TWI495728B - 鑑定薊馬之檢驗套組及其方法 - Google Patents
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Description
本發明是有關於一種快速鑑定薊馬之檢驗套組及其方法，特別是有關於一種以聚合酶連鎖反應快速鑑定十五種薊馬之檢驗套組及其方法。
薊馬(Thrip)是一種靠植物汁液維生的昆蟲，其屬於昆蟲綱纓翅目。薊馬的個體小，行動敏捷，且具有隱匿性，多生活在植物花中取食花粉和花蜜，或以植物的嫩梢、葉片及果實為生，而造成葉子與花朵的損傷，成為農作物、花卉及林果的危害。
薊馬幼蟲體形極小(約2mm)，以傳統形態鑑定方式鑑定薊馬幼蟲極為困難，若欲飼養至成蟲則需五至七日以上。例如，西方花薊馬原產於美洲，危害的寄主植物種類多且適應性強，隨著經貿往來頻繁以擴散到世界許多國家，目前在許多國家都已存在並且常造成作物嚴重的危害。西方花薊馬是台灣檢疫法規中的檢疫害蟲，於輸入切花、蔬菜及鮮果中均曾檢出。目前已發展以分子生物學方
法LAMP技術檢測西方花薊馬，其反應的靈敏性可達100毫微微克，並可大幅縮短鑑定時間。然而，目前薊馬的分生鑑定研究多集中在西方花薊馬，其他薊馬種類的分生鑑定技術則仍待開發。
由於薊馬對於經濟作物之危害甚深，目前對於薊馬的研究工作也持續在進行。然而薊馬種類眾多，且個體皆細小且外觀相似，肉眼不易分辨，更增加了研究工作的困難度。有鑑於此，需要發展更多且更快速且正確的鑑定方法，來達到鑑定主要的薊馬害蟲之目的。
因此，本發明提供一種用於鑑定薊馬之檢驗套組及其方法，可以在多種薊馬的引子對組合快速鑑定十五種薊馬。
本發明之一態樣是在提供一種鑑定十五種薊馬之檢驗套組，包含第一引子對組合、第二引子對組合、第三引子對組合、第四引子對組合、第五引子對組合、第六引子對組合、第七引子對組合、第八引子對組合、第九引子對組合、第十引子對組合、第十一引子對組合、第十二引子對組合、第十三引子對組合、第十四引子對組合以及第十五引子對組合。第一引子對組合係選自SEQ ID：1與SEQ ID：2之引子對及/或SEQ ID：3與SEQ ID：4之引子對，用以鑑別蔥薊馬。第二引子對組合係選自SEQ ID：5與SEQ ID：6之引子對及/或SEQ ID：7與SEQ ID：8之引子對，
用以鑑別台灣花薊馬。第三引子對組合係選自SEQ ID：9與SEQ ID：10之引子對及/或SEQ ID：11與SEQ ID：12之引子對，用以鑑別稻薊馬。第四引子對組合係選自SEQ ID：13與SEQ ID：14之引子對及/或SEQ ID：15與SEQ ID：16之引子對，用以鑑別玉米薊馬。第五引子對組合係選自SEQ ID：17與SEQ ID：18之引子對及/或SEQ ID：19與SEQ ID：20之引子對，用以鑑別司密蘭花薊馬。第六引子對組合係選自SEQ ID：21與SEQ ID：22之引子對及/或SEQ ID：23與SEQ ID：24之引子對，用以鑑別褐花薊馬。第七引子對組合係選自SEQ ID：25與SEQ ID：26之引子對及/或SEQ ID：27與SEQ ID：28之引子對，用以鑑別花薊馬。第八引子對組合係選自SEQ ID：29與SEQ ID：30之引子對及/或SEQ ID：31與SEQ ID：32之引子對，用以鑑別南黃薊馬。第九引子對組合係選自SEQ ID：33與SEQ ID：34之引子對及/或SEQ ID：35與SEQ ID：36之引子對，用以鑑別西方花薊馬。第十引子對組合係選自SEQ ID：37與SEQ ID：38之引子對及/或SEQ ID：39與SEQ ID：40之引子對，用以鑑別尖角薊馬。第十一引子對組合係選自SEQ ID：41與SEQ ID：42之引子對及/或SEQ ID：43與SEQ ID：44之引子對，用以鑑別菊花薊馬。第十二引子對組合係選自SEQ ID：45與SEQ ID：46之引子對及/或SEQ ID：47與SEQ ID：48之引子對，用以鑑別小黃薊馬。第十三引子對組合係選自SEQ ID：49與SEQ ID：50之引子對及/或SEQ ID：51與SEQ ID：52之引子對，用以鑑別
豆花薊馬。第十四引子對組合係選自SEQ ID：53與SEQ ID：54之引子對及/或SEQ ID：55與SEQ ID：56之引子對，用以鑑別青蔥薊馬。第十五引子對組合係選自SEQ ID：57與SEQ ID：58之引子對及/或SEQ ID：59與SEQ ID：60之引子對，用以鑑別玫瑰花薊馬。
根據本發明之一實施例，其中鑑定十五種薊馬之檢驗套組，更包含至少一內部控制引子對，內部控制引子對由具有如SEQ ID：63的引子與具有如SEQ ID：64的引子組成。
根據本發明之另一實施例，其中鑑定十五種薊馬之檢驗套組，更包含萃取薊馬樣本之去氧核醣核酸所需之試劑。
根據本發明之再一實施例，其中鑑定十五種薊馬之檢驗套組，更包含進行聚合酶連鎖反應所需要的試劑。
根據本發明之又一實施例，其中鑑定十五種薊馬之檢驗套組，更包含進行電泳分析所需要之試劑。
