CN107805674B - 一种利用ssr分子标记快速鉴定灌木辣椒种质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用SSR分子标记快速鉴定灌木辣椒(Capsicum frutescens L.)种质的方法，属于植物分子标记辅助种质资源鉴别与育种技术领域。本发明的SSR分子标记可以由如SEQ ID NO.1‑2所示的引物扩增得到。本发明提供的SSR分子标记可将灌木辣椒(C.frutescens)种质与一年生辣椒(C.annuum)种质区分开来，操作简单、重现性好、准确度高，可有效克服用表型鉴定方法难以准确区分灌木辣椒种质与一年生辣椒种质的缺点，在辣椒种质资源鉴别及分子标记辅助育种中具有重要作用。

Description

一种利用SSR分子标记快速鉴定灌木辣椒种质的方法
技术领域
本发明涉及植物分子标记辅助种质资源鉴别与育种技术领域，特别是涉及一种利用SSR分子标记快速鉴定灌木辣椒(Capsicum frutescens L.)种质的方法。
背景技术
辣椒(Capsicum spp.)为茄科(Solanaceae)辣椒属蔬菜作物，其果实具独特的辣味、香味、色泽和丰富的维生素C，既可鲜食、调味，也可用于提炼辣椒油、辣椒红素和辣椒素，具有重要的经济价值和食疗保健作用。辣椒也是我国栽培面积最大的蔬菜作物之一，据统计，我国辣椒年种植面积已达133万公顷，总产量2800万吨，占世界辣椒总产量的46％，居世界首位。辣椒属共有5个栽培种，分别为：一年生辣椒(C.annuum)、灌木辣椒(C.frutescens)、中华辣椒(C.chinense)、长柄辣椒(C.baccatum)、茸毛辣椒(C.pubescens)。我国辣椒主要以一年生辣椒(C.annuum)为主，但在南方地区也有灌木辣椒(C.frutescens)种质资源的分布。
灌木辣椒(C.frutescens)种质主要分布于中南美洲、亚洲和非洲的低纬度地区，在中国则主要分布于海南和云南等地，当地俗称“小米椒”、“小米辣”、“小雀辣”等，呈野生或半野生状态，在云南文山、江西赣州等地区亦有一定面积的人工栽培，产品主要用于加工。相关研究表明，灌木辣椒具有耐高温潮湿、抗疫病及黄萎病、耐瘠薄和耐弱光的特性，果实辣度强并具有独特的清香味，可做为特异资源和抗原材料在辣椒育种中加以利用，因此灌木辣椒种质资源的收集与鉴定对辣椒遗传改良具有重大意义。但长期以来，由于灌木辣椒种质与一年生辣椒种质亲缘关系较近，在农艺性状方面有不少相似之处，通过表型鉴定等常规方法很难快速有效将灌木辣椒种质与一年生辣椒种质区分开来，容易造成辣椒种质分类上的混乱，不利于辣椒种质资源的高效利用。
近年来，随着分子生物学和基因组学研究的不断深入，DNA分子标记技术的研究与应用得到了迅速的发展。DNA分子标记反映了DNA水平上生物个体间的遗传差异，其技术广泛应用在物种起源、种质鉴定、遗传图谱构建和分子标记辅助育种等，具有数量丰富、多态性高、不受环境影响、检测快速等优点。目前DNA分子标记的方法主要有RFLP、RAPD、SSR、AFLP和SNP等。
微卫星标记(microsatellite)又被称为短串联重复序列(short tandemrepeats，STRs)或简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)，是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2～6个核苷酸，甚至更多核苷酸为基本单位组成的串联重复序列片段，其长度大多在200bp以内，普遍存在于真核生物和原核生物基因组中，分布于编码区和非编码区。由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，具有扩增稳定，特异性高，共显性，开发成本相对低等优点，因此微卫星标记的应用非常广泛。
SSR标记完全符合作物品种鉴别的4个基本准则，即环境的稳定性、品种间变异的可识别性、最小的品种内变异和实验结果的可靠性，其已成为作物种质资源鉴定的一种理想分子标记，该标记可通过比较材料之间的扩增条带，就可以较好地将同一物种的不同品种的亲缘关系进行有效鉴定评价，鉴定结果客观公正、可靠性高，这对灌木辣椒种质资源的收集、保存、评价和利用具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种用于快速、准确鉴定灌木辣椒(C.frutescens)种质的SSR分子标记。
