CN111171112A - 一种苦瓜籽蛋白的酶解提取方法 - Google Patents
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Abstract
一种苦瓜籽蛋白的酶解提取方法，包括如下步骤：(1)先将苦瓜种子干燥后，再将未剥壳的苦瓜籽粉碎成细粉，过筛，备用；(2)在称取苦瓜籽细粉中加入水，室温下超声波处理，水浴中保温；(3)边加边搅拌，用稀盐酸调pH值；(4)在料液中加入果胶酶、纤维酶，缓慢的搅拌均匀，置于水浴中静置；(5)边加边搅拌，调pH；(6)加入脂肪酶，缓慢的搅拌均匀，水浴中静置；(7)边加边搅拌，将溶液的pH值调至9.5，静置；(8)将混合液离心，取上清液，过滤；(9)边加边搅拌，滤液用盐酸溶液调整pH值，静置；(10)将混合液离心，弃去上清液，取沉淀；(11)将沉淀至半透膜上，洗去盐和杂质；(12)将除杂后的蛋白冻干，即得到苦瓜籽的总蛋白。
Description
技术领域
本发明属于天然活性物质提取技术领域，具体涉及一种苦瓜籽蛋白的酶解提取方法。
背景技术
苦瓜(Momordica charantia L.)为葫芦科苦瓜属一年生攀缘草本植物，苦瓜作为药食同源的植物，具较高的营养价值和食疗功效。近年来，苦瓜种植面积逐渐增加，已成为“南菜北运”的主要蔬菜品种和特色产业。苦瓜籽蛋白是一种天然高分子化合物，富含核糖体失活蛋白，苦瓜素等多种活性成分，具降血糖、抗癌、抗病毒、增强免疫力等保健功能。苦瓜籽是苦瓜精深加工的副产物，是一种应用潜力较大的优质植物蛋白资源。近年来我国对苦瓜籽蛋白方面的研究相对较少，主要集中在其蛋白分子的分离纯化和生物活性等方面，对苦瓜籽蛋白提取工艺的研究鲜见报道。本工艺采用蛋白质等电点沉淀法分离总蛋白质，所得的总蛋白利率为16.68％。与盐析法相比，降低了所需的物料成本，后续工艺节省大量的透析时间；较重金属和丙酮沉-三氯乙酸淀法，能获得非变性的蛋白，有利于保留苦瓜籽蛋白的活性功能。本工艺采用半透膜超滤的方法去除杂质，能缩短时间，有利于保留蛋白的活性。同时，通过冻干法干燥蛋白，最大程度的避免加热对蛋白的破坏，获得疏松易溶解的蛋白粉末。通过酶法提取具有作用条件温和，很少产生毒害物质的优点，利于后续保健食品和药品的开发。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供了一种产品活性高、制备工艺简单、易于工业化生产的苦瓜籽蛋白的制备方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种苦瓜籽蛋白的酶解提取方法，包括如下步骤：
(1)先将苦瓜种子干燥后，再将未剥壳的苦瓜籽粉碎成细粉，过40目筛，备用；
(2)称取苦瓜籽细粉加入10倍量的水，室温下超声波提取装置提取20min后，水浴中保温6h；
(3)边加边搅拌，用稀盐酸(1M)调整pH值到5.5；
(4)在料液中加入果胶酶0.2g，纤维酶1.0g，缓慢的搅拌均匀，置于53℃水浴中静置6h；
(5)边加边搅拌，用氢氧化钠溶液(1M)调整pH值到8.5；
(6)加入脂肪酶1.0g，缓慢的搅拌均匀，45℃水浴中静置12h；
(7)边加边搅拌，将溶液的pH值用氢氧化钠溶液(1M)调至9.5，静置3h；
(8)将pH9.5的混合液离心10min，取上清液，滤纸过滤；
(9)边加边搅拌，滤液用1M的盐酸调整pH值至3.0，静置6h以上；
(10)将pH3.0的混合液离心10min，弃去上清液，取沉淀；
(11)将沉淀至半透膜上，用10倍量的纯水洗去盐和其它杂质；
(12)将除杂后的蛋白用冻干法冻干，得到浅黄色的粉末，即为苦瓜籽的总蛋白。
作为优选，步骤(1)中的苦瓜为授粉22天后的苦瓜。
作为优选，步骤(2)中水浴的温度为60℃。