藉此，本發明之檢驗套組係運用分子生物學技術，利用不同薊馬種類於基因體分子層次上的差異，設計具有專一性之寡核苷酸引子對，用以快速、準確鑑定不同薊馬。且此檢驗套組更包含至少一組內部控制引子對，以確認作為模版之去氧核醣核酸之品質，增加本發明檢驗套組之客觀性。
本發明之另一態樣提供一種鑑定十五種薊馬之方法，包含下列步驟：提供薊馬樣本之去氧核醣核酸做為模
版。使用至少十五對引子對與模版進行聚合酶連鎖反應，所述之至少十五對引子對，係分別選自第一引子對組合中至少一引子對、第二引子對組合中至少一引子對、第三引子對組合中至少一引子對、第四引子對組合中至少一引子對、第五引子對組合中至少一引子對、第六引子對組合中至少一引子對、第七引子對組合中至少一引子對、第八引子對組合中至少一引子對、第九引子對組合中至少一引子對、第十引子對組合中至少一引子對、第十一引子對組合中至少一引子對、第十二引子對組合中至少一引子對、第十三引子對組合中至少一引子對、第十四引子對組合中至少一引子對及第十五引子對組合中至少一引子對。最後分析聚合酶連鎖反應增幅之目標核酸片段之分子量大小判斷薊馬樣本之種類。其中，目標核酸片段之分子量大小為418bp或387bp，薊馬樣本為蔥薊馬；目標核酸片段之分子量大小為425bp或437bp，薊馬樣本為台灣花薊馬；目標核酸片段之分子量大小為319bp或139bp，薊馬樣本為稻薊馬；目標核酸片段之分子量大小為374bp或162bp，薊馬樣本為玉米薊馬；目標核酸片段之分子量大小為253bp或384bp，薊馬樣本為司密蘭花薊馬；目標核酸片段之分子量大小為414bp或314bp，薊馬樣本為褐花薊馬；目標核酸片段之分子量大小為267bp或356bp，薊馬樣本為花薊馬；目標核酸片段之分子量大小為149bp或305bp，薊馬樣本為南黃薊馬；目標核酸片段之分子量大小為382bp或226bp，薊馬樣本為西方花薊馬；目標核酸片段之分子量大
小為462bp或239bp，薊馬樣本為尖角薊馬；目標核酸片段之分子量大小約為216bp或333bp，薊馬樣本為菊花薊馬；該目標核酸片段之分子量大小為305bp或406bp，薊馬樣本為小黃薊馬；目標核酸片段之分子量大小為376bp或179bp，薊馬樣本為豆花薊馬；目標核酸片段之分子量大小為254bp或326bp，薊馬樣本為青蔥薊馬；以及目標核酸片段之分子量大小為234bp或171bp，薊馬樣本為玫瑰花薊馬。
根據本發明之一實施例，其中模版係為薊馬樣本之ITS1基因片段。
藉此，本發明之鑑定十五種薊馬之方法不僅靈敏度高且具鑑定之特異性，可快速鑑別蔥薊馬、台灣花薊馬、稻薊馬、玉米薊馬、司密蘭花薊馬、褐花薊馬、花薊馬、南黃薊馬、西方花薊馬、尖角薊馬、菊花薊馬、小黃薊馬、豆花薊馬、青蔥薊馬及玫瑰花薊馬，優於傳統形態鑑定之不確定性。
上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：
第1圖繪示本發明之第一引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂電泳圖。
第2圖繪示本發明之第二引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。
第3圖繪示本發明之第三引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。
第4圖繪示本發明之第四引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。
第5圖繪示本發明之第五引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。
第6圖繪示本發明之第六引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。
第7圖繪示本發明之第七引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。
第8圖繪示本發明之第八引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。
第9圖繪示本發明之第九引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。
第10圖繪示本發明之第十引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。
第11圖繪示本發明之第十一引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。
第12圖繪示本發明之第十二引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。
第13圖繪示本發明之第十三引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。
第14圖繪示本發明之第十四引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。