本发明的第二个目的是提供上述分子标记在鉴定灌木辣椒(C.frutescens L.)种质中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：申请人收集了不同地理来源、有代表性的18份辣椒种质资源，包括灌木辣椒种质和一年生辣椒种质的5个变种：长椒(var.1ongum)、灯笼椒(var.grossum)、圆锥椒(var.conoides)、樱桃椒(var.cerasiforme)和簇生椒
(var.fascicutatum)作为本研究的关联群体。寻找特异的SSR位点，然后用筛选出的SSR引物对表1中的有代表性的灌木辣椒种质及一年生辣椒种质进行PCR扩增，从中寻找能区分灌木辣椒种质和一年生辣椒种质的特异性引物对。
基于上述技术方案，本发明获得了用于鉴定灌木辣椒(C.frutescens)种质的SSR分子标记，由核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物PCR扩增获得。
进一步地，本发明提供了用于鉴定灌木辣椒(C.frutescens)种质的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。
本发明提供了上述SSR分子标记或上述特异性引物对在灌木辣椒(C.frutescens)种质鉴定中的应用。
本发明提供了上述SSR分子标记或上述特异性引物对在灌木辣椒(C.frutescens)种质分子育种中的应用。
本发明提供了上述SSR分子标记或上述特异性引物对在灌木辣椒(C.frutescens)种质资源改良中的应用。
本发明提供了含有SEQ ID NO.1-2所示特异性引物对的试剂盒。
更进一步地，本发明提供了一种鉴定灌木辣椒(C.frutescens)种质的方法，包括以下步骤：
(1)提取待鉴定辣椒种质的基因组DNA；
(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，利用权利要求2所述的特异性引物对进行PCR扩增反应；
(3)若扩增产物仅有200bp和315bp两条带，则待鉴定辣椒种质为灌木辣椒(C.frutescens)种质。
优选地，PCR扩增时设至少5个阳性对照，所述阳性对照为灌木辣椒代表性种质。例如，云南西双版纳野生小米椒、云南砚山小米椒、海南五指山野生小米椒、海南崖州小米椒、江西信丰小米椒和美洲灌木辣椒等。本发明提供了一种鉴定灌木辣椒(C.frutescens)种质的方法中，步骤(2)的PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min。
扩增产物采用6％聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳技术及快速银染法检测。
本发明的有益效果在于：本发明提供的SSR分子标记可将灌木辣椒与一年生辣椒种质资源区别开，操作简单、重现性好、准确度高，可有效克服用表型鉴定方法难以区分灌木辣椒种质与一年生辣椒种质的缺点，在辣椒鉴别与分子辅助育种中发挥重要作用。本发明的SSR分子标记还能够作为遗传标记，用于灌木辣椒的育种或选育，具有较高的应用价值。
附图说明
图1为利用本发明的SSR分子标记检测灌木辣椒种质和一年生辣椒种质的PCR扩增电泳图，图中M：marker，泳道1和2为待鉴定的目标种质，泳道3-9为标准灌木辣椒(C.frutescens)种质，泳道10-18为一年生辣椒(C.annuum)种质。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，下述实施例中所用的材料、试剂等均可从商业途径得到；实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；下述实施例中的百分含量，均为质量百分含量。
实施例1用于鉴定灌木辣椒种质的SSR分子标记的获得及其检测引物的确定
本发明的用于鉴定灌木辣椒(C.frutescens)种质的SSR分子标记是通过以下方法获得的：
(1)选取来自于江西定南县和江西高安市的待鉴定疑似灌木辣椒目标种质2份(种质1、种质2)、标准灌木辣椒种质7份和一年生辣椒种质9份，并采用改良CTAB法提取基因组DNA。18份辣椒种质具体信息如表1所示。
表1供试辣椒种质
Figure BDA0001502674060000051
(2)SSR分子标记的获得过程
利用筛选得到的200对辣椒SSR引物，以种质8、种质9、种质10和种质11基因组DNA为模板，进行引物初步筛选，筛选出50对扩增条带清晰的SSR引物。然后用筛选出的50对SSR引物对表1中的18份辣椒种质进行PCR扩增，从中寻找能区分灌木辣椒(C.frutescens)种质和一年生辣椒(C.annuum)种质的特异性引物对。
(3)检测SSR分子标记的引物的确定