作为优选，步骤(2)中超声波提取装置的功率为380W，频率为100kHz。
作为优选，步骤(4)中果胶酶的酶活力为7万U/mL，纤维酶的酶活力为1.1万U/mL。
作为优选，步骤(4)中果胶酶的浓度为0.01％，纤维酶的浓度为0.05％。
作为优选，步骤(6)中脂肪酶的酶活力为10万U/mL。
作为优选，步骤(6)中脂肪酶的浓度为0.05％。
作为优选，步骤(8)和步骤(10)中离心的转速为10000r/min。
作为优选，步骤(11)中半透膜的截留分子量为30k。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的方法采用蛋白质等电点沉淀法分离总蛋白质，所得的总蛋白利率为16.68％。与盐析法相比，降低了所需的物料成本，后续工艺节省大量的透析时间；较重金属和有机酸沉淀法，能获得非变性的蛋白，有利于保留苦瓜籽蛋白的活性功能。本工艺采用半透膜超滤的方法去除杂质，能缩短时间，有利于保留蛋白的活性。
(2)本发明的方法通过采用由果胶酶+纤维酶进行复合酶解，有效破坏苦瓜籽粉细胞的细胞壁，使得细胞内的蛋白更易提取。脂肪酶可异性的作用于油脂的酯键，催化甘油三酯的水解，以达到除去种子中脂肪的目的，替代了传统的有机溶剂提取法，有效避免有机溶剂的污染，作用条件温和，很少产生毒害物质的优点，利于后续保健食品和药品的开发。
(3)本发明的方法采用两次碱溶和复合酶酶解法提取蛋白，该酶法制备苦瓜籽蛋白，工艺安全、制备便捷，有效的提高蛋白质的得率和纯度，苦瓜籽蛋白提取率可达16.68％以上，其蛋白纯度高达95.0％以上。同时，通过冻干法干燥蛋白，最大程度的避免加热对蛋白的破坏，获得疏松易溶解的蛋白粉末。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1：
一种苦瓜籽蛋白的酶解提取方法，包括以下步骤：
(1)将苦瓜籽进行清理杂质，热风干燥未剥壳的苦瓜籽粉碎成40目的细粉备用；所述的苦瓜为授粉22天后的苦瓜，种子发育成熟，蛋白含量高，适宜作为蛋白粉提取的原料；
(2)称取苦瓜籽粉200克，加入10倍量的水2000mL，匀浆获得料液，室温下超声波提取装置处理20min后，60℃水浴上保温6小时；所述超声波提取装置的功率为380W，频率为100kHz；
(3)将步骤(2)中获得的料液加入果胶酶0.2g，纤维酶1.0g，缓慢的搅拌均匀，53℃水浴中静置6小时以上；所述果胶酶的酶活力为7万U/mL，纤维酶的酶活力为1.1万U/mL；所述果胶酶的浓度为0.01％，纤维酶的浓度为0.05％；
(4)将步骤(3)中所得的料液加入氢氧化钠溶液(1M)调整pH值到8.5；
(5)加入脂肪酶1.0g，缓慢的搅拌均匀，45℃水浴中静置12小时，加入的脂肪酶可异性的作用于油脂的酯键，催化甘油三酯的水解，以达到除去种子中脂肪的目的，用此方法代替传统的有机溶剂提取法可避免有机溶剂的污染，本工艺中，经优化后建议的添加量为混合液的0.05％，作用温度45℃，时间12小时以上；所述脂肪酶的酶活力为10万U/mL；脂肪酶的浓度为0.05％；
(6)边加边搅拌，将溶液的pH值用氢氧化钠溶液(1M)调至9.5，静置3小时；
(7)将pH9.5的混合液离心10分钟，转速10000r/min，取上清液，滤纸过滤，
(8)边加边搅拌，滤液用1M的盐酸调整pH值至3.0，静置6小时以上，
(9)将pH3.0的混合液离心10分钟，转速10000转/分钟，弃去上清液，取沉淀，
(10)将沉淀至半透膜上，用10倍量的纯水洗去盐和其它杂质；所述半透膜的截留分子量为30k；
(11)将除杂后的蛋白用冻干法冻干，得到33.36g浅黄色的粉末，即为苦瓜籽的总蛋白。
对照例：
(1)将苦瓜籽进行清理杂质，热风干燥未剥壳的苦瓜籽粉碎成40目的细粉备用
(2)称取苦瓜籽粉20克，加入10倍量的水200ml，匀浆获得料液，60℃水浴上保温6小时；