第15圖繪示本發明之第十五引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。
本發明之一實施方式係在提供一種鑑定十五種薊馬之檢驗套組，其包含第一引子對組合、第二引子對組合、第三引子對組合、第四引子對組合、第五引子對組合、第六引子對組合、第七引子對組合、第八引子對組合、第九引子對組合、第十引子對組合、第十一引子對組合、第十二引子對組合、第十三引子對組合、第十四引子對組合以及第十五引子對組合。其中，第一引子對組合係選自SEQ ID：1與SEQ ID：2之引子對及/或SEQ ID：3與SEQ ID：4之引子對，用以鑑別蔥薊馬。第二引子對組合係選自SEQ ID：5與SEQ ID：6之引子對及/或SEQ ID：7與SEQ ID：8之引子對，用以鑑別台灣花薊馬。第三引子對組合係選自SEQ ID：9與SEQ ID：10之引子對及/或SEQ ID：11與SEQ ID：12之引子對，用以鑑別稻薊馬。第四引子對組合係選自SEQ ID：13與SEQ ID：14之引子對及/或SEQ ID：15與SEQ ID：16之引子對，用以鑑別玉米薊馬。第五引子對組合係選自SEQ ID：17與SEQ ID：18之引子對及/或SEQ
ID：19與SEQ ID：20之引子對，用以鑑別司密蘭花薊馬。第六引子對組合係選自SEQ ID：21與SEQ ID：22之引子對及/或SEQ ID：23與SEQ ID：24之引子對，用以鑑別褐花薊馬。第七引子對組合係選自SEQ ID：25與SEQ ID：26之引子對及/或SEQ ID：27與SEQ ID：28之引子對，用以鑑別花薊馬。第八引子對組合係選自SEQ ID：29與SEQ ID：30之引子對及/或SEQ ID：31與SEQ ID：32之引子對，用以鑑別南黃薊馬。第九引子對組合係選自SEQ ID：33與SEQ ID：34之引子對及/或SEQ ID：35與SEQ ID：36之引子對，用以鑑別西方花薊馬。第十引子對組合係選自SEQ ID：37與SEQ ID：38之引子對及/或SEQ ID：39與SEQ ID：40之引子對，用以鑑別尖角薊馬。第十一引子對組合係選自SEQ ID：41與SEQ ID：42之引子對及/或SEQ ID：43與SEQ ID：44之引子對，用以鑑別菊花薊馬。第十二引子對組合係選自SEQ ID：45與SEQ ID：46之引子對及/或SEQ ID：47與SEQ ID：48之引子對，用以鑑別小黃薊馬。第十三引子對組合係選自SEQ ID：49與SEQ ID：50之引子對及/或SEQ ID：51與SEQ ID：52之引子對，用以鑑別豆花薊馬。第十四引子對組合係選自SEQ ID：53與SEQ ID：54之引子對及/或SEQ ID：55與SEQ ID：56之引子對，用以鑑別青蔥薊馬。第十五引子對組合係選自SEQ ID：57與SEQ ID：58之引子對及/或SEQ ID：59與SEQ ID：60之引子對，用以鑑別玫瑰花薊馬。以及與上述個別引子之衍生序列所組成之引子對。
依照本發明之實施方式，上述檢驗套組更包含序列如SEQ ID：63所示的引子與序列如SEQ ID：64所示的引子所組成之內部控制引子對、萃取薊馬樣本之去氧核醣核酸所需之試劑、進行聚合酶連鎖反應所需要的試劑，及/或進行電泳分析所需要之試劑。電泳分析包括但不限於洋菜瓊脂膠電泳或毛細管凝膠電泳。
使用鑑定十五種薊馬之檢驗套組的方法，包含使用至少十五對引子對進行聚合酶連鎖反應，藉由增幅出之目標核酸片段分子量大小，可快速鑑定十五種薊馬。所述之至少十五對引子對係分別選自第一引子對組合中之至少其中之一引子對、第二引子對組合中之至少其中之一引子對、第三引子對組合中之至少其中之一引子對、第四引子對組合中之至少其中之一引子對、第五引子對組合中之至少其中之一引子對、第六引子對組合中之至少其中之一引子對第七引子對組合中之至少其中之一引子對、第八引子對組合中之至少其中之一引子對、第九引子對組合中之至少其中之一引子對、第十引子對組合中之至少其中之一引子對、第十一引子對組合中之至少其中之一引子對、第十二引子對組合中之至少其中之一引子對、第十三引子對組合中之至少其中之一引子對、第十四引子對組合中之至少其中之一引子對、第十五引子對組合中之至少其中之一引子對。
本發明首先是收集十五種欲鑑別之薊馬樣本，再萃取薊馬的去氧核醣核酸，進行定序並分析各種薊馬的序
列，以設計可鑑定不同薊馬的專一性引子對。以下將分為兩大部分闡述本發明實施態樣之應用基礎及可行性：第一部分為揭示分析比對各薊馬之去氧核醣核酸序列，並設計各薊馬的專一性引子。第二部分則應用第一部分設計之引子，以實施例說明專一性引子可於多種薊馬中，運用於聚合酶連鎖反應專一性的鑑定其所對應之薊馬種類。
下列試驗例用於示範說明本發明，係用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對本發明範圍的限制，但用於如何實施本發明的材料及方法。
十五種薊馬分別為蔥薊馬(Thrips tabaci
