CN107177579B - 一种利用蒜片加工废水制备蒜氨酸酶、大蒜辣素和大蒜多糖的方法 - Google Patents
一种利用蒜片加工废水制备蒜氨酸酶、大蒜辣素和大蒜多糖的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用蒜片加工废水制备蒜氨酸酶、大蒜辣素和大蒜多糖的方法。包括如下步骤：(1)蒜片加工废水预冷后用截留分子量为10,000Da的超滤膜进行超滤浓缩，截留液合并即为蒜氨酸酶粗酶液；(2)超滤的滤过液经300Da的纳滤膜纳滤浓缩，纳滤浓缩液用CH2Cl2萃取多次，萃余液用于下一步大蒜多糖的制备，合并CH2Cl2萃取液，减压蒸馏除去CH2Cl2后，即得主要由大蒜辣素组成的油状液体；(3)收集步骤(2)的中得到的CH2Cl2萃余液，经减压浓缩后喷雾干燥，得大蒜多糖提取物。本发明利用蒜片加工废水进行了其中所含的各种生物活性成分的分别提取，获得了三种有价值的产品，实现了蒜片加工废水的资源化利用，解决了蒜片加工过程中的资源浪费与环境污染问题。
Description
技术领域
本发明既属于污水处理、环境治理技术领域，又属于中草药资源的加工利用技术领域，涉及一种利用蒜片加工废水制备蒜氨酸酶、大蒜辣素和大蒜多糖的方法。
背景技术
大蒜(Allium Sativam L,)又名胡蒜、葫，为百合科葱属植物。最早在古埃及、古罗马和古希腊等地中海沿岸国家栽培。公元前100多年，大蒜被引入我国，以后逐渐遍及全国。大蒜既是一种能够治病、防病的植物，也是一种调味佳品。
为便于保藏、方便食用及长距离运输，每年都有高达数百万吨的鲜蒜被加工成蒜片、蒜粒和蒜粉等干制品，形成了一个初具规模的蒜片加工产业，同时，由于在将蒜瓣切成片的过程中，新形成的蒜片会因大量黏液分泌物的存在而粘附在切片机的刀片上无法及时脱落，因而在生产中需要用一定量的工艺用水对切片机的刀片进行连续的冲洗，才能保证切片机的正常运行；蒜片被冲洗后进入储液槽、罐或池中被浸泡，待废水中的蒜片积攒到一定量，由机械臂捞出蒜片，剩余的废水即为蒜片加工废水，构成了一个蒜片加工业所特有的废水污染源-大蒜废水。
大蒜废水的处理，因其中含有大量目前已知为最强力的天然杀菌剂-大蒜辣素(Allicin)而成为一个水处理行业的著名难题，首先需要设法将其中所含的大蒜辣素降解，然后才能排入污水处理系统，而不至于破坏污水处理系统业已建立的厌氧、曝气等生态系统。迄今为止已经研发并投入使用的大蒜废水处理系统多以令大蒜辣素降解而不留任何不良气味为工作原理和目标。但从天然保健资源的开发利用的角度来看，却是十分不合理的。
大蒜辣素(Allicin)学名为二烯丙基硫代亚磺酸酯(diallyl thiosulfinate)，是从百合科葱属植物大蒜(allium sativum)的鳞茎(大蒜头)中提取的一种有机硫化合物，同时也存在于洋葱和其他百合科植物中。新鲜大蒜中并没有大蒜辣素，只含有蒜氨酸(alliin)。当大蒜被切开或粉碎后，大蒜中的内源酶即蒜氨酸酶(Alliinase，EC4.4.1.4)被激活，催化蒜氨酸分解合成为大蒜辣素。大蒜辣素具有多种生理功能，如抗病原微生物、抗氧化、抗肿瘤、降血压、降血脂、降血糖、抗血小板聚集、护肝等。目前，大蒜辣素被广泛应用于食品和医药等领域。蒜氨酸酶对大蒜辣素的形成起着至关重要的作用。
大蒜多糖是类菊粉左旋糖，一种由果糖(97％)和葡萄糖(约3％)组成的、6-位有支链的菊糖型β-D-果聚糖。其聚合度(dp)平均为15，分子量为3500Da，范围为2000至6000Da，属于低聚果糖(Fructooliosaccharide，FOS)。FOS被FDA认定为安全级的功能性甜味剂，也是符合益生元标准(即双歧杆菌促生素)的典型双歧因子，具有双向调节肠内菌群、降血脂、保护肝脏、促进维生素合成、促进Ca、Mg、Fe等矿物质吸收、防止肥胖和美容作用，是近10年来国际市场上广泛应用的功能性食品配料，被誉为集“营养、保健、疗效”三者于一体的21世纪健康新糖源。
