CN106834276A - 一种苦瓜单粒种子dna快速提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于苦瓜分子生物学技术领域，具体涉及一种苦瓜单粒种子DNA快速提取方法。一种苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，包括如下步骤：研磨、加入试剂A水浴、离心、加入试剂B离心、抽提、离心、沉淀和溶解，然后得到苦瓜单粒种子DNA。本发明的提取方法不需对种子进行任何处理，提取DNA可以满足后续分子生物学试验。通过与常规的苦瓜叶片提取DNA相比较，本发明的鉴定方法具有检测速度快、成本低、结果可靠的特点。
Description
技术领域
本发明属于苦瓜分子生物学技术领域，具体涉及一种苦瓜单粒种子DNA快速提取方法。
背景技术
苦瓜(Momordica charantia L.)为葫芦科苦瓜属一年生攀缘草本植物，具较高的营养价值和食疗功效。近年来，苦瓜种植面积不断增加，已成为“南菜北运”的主要蔬菜品种和特色产业。随着分子生物学技术的飞速发展，利用分子标记辅助选择进一步加快了育种的进程。
苦瓜DNA的提取是进行分子标记辅助选择的前提。以苦瓜叶片为材料，利用CTAB进行DNA提取，是目前广泛应用的方法，该方法DNA提取量较多、纯度也较高，可满足大部分分子生物学研究要求。但该方法有机试剂处理次数过多、耗时长、成本高。而以苦瓜叶片为DNA提取材料，受到苦瓜生长季节的限制，并增加了穴盘、基质以及人工点种的费用。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明公开了一种苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，该方法是取待测苦瓜种子样品，单粒提取DNA，每粒种子装入2mL圆头离心管中，内放两颗2mm直径钢珠，液氮速冻45s，然后采用高通量组织研磨器破碎，频率设定75Hz，时间设定90s，通过对CTAB裂解液、酚-氯仿-异戊醇浓度和处理时间，增加颠倒混匀次数、离心时间和转速等方面进行改进，充分提取DNA。
本发明所提供的技术方案是：
一种苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，包括如下步骤：
(1)取苦瓜种子1粒，去掉种皮后，用灭菌的刀片将其剖成4半，装入2mL圆头离心管，离心管内置两颗2mm直径钢珠，液氮速冻45s，采用高通量组织研磨器研磨破碎，参数设定频率为75Hz、速率1500rpm，时间为90s；
(2)加入1.5mL试剂A，混匀后，置于65℃水浴锅中水浴45-60min，水浴期间每隔5min将离心管上下颠倒混匀1次；
(3)水浴后，用离心机离心10min；
(4)取上清，加入等体积的试剂B，上下颠倒混匀3-5min，离心管加入苯酚后要剧烈颠倒摇匀50次以上，然后用离心机在转速12000r/min下离心10min；
(5)按照上述步骤(4)重复操作1次；
(6)离心后，取上清，加入等体积试剂C进行抽提，轻轻摇晃15-20min，然后用离心机在转速12000r/min离心10min；
(7)按照上述步骤(6)重复操作1次；
(8)离心后，移液器轻轻地吸取上清夜至1.5mL离心管中，加入等体积预冷的试剂D，离心管慢慢上下摇动30s，使试剂D与水层充分混合至能见到DNA絮状物，于4℃下沉淀30min；
(9)待沉淀结束后，用离心机在转速10000r/min下离心10min，弃上清，用无水乙醇清洗，在通风厨里晾干，用1×TE溶解，同时加入1.5μL RNA酶，再将其置于37℃下水浴15min，即得到苦瓜单粒种子DNA；
(10)将得到的苦瓜单粒种子DNA置于-20℃下保存，备用。
作为优选，步骤(1)中苦瓜的品种为桂农科3号、桂农科6号或翠竹。
作为优选，步骤(1)中所述的高通量组织研磨器的参数设定为：频率为75Hz、速率1500rpm，时间为90s。
作为优选，步骤(2)中所述的试剂A在使用前提前预热至65℃。
作为优选，步骤(2)中所述的试剂A包括：100mM Tris-HCl(pH 8.5)，20mM EDTA(pH8.0)，1.4M NaCl，质量浓度2％的CTAB、质量浓度1％的PVP-40和质量浓度0.5％的β-巯基乙醇，其余为蒸馏水；pH8.0。