,Ttab)、台灣花薊馬(Frankliniella intonsa
,Fint)、稻薊馬(Stenchaetothrips biformis
,Sbif)、玉米薊馬(Frankliniella williamsi
,Fwill)、司密蘭花薊馬(Dichromothrips smithi
,Dsmi)、褐花薊馬(Thrips florum
,Tflo)、花薊馬(Thrips hawaiiensis
,Thaw)、南黃薊馬(Thrips palmi
,Tpal)、西方花薊馬(Frankliniella occidentalis
,Focc)、尖角薊馬(Frankliniella cephalica
,Fcep)、菊花薊馬(Microcephalothrips abdominalis
,Mabd)、小黃薊馬(Scirtothrips dorsalis
,Sdor)、豆花薊馬(Megalurothrips usitatus
,Musi)、青蔥薊馬(Thrips alliorum
,Tall)、玫瑰花薊馬(Thrips fuscipennis
,Tfus)。收集之薊馬樣本主要係採
自台灣地區，僅玫瑰花薊馬及西方花薊馬為國外之薊馬樣本。將薊馬樣本浸泡於濃度為95%之乙醇，置於-20℃冷凍櫃中保存，以供後續實驗用。
分別萃取各種薊馬樣本之基因體去氧核醣核酸。首先將單隻薊馬樣本自酒精中取出，待酒精揮發後，放入1.5ml離心管中，將60μl的EPICENTRE® Biotechnologies Kit(Protec)純化試劑溶液加入離心管，震盪20秒後，再將離心管放入乾熱器內，以65℃，300rpm，反應15分鐘至20分鐘。之後，將離心管取出，震盪20秒，再放入乾熱器內，以98℃，300rpm，反應2分鐘。而後保存於-20℃冰箱中，以備用於聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction；PCR)。並將溶出去氧核醣核酸之薊馬樣本外骨骼製作成玻片標本，在玻片上標示採集日期及地點，做為存證標本。
接著利用如SEQ ID NO：61所示序列之引子及如SEQ ID NO：62所示序列之引子構成之引子對，進行聚合酶連鎖反應增幅薊馬樣本的間隔1區(intergenic spacer 1；ITS1)之去氧核醣核酸序列。反應物及試劑依下述比例進行：5μl含20mM MgCl2
之10X Taq緩衝液、0.4μl之25mM dNTP混合液、10μM之引子各1μl、1μl之Taq DNA polymerase(2U/μl)和4μl之去氧核醣核酸萃取液，最後加入滅菌之二次去離子水，調整總體積為50μl，將溶液混合均勻後進行聚合酶連鎖反應。反應條件為變性95℃反應2分鐘，接著進行35個周期之熱循環，包括變性95℃反應40秒、黏合45℃反應50秒、延長72℃反應40秒，之後
進行最終延長72℃反應10分鐘，終止溫度為4℃，再儲存於-20℃冰箱中備用。將增幅出之去氧核醣核酸片段以洋菜瓊脂膠電泳分離，以回收試劑純化洋菜瓊脂膠上之去氧核醣核酸片段，再經由核酸自動定序儀(Automatic sequencer)確定序列。
利用BioEdit程式軟體將各個分類單元的去氧核醣核酸序列放在一起比對分析，並搜尋多個物種序列差異，設計蔥薊馬、台灣花薊馬、稻薊馬、玉米薊馬、司密蘭花薊馬、褐花薊馬、花薊馬、南黃薊馬、西方花薊馬、尖角薊馬、菊花薊馬、小黃薊馬、豆花薊馬、青蔥薊馬、玫瑰花薊馬之專一性引子。利用不同薊馬之染色體ITS1去氧核醣核酸片段序列差異，設計可鑑定不同薊馬的專一性引子對，係選自具有如SEQ ID NO：1-60所示之序列。
因聚合酶連鎖反應本身之特性，引子與欲增幅之模版間之序列即便存在變異性，仍可藉調節聚合酶連鎖反應中黏合步驟之反應溫度而合成特定之去氧核醣核酸片段。故於本發明所屬技術領域中具一般知識之人士根據本發明之揭示，即可根據欲增幅之去氧核醣核酸片段設計不同之引子。因此，任何針對本發明實施例所述之個別引子所為之鹼基置換、加入或縮減所形成的引子，如其仍可與本發明實施例所述之相對應引子組成引子對而增幅出包含SEQ ID NO：65-94的特定片段，皆不脫離本發明所欲保護之範圍。
本發明所例示之實施例中，測試之薊馬樣本共15屬23種，包含蔥薊馬、台灣花薊馬、稻薊馬、玉米薊馬、司密蘭花薊馬、褐花薊馬、花薊馬、南黃薊馬、西方花薊馬、尖角薊馬、菊花薊馬、小黃薊馬、豆花薊馬、青蔥薊馬、玫瑰花薊馬、尤加律薊馬(Taeniothrips eucharii
,Teuc)、褐尾包薊馬(Bolacothrips graminis
,Bgra)、栗帶薊馬(Anaphothrips sudanensis
,Asud)、赤帶薊馬(Selenothrips rubrocinctus
,Srub)、蔗腹齒薊馬(Fulmekiola serrata
,Fser)、黑角貝薊馬(Bathrips melanicornis
,Bmel)、棉紋薊馬(Ayyaria chaetophora
,Acha)及腹鉤薊馬(Rhipiphorothrips cruentatus
