取的流出液通过阴离子交换树脂柱脱色，控制流速为0.5～10mL/min·100克树脂，再用去离子水洗脱2～3个色谱柱体积，收集流出液和洗脱液，调节其pH至中性，再通过活性炭吸附柱，或者用0.1～0.2％活性炭吸附20～24小时后，得到精制的大蒜多糖溶液。
7. 根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于：所述步骤C中，直接将阴、阳离子交换树脂先后加入到大蒜粗提液中时，每公斤上清液先后分别添加100～600克阳离子交换树脂和100～600克阴离子交换树脂，并分别在25～200rpm的转速下吸附0.5～5小时。
8. 根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于：所述步骤D中，采用喷雾干燥或烘房干燥得到大蒜多糖产品。
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110302 Termination date: 20130409 |