作为优选，步骤(3)中所述的离心机的转速为12000r/min。
作为优选，步骤(4)中所述的试剂B包括：Tris-HCl平衡苯酚与等体积的氯仿/异戊醇(24：1)混合均匀，棕色瓶4℃保存。
作为优选，步骤(6)中所述的试剂C包括：将氯仿和异戊醇按照体积比24：1混合均匀，棕色瓶4℃保存。
作为优选，步骤(8)中所述的试剂D包括异丙醇和醋酸钠，二者的体积质量比为10:1。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)检测速度快：以种子为材料提取DNA可以不受采样时间、地点的限制，也解除了提取DNA过程中需要液氮研磨的麻烦。采用一台高通量组织研磨器(宁波新芝Scientz-192)可在90秒内完成96个样品的研磨，大大缩短研磨时间，比过去研磨效率至少提高30倍。
(2)结果可靠：实验证实，利用本方法提取DNA，速度快，质量高。将DNA浓度稀释至60ng/μL，采用1％琼脂糖电泳检测DNA的完整性，紫外分光光度计测定DNA样品OD260/OD280为1.82。说明该方法提取的苦瓜基因组DNA纯度和完整性较好，可进行后续的分子生物学试验。
(3)成本低：由于采用种子进行DNA提取，工作量大大降低，节省时间和人力物力，加速了苦瓜分子育种的效率和进程。
附图说明
图1为采用本发明的提取方法得到的苦瓜单粒种子提取DNA的凝胶电泳图谱；
有关附图标记的说明：
泳道1-6为桂农科3号苦瓜种子DNA；泳道7-12为桂农科6号苦瓜种子DNA；泳道13-18为翠竹苦瓜种子DNA。
具体实施方式
下面结合具体例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：
一种苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，包括如下步骤：
(1)取苦瓜种子1粒，去掉种皮后，用灭菌的刀片将种子剖成4半，装入2mL圆头离心管，离心管内置两颗2mm直径钢珠，液氮速冻45s，采用高通量组织研磨器研磨破碎，参数设定频率为75Hz、速率1500rpm，时间为90s；所述的苦瓜的品种为桂农科3号；所述的高通量组织研磨器的参数设定为：频率为75Hz、速率1500rpm，时间为90s；
(2)加入1.5mL试剂A，混匀后，置于65℃水浴锅中水浴45-60min，水浴期间每隔5min将离心管上下颠倒混匀1次；所述的试剂A在使用前提前预热至65℃；所述的试剂A包括：100mM Tris-HCl(pH 8.5)，20mM EDTA(pH8.0)，1.4M NaCl，质量浓度2％的CTAB、质量浓度1％的PVP-40和质量浓度0.5％的β-巯基乙醇，其余为蒸馏水；pH8.0；
(3)水浴后，用离心机离心10min；所述的离心机的转速为12000r/min；
(4)取上清，加入等体积的试剂B，上下颠倒混匀3-5min，离心管加入苯酚后要剧烈颠倒摇匀50次以上，然后用离心机在转速12000r/min下离心10min；所述的试剂B包括：Tris-HCl平衡苯酚与等体积的氯仿/异戊醇(24：1)混合均匀，棕色瓶4℃保存；
(5)按照上述步骤(4)重复操作1次；
(6)离心后，取上清，加入等体积试剂C进行抽提，轻轻摇晃15-20min，然后用离心机在转速12000r/min离心10min；所述的试剂C包括：将氯仿和异戊醇按照体积比24：1混合均匀，棕色瓶4℃保存；
(7)按照上述步骤(6)重复操作1次；
(8)离心后，移液器轻轻地吸取上清夜至1.5mL离心管中，加入等体积预冷的试剂D，离心管慢慢上下摇动30s，使试剂D与水层充分混合至能见到DNA絮状物，于4℃下沉淀30min；所述的试剂D包括异丙醇和醋酸钠，二者的体积质量比为10:1；
(9)待沉淀结束后，用离心机在转速10000r/min下离心10min，弃上清，用无水乙醇清洗，在通风厨里晾干，用1×TE溶解，同时加入1.5μL RNA酶，再将其置于37℃下水浴15min，即得到苦瓜单粒种子DNA；
(10)将得到的苦瓜单粒种子DNA置于-20℃下保存，备用。
实施例2：
一种苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，包括如下步骤：