,Rcru)。請參照表一，為本發明實施例中，不同種類之薊馬所對應的號碼。
經聚合酶連鎖反應增幅後，以洋菜瓊脂膠電泳分析增幅之去氧核醣核酸片段大小。聚合酶連鎖反應之反應物及試劑依下述比例進行：2.5μl含20mM MgCl2
之10XTaq
緩衝液、0.2μl之25mM dNTP混合液、10μM之引子各0.5μl、10μM之內部控制組引子各0.5μl、0.5μl之Taq
DNA polymerase(2U/μl)和2μl的去氧核醣核酸萃取液，最後加入滅菌之二次去離子水，調整總體積為25μl，將溶液混合均勻後進行聚合酶連鎖反應。反應條件為變性95℃反應2分鐘，接著進行35個周期之熱循環，包括變性95℃反應40秒、黏合60℃反應20秒、延長72℃反應20秒，之後進行最終延長72℃反應10分鐘，終止溫度為4℃。
依據本發明之第一實施例，第一引子對組合包含二種引子對組合，係選自SEQ ID NO：1-4所示序列之寡核苷酸引子，可用以鑑定蔥薊馬。其中，由SEQ ID NO：1序列與SEQ ID NO：2序列所組成之引子對，可於含蔥薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出418bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：65所示。另，由SEQ ID NO：3序列與SEQ ID NO：4序列所組成之引子對，可於含蔥薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出387bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：66所示。
請參照第1圖，為第一引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。其中M為去氧核醣核酸之分子量標記。泳道上號碼所對應的薊馬物種請參照表一。第1圖(A)部分為加入之引子對為SEQ ID NO：1序列與SEQ ID NO：2序列所組成之引子對，第1圖(B)部分為加入引子對SEQ ID NO：3序列與SEQ ID NO：4序列所組成之引子對。結果顯示，內部控制組引子可於16種薊馬樣本中增幅出520bp一致大小的去氧核醣核酸片段，僅蔥薊馬樣本額外增幅出一專一性去氧核醣核酸片段，其分子量大小分別為418bp和387bp。
依據本發明之第二實施例，第二引子對組合包含二種引子對組合，係選自SEQ ID NO：5-8所示序列之寡核苷酸引子，可用以鑑定台灣花薊馬。其中，由SEQ ID NO：5序列與SEQ ID NO：6序列所組成之引子對，可於含台灣花薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出425bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：67所示。另，由SEQ ID NO：7序列與SEQ ID NO：8序列所組成之引子對，可於含台灣花薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出437bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：68所示。
請參照第2圖，為第二引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。其中M為去氧核醣核酸之分子量標記。泳道上號碼所對應的薊馬物種請參照表
一。第2圖(A)部分為加入之引子對為SEQ ID NO：5序列與SEQ ID NO：6序列所組成之引子對，第2圖(B)部分為加入引子對SEQ ID NO：7序列與SEQ ID NO：8序列所組成之引子對。結果顯示，內部控制組引子可於16種薊馬樣本中增幅出一致的去氧核醣核酸片段，僅台灣花薊馬樣本額外增幅出一專一性去氧核醣核酸片段，其分子量大小分別為425bp和437bp。
依據本發明之第三實施例，第三引子對組合包含二種引子對組合，係選自SEQ ID NO：9-12所示序列之寡核苷酸引子，可用以鑑定稻薊馬。其中，由SEQ ID NO：9序列與SEQ ID NO：10序列所組成之引子對，可於含稻薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出319bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：69所示。另，由SEQ ID NO：11序列與SEQ ID NO：12序列所組成之引子對，可於含稻薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出139bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：70所示。