如能将蒜片加工废水作为资源加以利用，从中分离提取出蒜氨酸酶、大蒜多糖和大蒜辣素等各种营养保健因子，则既可实现资源的充分合理利用，又可将蒜片加工废水消弭于无形，达到变废为宝、以资源化利用的方式消除环境污染的目的，这无论是对于经济发展，还是对于环境治理，都无疑是具有十分重要的意义的。但迄今尚未见有这种技术的发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用蒜片加工废水制备蒜氨酸酶、大蒜辣素和大蒜多糖的方法。
本发明发现蒜片加工废水中蒜氨酸酶的分子量远远大于大蒜辣素和大蒜多糖，通过选择合适孔径的超滤膜可以有效的截留住蒜氨酸酶。其次，大蒜辣素与CH2Cl2互溶，可以通过萃取工艺将大蒜辣素和大蒜多糖分离开，由此奠定了从蒜汁中提取蒜氨酸酶，大蒜辣素，大蒜多糖的基础。
本发明的目的可通过以下方法实现：
一种利用蒜片加工废水制备蒜氨酸酶、大蒜辣素和大蒜多糖的方法，包括如下步骤：
(1)蒜片加工废水预冷后用截留分子量为10,000Da的超滤膜进行超滤浓缩，截留液合并即为蒜氨酸酶粗酶液；
(2)超滤的滤过液经300Da的纳滤膜纳滤浓缩，纳滤浓缩液用CH2Cl2萃取多次，萃余液用于下一步大蒜多糖的制备，合并CH2Cl2萃取液，减压蒸馏除去CH2Cl2后，即得主要由大蒜辣素组成的油状液体；
(3)收集步骤(2)的中得到的CH2Cl2萃余液，经减压浓缩后喷雾干燥，得大蒜多糖提取物。
本发明所述的蒜片加工废水系指蒜瓣切片过程中因冲洗刀片而产生的工艺废水，蒜片脱水甩干时产生的废水，或两者的混合物。
作为本发明的一种优选，步骤(1)中所述的预冷温度为0-14℃，优选2-4℃。
作为本发明的一种优选，所述的蒜氨酸酶粗酶液于-70℃冻存6-7h后冷冻干燥得蒜氨酸酶粉。
作为本发明的一种优选，步骤(2)所述的超滤的滤过液经300Da的纳滤膜在0.6MPa、30℃条件下纳滤。
作为本发明的一种优选，步骤(2)所述的减压蒸馏的温度为18-25℃，优选20℃。
作为本发明的一种优选，步骤(3)所述的减压浓缩的温度为55-85℃，优选60℃。
有益效果：
本发明提供了一种利用蒜片加工废水制备蒜氨酸酶、大蒜辣素和大蒜多糖的工艺(图1)。较为独特的是，它将蒜片加工废水作为资源加以利用，对其中所含的各种有效成分进行了分别提取，获得了三种有价值的产品，既消除了蒜片加工废水这一污染源，又实现了资源的充分合理利用，以资源化利用的方式解决了环境污染问题，可使生产企业比仅只加工蒜片的效益翻倍。按照本发明进行操作，能够以极高的提取率获得蒜片加工废水中所含有的蒜氨酸酶、大蒜辣素、大蒜多糖，而不会导致活性成分的丢失或破坏。这无论是对于蒜片加工业实现绿色无污染的清洁化生产，还是对于大蒜资源的综合利用而言，都是至关重要的。
按照本发明方法加工生产得到的蒜氨酸酶、大蒜辣素以及大蒜多糖将作为新型天然药物原料和功能保健饮料原料被广泛应用于药品、保健品等领域。
附图说明
图1：蒜片加工废水中同时提取蒜氨酸酶，大蒜辣素以及大蒜多糖的工艺流程
图2：蒜片加工废水对金黄色葡萄球菌的抑制作用
图3：蒜片加工废水对枯草芽孢杆菌的抑制作用
图4：蒜片加工废水对大肠杆菌的抑制作用
图5：蒜氨酸酶蛋白凝胶电泳
具体实施方式
下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
蒜片加工废水实际上为蒜片的水浸泡液，以下实施例分别以实验室模拟的蒜片加工废水及蒜片加工厂的蒜片加工废水为例，来说明本发明的技术方案。
实施例1
大蒜去皮，称取30g新鲜蒜瓣，切片，用60g去离子水室温(<20℃)浸泡2h(蒜片：去离子水＝1:2)，先用四层纱布过滤得到蒜汁53.59g，取新鲜蒜汁30mL，与已灭菌的LB培养基混合，配成浓度为30％(V/V)的培养基，混合均匀，倒平板，24h后观察金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌的生长情况发现，蒜汁对金黄色葡萄球菌(图2)，大肠杆菌(图3)、枯草芽孢杆菌(图4)均有抑菌作用。
实施例2