(1)取苦瓜种子1粒，去掉种皮后，用灭菌的刀片将种子剖成4半，装入2mL圆头离心管，离心管内置两颗2mm直径钢珠，液氮速冻45s，采用高通量组织研磨器研磨破碎，参数设定频率为75Hz、速率1500rpm，时间为90s；所述的苦瓜的品种为桂农科6号；所述的高通量组织研磨器的参数设定为：频率为75Hz、速率1500rpm，时间为90s；
(2)加入1.5mL试剂A，混匀后，置于65℃水浴锅中水浴45-60min，水浴期间每隔5min将离心管上下颠倒混匀1次；所述的试剂A在使用前提前预热至65℃；所述的试剂A包括：100mM Tris-HCl(pH 8.5)，20mM EDTA(pH8.0)，1.4M NaCl，质量浓度2％的CTAB、质量浓度1％的PVP-40和质量浓度0.5％的β-巯基乙醇，其余为蒸馏水；pH8.0；
(3)水浴后，用离心机离心10min；所述的离心机的转速为12000r/min；
(4)取上清，加入等体积的试剂B，上下颠倒混匀3-5min，离心管加入苯酚后要剧烈颠倒摇匀50次以上，然后用离心机在转速12000r/min下离心10min；所述的试剂B包括：Tris-HCl平衡苯酚与等体积的氯仿/异戊醇(24：1)混合均匀，棕色瓶4℃保存；
(5)按照上述步骤(4)重复操作1次；
(6)离心后，取上清，加入等体积试剂C进行抽提，轻轻摇晃15-20min，然后用离心机在转速12000r/min离心10min；所述的试剂C包括：将氯仿和异戊醇按照体积比24：1混合均匀，棕色瓶4℃保存；
(7)按照上述步骤(6)重复操作1次；
(8)离心后，移液器轻轻地吸取上清夜至1.5mL离心管中，加入等体积预冷的试剂D，离心管慢慢上下摇动30s，使试剂D与水层充分混合至能见到DNA絮状物，于4℃下沉淀30min；所述的试剂D包括异丙醇和醋酸钠，二者的体积质量比为10:1；
(9)待沉淀结束后，用离心机在转速10000r/min下离心10min，弃上清，用无水乙醇清洗，在通风厨里晾干，用1×TE溶解，同时加入1.5μL RNA酶，再将其置于37℃下水浴15min，即得到苦瓜单粒种子DNA；
(10)将得到的苦瓜单粒种子DNA置于-20℃下保存，备用。
实施例3：
一种苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，包括如下步骤：
(1)取苦瓜种子1粒，去掉种皮后，用灭菌的刀片将种子剖成4半，装入2mL圆头离心管，离心管内置两颗2mm直径钢珠，液氮速冻45s，采用高通量组织研磨器研磨破碎，参数设定频率为75Hz、速率1500rpm，时间为90s；所述的苦瓜的品种为翠竹；所述的高通量组织研磨器的参数设定为：频率为75Hz、速率1500rpm，时间为90s；
(2)加入1.5mL试剂A，混匀后，置于65℃水浴锅中水浴45-60min，水浴期间每隔5min将离心管上下颠倒混匀1次；所述的试剂A在使用前提前预热至65℃；所述的试剂A包括：100mM Tris-HCl(pH 8.5)，20mM EDTA(pH8.0)，1.4M NaCl，质量浓度2％的CTAB、质量浓度1％的PVP-40和质量浓度0.5％的β-巯基乙醇，其余为蒸馏水；pH8.0；
(3)水浴后，用离心机离心10min；所述的离心机的转速为12000r/min；
(4)取上清，加入等体积的试剂B，上下颠倒混匀3-5min，离心管加入苯酚后要剧烈颠倒摇匀50次以上，然后用离心机在转速12000r/min下离心10min；所述的试剂B包括：Tris-HCl平衡苯酚与等体积的氯仿/异戊醇(24：1)混合均匀，棕色瓶4℃保存；
(5)按照上述步骤(4)重复操作1次；
(6)离心后，取上清，加入等体积试剂C进行抽提，轻轻摇晃15-20min，然后用离心机在转速12000r/min离心10min；所述的试剂C包括：将氯仿和异戊醇按照体积比24：1混合均匀，棕色瓶4℃保存；
(7)按照上述步骤(6)重复操作1次；
(8)离心后，移液器轻轻地吸取上清夜至1.5mL离心管中，加入等体积预冷的试剂D，离心管慢慢上下摇动30s，使试剂D与水层充分混合至能见到DNA絮状物，于4℃下沉淀30min；所述的试剂D包括异丙醇和醋酸钠，二者的体积质量比为10:1；
(9)待沉淀结束后，用离心机在转速10000r/min下离心10min，弃上清，用无水乙醇清洗，在通风厨里晾干，用1×TE溶解，同时加入1.5μL RNA酶，再将其置于37℃下水浴15min，即得到苦瓜单粒种子DNA；