請參照第3圖，為第二引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。其中M為去氧核醣核酸之分子量標記。泳道上號碼所對應的薊馬物種請參照表一。第3圖(A)部分為加入之引子對為SEQ ID NO：9序列與SEQ ID NO：10序列所組成之引子對，第3圖(B)部分為加入引子對SEQ ID NO：11序列與SEQ ID NO：12序列所
組成之引子對。結果顯示，內部控制組引子可於16種薊馬樣本中增幅出一致的去氧核醣核酸片段，僅稻薊馬樣本額外增幅出一專一性去氧核醣核酸片段，其分子量大小分別為319bp和139bp。
依據本發明之第四實施例，第四引子對組合包含二種引子對組合，係選自SEQ ID NO：13-16所示序列之寡核苷酸引子，可用以鑑定玉米薊馬。其中，由SEQ ID NO：13序列與SEQ ID NO：14序列所組成之引子對，可於含玉米薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出374bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：71所示。另，由SEQ ID NO：15序列與SEQ ID NO：16序列所組成之引子對，可於含玉米薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出162bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：72所示。
請參照第4圖，為第二引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。其中M為去氧核醣核酸之分子量標記。泳道上號碼所對應的薊馬物種請參照表一。第4圖(A)部分為加入之引子對為SEQ ID NO：13序列與SEQ ID NO：14序列所組成之引子對，第4圖(B)部分為加入引子對SEQ ID NO：15序列與SEQ ID NO：16序列所組成之引子對。結果顯示，內部控制組引子可於16種薊馬樣本中增幅出一致的去氧核醣核酸片段，僅玉米薊馬樣本額外增幅出一專一性去氧核醣核酸片段，其分子量大小分
別為374bp和162bp。
依據本發明之第五實施例，第五引子對組合包含二種引子對組合，係選自SEQ ID NO：17-20所示序列之寡核苷酸引子，可用以鑑定司密蘭花薊馬。其中，由SEQ ID NO：17序列與SEQ ID NO：18序列所組成之引子對，可於含司密蘭花薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出253bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：73所示。另，由SEQ ID NO：19序列與SEQ ID NO：20序列所組成之引子對，可於含司密蘭花薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出384bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：74所示。
請參照第5圖，為第五引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。其中M為去氧核醣核酸之分子量標記。泳道上號碼所對應的薊馬物種請參照表一。第5圖(A)部分為加入之引子對為SEQ ID NO：17序列與SEQ ID NO：18序列所組成之引子對，第5圖(B)部分為加入引子對SEQ ID NO：19序列與SEQ ID NO：20序列所組成之引子對。結果顯示，內部控制組引子可於16種薊馬樣本中增幅出一致的去氧核醣核酸片段，僅司密蘭花薊馬樣本額外增幅出一專一性去氧核醣核酸片段，其分子量大小分別為253bp和384bp。
依據本發明之第六實施例，第六引子對組合包含二
種引子對組合，係選自SEQ ID NO：21-24所示序列之寡核苷酸引子，可用以鑑定褐花薊馬。其中，由SEQ ID NO：21序列與SEQ ID NO：22序列所組成之引子對，可於含褐花薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出414bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：75所示。另，由SEQ ID NO：23序列與SEQ ID NO：24序列所組成之引子對，可於含褐花薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出314bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：76所示。