PCR扩增产物经电泳检测和银染显色后拍照成像并观察分析，最终确定鉴定灌木辣椒(C.frutescens)种质SSR分子标记的扩增引物为Hpms 1-106，正向引物：5’-TCCAAACTACAAGCCTGCCTAA CC-3；’反向引物：5’-TTTTGCATTATTGAGTCCCACAGC-3’。该引物扩增条带清晰、重复性好，特征带差异明显，扩增出的200bp和315bp条带能区分出灌木辣椒种质和一年生辣椒种质。
实施例2本发明的分子标记鉴定灌木辣椒种质的应用
1、改良CTAB法提取待鉴定辣椒种质全基因组DNA。
待鉴定辣椒目标种质2份、灌木辣椒标准种质7份、一年生辣椒种质9份，分别取其嫩叶4-5片，将样品用棉纱包裹放入液氮中保存，用改良CTAB法提取全基因组DNA。具体方法如下：
将放入液氮中的叶片取出放入研钵中用液氮磨成粉末，然后迅速用2ml离心管将粉末勺进管的2/5处。迅速加入预热至65℃的CTAB提取液1ml(加入前先加入1％的β-巯基乙醇)，充分混匀后将2ml离心管放入65℃水浴锅中，水浴60min，每隔5min摇荡一次，使之充分反应。取出离心管静置至数分钟后放入4℃高速低温离心机中，13000rpm离心15min。取上清液至另一离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)后，充分混匀，静置10min。13000rpm离心10min，取上清液800μl置于新的1.5ml离心管中。加入2/3体积冷的异丙醇，轻晃，置于-20℃冰箱30min或者过夜。取出步骤5的离心管在4℃下条件下，13000rpm离心10min，弃上清。用75％乙醇洗涤DNA两次，放在桌面自然晾干。向1.5ml离心管中加入200μlddH2O将DNA溶解，再加5μl 10mg/ml RNaseA 37℃水浴60min。加入等体积200μl预冷的氯仿：异戊醇(24:1)混匀，静置10min，12000rpm离心10min。取上清加入1/10(总)体积的NaAc(3mol/L)，2倍体积冷的无水乙醇。-20℃放置30min或更长时间，在4℃下13000rpm，离心15min。用冷的75％乙醇洗涤沉淀两次，放至桌面自然晾干。加200μl灭菌1×TE使沉淀完全溶解，最后将离心管放入-20℃冰箱保存备用。
2、PCR产物检测：
PCR扩增所用的上下游引物分别为实施例1确定的扩增引物Hpms 1-106，正向引物：5’-TCCAAACTACAAGCCTGCCTAACC-3’；反向引物：5’-TTTTGCATTATTGAGTCCCACAGC-3’。PCR扩增反应体系为10μl体系，具体如下：
Figure BDA0001502674060000071
所述PCR反应程序：(1)94℃预变性4min；(2)94℃变性45s；(3)60℃退火45s；(3)72℃延伸45s；(5)重复步骤(2)-(4)，共35个循环；(6)72℃延伸10min；(7)4℃保存。
扩增产物用6％聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行检测，银染显色后拍照成像。聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳及银染步骤如下：
制备6％变性聚丙烯酰胺DNA测序凝胶。凝胶聚合1h后，在电泳槽加入约1×TBE电泳液，用胶头滴管将剩余凝胶碎片冲出。恒功率100W，设定电压2000V条件下预电泳30min。
PCR产物变性：PCR产物每管中加入4μl上样缓冲液，在PCR仪上94℃变性4min后，立即放入冰中迅速冷却。
点样及电泳：在预电泳结束后，用滴管把加样孔内的残留胶和尿素冲出，把梳子正向插入凝胶，齿尖入胶深度以不超过l mm为宜，每个样品上样5μl，设恒功率65W，电压2000V条件下电泳1h。
银染和条带分析：采用快速银染法。
洗胶：将长、短玻璃板分开后将长玻璃板在托盘A中用超纯水漂洗凝胶2次，每次15s，在将玻璃板取出时，让玻板竖直滴干10～20s，再进行下一次洗涤。
染色：在长盘B中加入1.2L染色液，将有胶的玻板放入托盘，在摇床轻摇10min。
显色：将胶浸入装有超纯水中的托盘A、取出沥水、立即放入盛有预冷显影液的托盘C中，把托盘C放在摇床轻摇5-7min至条带清晰的呈现出来。
洗胶：用自来水冲洗玻璃板2min，将胶上多余的NaOH溶液冲去。
干胶：通过热对流或室温放置，使胶变干，放至胶片观察灯下进行观察并拍照。
3、结果判定：若待鉴定目标种质能在标记引物Hpms 1-106扩增出与灌木辣椒标准种质相同的200bp和315bp条带时，则判定目标种质为灌木辣椒(C.frutescens)种质。如图1所示，泳道1和2为待鉴定的目标种质，泳道3-9为标准灌木辣椒(C.frutescens)种质，泳道10-18为一年生辣椒(C.annuum)种质。可见待鉴定目标种质均扩增出与灌木辣椒标准种质相同的200bp和315bp条带，鉴定待鉴定目标种质为灌木辣椒(C.frutescens)种质。
虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 江西省农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 一种利用 SSR 分子标记快速鉴定灌木辣椒种质的方法
<130> KHP171117848.8
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccaaactac aagcctgcct aacc 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttttgcatta ttgagtccca cagc 24

Claims (6)

1. 一种特异性引物对在灌木辣椒C. frutescens与一年生辣椒C. annuum种质鉴定中的应用，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；所述特异性引物对通过包括如下的步骤来实现对灌木辣椒C. frutescens与一年生辣椒C. annuum的种质鉴定：
（1）提取待鉴定辣椒种质的基因组DNA；
（2）以步骤（1）中提取的DNA为模板，利用特异性引物对进行PCR扩增反应；所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；
（3）若扩增产物仅有200bp和315bp两条带，则待鉴定辣椒种质为灌木辣椒C.frutescens种质；
并且，PCR扩增时设至少5个阳性对照，所述阳性对照为灌木辣椒代表性种质。
2. 一种SSR分子标记在灌木辣椒C. frutescens与一年生辣椒C. annuum种质鉴定中的应用，所述SSR分子标记由核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物PCR扩增获得；
所述SSR分子标记通过包括如下的步骤来实现对灌木辣椒C. frutescens与一年生辣椒C. annuum的种质鉴定：
（1）提取待鉴定辣椒种质的基因组DNA；
（2）以步骤（1）中提取的DNA为模板，利用特异性引物对进行PCR扩增反应，得到包含SSR分子标记的扩增产物；所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；
（3）若扩增产物仅有200bp和315bp两条带，则包含前述SSR分子标记；待鉴定辣椒种质为灌木辣椒C. frutescens种质；
PCR扩增时设至少5个阳性对照，所述阳性对照为灌木辣椒代表性种质。
3. 一种鉴定灌木辣椒C. frutescens与一年生辣椒C. annuum种质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取待鉴定辣椒种质的基因组DNA；
（2）以步骤（1）中提取的DNA为模板，利用特异性引物对进行PCR扩增反应；所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；
（3）若扩增产物仅有200bp和315bp两条带，则待鉴定辣椒种质为灌木辣椒C.frutescens种质；
PCR扩增时设至少5个阳性对照，所述阳性对照为灌木辣椒代表性种质。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR扩增时设≥5个阳性对照，所述阳性对照为灌木辣椒代表性种质；所述阳性对照为选自云南西双版纳野生小米椒、云南砚山小米椒、海南五指山野生小米椒、海南崖州小米椒、江西信丰小米椒和美洲灌木辣椒的灌木辣椒代表性种质。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR反应程序为：（1）94℃预变性4min；（2）94℃变性45s，（3）60℃退火45s，（4）72℃延伸45s，（5）重复步骤（2）-（4），共35个循环；（6）72℃延伸10min。
6.如权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于，扩增产物采用6％聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳技术及快速银染法检测。
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