取蒜片加工废水30mL，与已灭菌的LB培养基混合，配成浓度为30％(V/V)的培养基，混合均匀，倒平板，24h后观察金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌的生长情况发现，蒜汁对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均有抑菌作用，其效果与实施例1相当。
实施例3
(1)大蒜去皮，称取100g新鲜蒜瓣，切片，用200g去离子水室温(<20℃)浸泡2h(蒜片：去离子水＝1:2)，先用四层纱布过滤得到蒜汁178.64g，在4℃条件下预冷蒜汁，并在10000×g条件离心蒜汁30min，取上清并利用0.45μm滤膜处理蒜汁，进一步去除不溶杂质，通过截留分子量为10000Da的超滤膜进行上清超滤，收集截留液(滤过液收集待用)，2-3次重复操作，浓缩蒜氨酸酶粗酶液，-70℃冻存粗酶液6-7h，后进行冷冻干燥成酶粉。通过SDS-PAGE发现酶粉中含有一条较明显的蛋白的条带(图5)，大小约为55kDa，根据相应文献，蒜氨酸酶单体的大小为53.8kDa。因此，通过超滤的方法成功分离出蒜氨酸酶。
取蒜氨酸溶液1ml，加入1ml酶液，在25ml具塞试管中反应3min后立即加入2ml10％三氯乙酸终止反应，加入1ml 2，4-二硝基苯肼，25℃保温5min，然后加入5ml 2.5mol/LNaOH，反应10min后于520nm比色(以钝化酶、底物、2，4-二硝基苯肼、NaOH反应体系为参比液)。经测定，采用本发明的生产工艺所得的蒜氨酸酶的活力为70U/mg。活力回收65.32％。
(2)通过超滤处理后的透过液，再利用截留分子量为300Da的纳滤膜在0.6MPa、30℃处理去除溶液中的小分子物质，收集纳滤液，重复2-3次，浓缩纳滤液，得到的浓缩液用20ml CH2Cl2萃取，萃取5次，合并CH2Cl2萃取液(萃余液留存待用)，20℃减压蒸馏除去CH2Cl2，得只主要由大蒜辣素组成的油状液体，用薄层色谱定性分析，展开剂为己烷:乙醇＝92:8，硅胶板为GF254，以大蒜辣素标准品为对照，紫外分析仪下观察到样品与对照品在同一位置出现暗斑，Rf值均为0.33。
通过5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)与硫代亚磺酸盐的反应测定该油状液体中大蒜辣素的含量，取0.5mL 1.0mmol/L半胱氨酸溶液，加1.0mmol/L 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液1mL，用50mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.5)稀释至5.0mL，26℃保温15min，412nm波长测定其吸光值A0。取1.0mmol/L半胱氨酸溶液0.5mL，加0.5mL稀释10倍的待测液，26℃保温15min后加1.0mmol/L 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液l mL，用50mmol/LpH7.5的Tris-HCl缓冲溶液稀释至5.0mL，26℃下保温15min，412nm波长测定半胱氨酸吸光值A，大蒜辣素含量计算方法如下：
C(大蒜辣素)(g/L)＝ΔA412×d×162/(2×14150)
ΔA412＝A0-A
式中：d为总稀释倍数；
162为大蒜辣素的摩尔质量(g/mol)；
14150为NTB在412nm处1cm光径摩尔消光系数。
表1.大蒜辣素的含量测定
(3)纳滤液通过连续萃取后，收集萃余液，合并水相，60℃减压蒸馏除去水，再经喷雾干燥得大蒜多糖提取物。取大蒜多糖提取物约25mg，精密称定，置100mL烧瓶中，加入50mL无水乙醇，加热回流60min，放冷后用滤纸过滤，并用少量无水乙醇冲洗烧瓶，滤液也用同一滤纸过滤。滤纸及滤渣挥干乙醇后，置于烧瓶中，精密加入50mL蒸馏水，称重后，加热回流30min，放冷后，称重，用蒸馏水补足质量，过滤，取续滤液5mL，置于50mL量瓶中，蒸馏水定容至刻度，摇匀，精密量取1mL，于10mL具塞试管中，分别加5％苯酚溶液1.0mL，摇匀后加入浓硫酸5.0mL，摇匀后室温放置10min，沸水浴10min，取出置于冰水浴中冷却放置至室温，，以试剂空白为参比在485nm波长处测定吸光度，外标一点法测定样品中多糖含量为90.23％。