請參照第6圖，為第六引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。其中M為去氧核醣核酸之分子量標記。泳道上號碼所對應的薊馬物種請參照表一。第6圖(A)部分為加入之引子對為SEQ ID NO：21序列與SEQ ID NO：22序列所組成之引子對，第6圖(B)部分為加入引子對SEQ ID NO：23序列與SEQ ID NO：24序列所組成之引子對。結果顯示，內部控制組引子可於16種薊馬樣本中增幅出一致的去氧核醣核酸片段，僅褐花薊馬樣本額外增幅出一專一性去氧核醣核酸片段，其分子量大小分別為414bp和314bp。
依據本發明之第七實施例，第七引子對組合包含二種引子對組合，係選自SEQ ID NO：25-28所示序列之寡核苷酸引子，可用以鑑定花薊馬。其中，由SEQ ID NO：25序列與SEQ ID NO：26序列所組成之引子對，可於含花薊
馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出267bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：77所示。另，由SEQ ID NO：27序列與SEQ ID NO：28序列所組成之引子對，可於含花薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出356bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：78所示。
請參照第7圖，為第七引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。其中M為去氧核醣核酸之分子量標記。泳道上號碼所對應的薊馬物種請參照表一。第7圖(A)部分為加入之引子對為SEQ ID NO：25序列與SEQ ID NO：26序列所組成之引子對，第7圖(B)部分為加入引子對SEQ ID NO：27序列與SEQ ID NO：28序列所組成之引子對。結果顯示，內部控制組引子可於16種薊馬樣本中增幅出一致的去氧核醣核酸片段，僅花薊馬樣本額外增幅出一專一性去氧核醣核酸片段，其分子量大小分別為267bp和356bp。
依據本發明之第八實施例，第八引子對組合包含二種引子對組合，係選自SEQ ID NO：29-32所示序列之寡核苷酸引子，可用以鑑定南黃薊馬。其中，由SEQ ID NO：29序列與SEQ ID NO：30序列所組成之引子對，可於含南黃薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出149bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：79所示。另，由SEQ ID NO：31序列與SEQ ID NO：32序列所組成
之引子對，可於含南黃薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出305bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：80所示。
請參照第8圖，為第八引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。其中M為去氧核醣核酸之分子量標記。泳道上號碼所對應的薊馬物種請參照表一。第8圖(A)部分為加入之引子對為SEQ ID NO：29序列與SEQ ID NO：30序列所組成之引子對，第8圖(B)部分為加入引子對SEQ ID NO：31序列與SEQ ID NO：32序列所組成之引子對。結果顯示，內部控制組引子可於16種薊馬樣本中增幅出一致的去氧核醣核酸片段，僅南黃薊馬樣本額外增幅出一專一性去氧核醣核酸片段，其分子量大小分別為149bp和305bp。
依據本發明之第九實施例，第九引子對組合包含二種引子對組合，係選自SEQ ID NO：33-36所示序列之寡核苷酸引子，可用以鑑定西方花薊馬。其中，由SEQ ID NO：33序列與SEQ ID NO：34序列所組成之引子對，可於含西方花薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出382bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：81所示。另，由SEQ ID NO：35序列與SEQ ID NO：36序列所組成之引子對，可於含西方花薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出226bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：82所示。
請參照第9圖，為第九引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。其中M為去氧核醣核酸之分子量標記。泳道上號碼所對應的薊馬物種請參照表一。第9圖(A)部分為加入之引子對為SEQ ID NO：33序列與SEQ ID NO：34序列所組成之引子對，第9圖(B)部分為加入引子對SEQ ID NO：35序列與SEQ ID NO：36序列所組成之引子對。結果顯示，內部控制組引子可於16種薊馬樣本中增幅出一致的去氧核醣核酸片段，僅西方花薊馬樣本額外增幅出一專一性去氧核醣核酸片段，其分子量大小分別為382bp和226bp。