(10)将得到的苦瓜单粒种子DNA置于-20℃下保存，备用。
将实施例1-3中得到苦瓜单粒种子DNA浓度稀释至60ng/μL，采用1％琼脂糖电泳检测苦瓜单粒种子DNA的纯度和完整性，采用紫外分光光度计测定DNA样品的OD260/OD280为1.82。采用PCR进行验证，结果见图1。
如图1所示，本发明方法提取的苦瓜基因组DNA纯度和完整性较好，可进行后续的分子生物学试验。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (9)
1.一种苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取苦瓜种子1粒，去掉种皮后，用灭菌的刀片将其剖成4半，装入2mL圆头离心管，离心管内置两颗2mm直径钢珠，液氮速冻45s，采用高通量组织研磨器研磨破碎，参数设定频率为75Hz、速率1500rpm，时间为90s；
(2)加入1.5mL试剂A，混匀后，置于65℃水浴锅中水浴45-60min，水浴期间每隔5min将离心管上下颠倒混匀1次；
(3)水浴后，用离心机离心10min；
(4)取上清，加入等体积的试剂B，上下颠倒混匀3-5min，离心管加入苯酚后要剧烈颠倒摇匀50次以上，然后用离心机在转速12000r/min下离心10min；
(5)按照上述步骤(4)重复操作1次；
(6)离心后，取上清，加入等体积试剂C进行抽提，轻轻摇晃15-20min，然后用离心机在转速12000r/min离心10min；
(7)按照上述步骤(6)重复操作1次；
(8)离心后，移液器轻轻地吸取上清夜至1.5mL离心管中，加入等体积预冷的试剂D，离心管慢慢上下摇动30s，使试剂D与水层充分混合至能见到DNA絮状物，于4℃下沉淀30min；
(9)待沉淀结束后，用离心机在转速10000r/min下离心10min，弃上清，用无水乙醇清洗，在通风厨里晾干，用1×TE溶解，同时加入1.5μL RNA酶，再将其置于37℃下水浴15min，即得到苦瓜单粒种子DNA；
(10)将得到的苦瓜单粒种子DNA置于-20℃下保存，备用。
2.根据权利要求1所述的苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，其特征在于，步骤(1)中苦瓜的品种为桂农科3号、桂农科6号或翠竹。
3.根据权利要求1所述的苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，其特征在于，步骤(1)中所述的高通量组织研磨器的参数设定为：频率为75Hz、速率1500rpm，时间为90s。
4.根据权利要求1所述的苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述的试剂A在使用前提前预热至65℃。
5.根据权利要求1所述的苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述的试剂A包括：100mM Tris-HCl(pH 8.5)，20mM EDTA(pH8.0)，1.4M NaCl，质量浓度2％的CTAB、质量浓度1％的PVP-40和质量浓度0.5％的β-巯基乙醇，其余为蒸馏水；pH 8.0。
6.根据权利要求1所述的苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述的离心机的转速为12000r/min。
7.根据权利要求1所述的苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，其特征在于，步骤(4)中所述的试剂B包括：Tris-HCl平衡苯酚与等体积的氯仿/异戊醇(24：1)混合均匀，棕色瓶4℃保存。
8.根据权利要求1所述的苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，其特征在于，步骤(6)中所述的试剂C包括：将氯仿和异戊醇按照体积比24：1混合均匀，棕色瓶4℃保存。
9.根据权利要求1所述的苦瓜单粒种子DNA快速提取方法，其特征在于，步骤(8)中所述的试剂D包括异丙醇和醋酸钠，二者的体积质量比为10:1。
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