实施例4
(1)取生产线上获得的新鲜蒜片加工废水178.64kg，在4℃条件下预冷蒜汁，并在用0.45μm微孔滤膜进行预处理后，通过截留分子量为10000Da的超滤膜进行超滤，收集截留液(滤过液收集待用)，2-3次重复操作，浓缩蒜氨酸酶粗酶液，-70℃冻存粗酶液6-7h，后进行冷冻干燥成酶粉。通过SDS-PAGE发现酶粉中含有一条较明显的蛋白的条带，大小约为55kDa，与实施例3中以模拟蒜片加工废水为原料提取的蒜氨酸酶的蛋白条带一致。
(2)通过超滤处理后的透过液，再利用截留分子量为300Da的纳滤膜在0.6MPa、30℃处理去除溶液中的小分子物质，收集纳滤液，重复2-3次，浓缩纳滤液，得到的浓缩液用200L CH2Cl2萃取，萃取5次，合并CH2Cl2萃取液(萃余液留存待用)，20℃减压蒸馏除去CH2Cl2，得只含有大蒜辣素的液体，用薄层色谱定性分析，展开剂为己烷:乙醇＝92:8，硅胶板为GF254，以大蒜辣素标准品为对照，紫外分析仪下观察到样品与对照品在同一位置出现暗斑，Rf值均为0.33。
通过5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)与硫代亚磺酸盐的反应测定液中大蒜辣素的含量为31g/L。
(3)纳滤液通过连续萃取后，收集萃余液，合并水相，60℃减压蒸馏除去水，再经喷雾干燥得大蒜多糖提取物。按照实施例3中的方法检测样品中多糖含量为88.57％。
Claims (8)
1.一种利用蒜片加工废水制备蒜氨酸酶、大蒜辣素和大蒜多糖的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）蒜片加工废水0-14℃预冷后用截留分子量为10,000 Da的超滤膜进行超滤浓缩，截留液合并即为蒜氨酸酶粗酶液；所述的蒜片加工废水为蒜瓣切片过程中因冲洗刀片而产生的工艺废水、蒜片脱水甩干时产生的废水，或两者的混合物；
（2）超滤的滤过液经300 Da的纳滤膜纳滤浓缩，纳滤浓缩液用CH2Cl2萃取多次，萃余液用于下一步大蒜多糖的制备，合并CH2Cl2萃取液，减压蒸馏除去CH2Cl2后，即得主要由大蒜辣素组成的油状液体；
（3）收集步骤（2）的中得到的CH2Cl2萃余液，经减压浓缩后喷雾干燥，得大蒜多糖提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的预冷温度为2-4℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的蒜氨酸酶粗酶液于-70℃冻存6-7h后冷冻干燥得蒜氨酸酶粉。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）所述的超滤的滤过液经300 Da的纳滤膜在0.6MPa、30℃条件下纳滤。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）所述的减压蒸馏的温度为18-25℃。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤（2）所述的减压蒸馏的温度为20℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）所述的减压浓缩的温度为55-85℃。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤（3）所述的减压浓缩的温度为60℃。
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