(3)边加边搅拌，将溶液的pH值用氢氧化钠溶液(1M)调至9.5，静置3小时；
(4)将pH9.5的混合液离心10分钟，转速10000转/分钟，取上清液，滤纸过滤，因未用脂肪酶脱脂，碱提的过程会产生皂化，致使溶解乳化浑浊，难于过滤，此步骤的过滤时长比酶解过的提取液大大延长(10倍以上)，即使抽滤也无法有效加快速度；
(5)边加边搅拌，滤液用1M的盐酸调整pH值至3.0，静置6小时以上；
(6)将pH3.0的混合液离心10分钟，转速10000转/分钟，弃去上清液，取沉淀；
(7)将沉淀至盐析用透析袋中，在4℃纯水中透析，每隔6小时换水洗去盐和其它杂质，直至透析袋内外的渗透压平衡，此步骤约需要72小时，远长于超滤法的3小时；
(8)将除杂后的蛋白用冻干法冻干，得到2.09g浅黄色的粉末，即为苦瓜籽的总蛋白。
表1本发明苦瓜籽蛋白的酶解提取方法的效果
由表1可知，与对照例相比，本发明的提取方法在保证苦瓜籽蛋白纯度不变的前提下，利用酶提取和超声辅助提取的方法，提高了蛋白的得率，提高幅度约为37％，通过酶脱脂后，过滤时间大幅缩短；干燥前采用30k超滤膜除盐除杂质，与盐析技术相比，大幅缩短了时间。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (10)
1.一种苦瓜籽蛋白的酶解提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)先将苦瓜种子干燥后，再将未剥壳的苦瓜籽粉碎成细粉，过40目筛，备用；
(2)称取苦瓜籽细粉加入10倍量的水，室温下超声波提取装置提取20min后，水浴中保温6h；
(3)边加边搅拌，用稀盐酸(1M)调整pH值到5.5；
(4)在料液中加入果胶酶0.2g，纤维酶1.0g，缓慢的搅拌均匀，置于53℃水浴中静置6h；
(5)边加边搅拌，用氢氧化钠溶液(1M)调整pH值到8.5；
(6)加入脂肪酶1.0g，缓慢的搅拌均匀，45℃水浴中静置12h；
(7)边加边搅拌，将溶液的pH值用氢氧化钠溶液(1M)调至9.5，静置3h；
(8)将pH9.5的混合液离心10min，取上清液，滤纸过滤；
(9)边加边搅拌，滤液用1M的盐酸调整pH值至3.0，静置6h以上；
(10)将pH3.0的混合液离心10min，弃去上清液，取沉淀；
(11)将沉淀至半透膜上，用10倍量的纯水洗去盐和其它杂质；
(12)将除杂后的蛋白用冻干法冻干，得到浅黄色的粉末，即为苦瓜籽的总蛋白。
2.根据权利要求1所述的苦瓜籽蛋白的酶解提取方法，其特征在于，步骤(1)中的苦瓜为授粉22天后的苦瓜。
3.根据权利要求1所述的苦瓜籽蛋白的酶解提取方法，其特征在于，步骤(2)中水浴的温度为60℃。
4.根据权利要求1所述的苦瓜籽蛋白的酶解提取方法，其特征在于，步骤(2)中超声波提取装置的功率为380W，频率为100kHz。
5.根据权利要求1所述的苦瓜籽蛋白的酶解提取方法，其特征在于，步骤(4)中果胶酶的酶活力为7万U/mL，纤维酶的酶活力为1.1万U/mL。
6.根据权利要求1所述的苦瓜籽蛋白的酶解提取方法，其特征在于，步骤(4)中果胶酶的浓度为0.01％，纤维酶的浓度为0.05％。
7.根据权利要求1所述的苦瓜籽蛋白的酶解提取方法，其特征在于，步骤(6)中脂肪酶的酶活力为10万U/mL。
8.根据权利要求1所述的苦瓜籽蛋白的酶解提取方法，其特征在于，步骤(6)中脂肪酶的浓度为0.05％。
9.根据权利要求1所述的苦瓜籽蛋白的酶解提取方法，其特征在于，步骤(8)和步骤(10)中离心的转速为10000r/min。
10.根据权利要求1所述的苦瓜籽蛋白的酶解提取方法，其特征在于，步骤(11)中半透膜的截留分子量为30k。
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