依據本發明之第十實施例，第十引子對組合包含二種引子對組合，係選自SEQ ID NO：37-40所示序列之寡核苷酸引子，可用以鑑定尖角薊馬。其中，由SEQ ID NO：37序列與SEQ ID NO：38序列所組成之引子對，可於含尖角薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出462bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：83所示。另，由SEQ ID NO：39序列與SEQ ID NO：40序列所組成之引子對，可於含尖角薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出239bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：84所示。
請參照第10圖，為第十引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。其中M為去氧核醣核酸之分子量標記。泳道上號碼所對應的薊馬物種請參照表
一。第10圖(A)部分為加入之引子對為SEQ ID NO：37序列與SEQ ID NO：38序列所組成之引子對，第10圖(B)部分為加入引子對SEQ ID NO：39序列與SEQ ID NO：40序列所組成之引子對。結果顯示，內部控制組引子可於15種薊馬樣本中增幅出一致的去氧核醣核酸片段，僅尖角薊馬樣本額外增幅出一專一性去氧核醣核酸片段，其分子量大小分別為462bp和239bp。
依據本發明之第十一實施例，第十一引子對組合包含二種引子對組合，係選自SEQ ID NO：41-44所示序列之寡核苷酸引子，可用以鑑定菊花薊馬。其中，由SEQ ID NO：41序列與SEQ ID NO：42序列所組成之引子對，可於含台灣菊花薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出216bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：85所示。另，由SEQ ID NO：43序列與SEQ ID NO：44序列所組成之引子對，可於含菊花薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出333bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：86所示。
請參照第11圖，為第十一引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。其中M為去氧核醣核酸之分子量標記。泳道上號碼所對應的薊馬物種請參照表一。第11圖(A)部分為加入之引子對為SEQ ID NO：41序列與SEQ ID NO：42序列所組成之引子對，第11圖(B)部分為加入引子對SEQ ID NO：43序列與SEQ ID NO：44
序列所組成之引子對。結果顯示，內部控制組引子可於16種薊馬樣本中增幅出一致的去氧核醣核酸片段，僅菊花薊馬樣本額外增幅出一專一性去氧核醣核酸片段，其分子量大小分別為216bp和333bp。
依據本發明之第十二實施例，第十二引子對組合包含二種引子對組合，係選自SEQ ID NO：45-48所示序列之寡核苷酸引子，可用以鑑定小黃薊馬。其中，由SEQ ID NO：45序列與SEQ ID NO：46序列所組成之引子對，可於含小黃薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出305bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：87所示。另，由SEQ ID NO：47序列與SEQ ID NO：48序列所組成之引子對，可於含小黃薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出406bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：88所示。
請參照第12圖，為第十二引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。其中M為去氧核醣核酸之分子量標記。泳道上號碼所對應的薊馬物種請參照表一。第12圖(A)部分為加入之引子對為SEQ ID NO：45序列與SEQ ID NO：46序列所組成之引子對，第12圖(B)部分為加入之引子對為SEQ ID NO：47序列與SEQ ID NO：48序列所組成之引子對。結果顯示，內部控制組引子可於16種薊馬樣本中增幅出一致的去氧核醣核酸片段，僅小黃薊馬樣本額外增幅出一專一性去氧核醣核酸片段，其分子
量大小為305bp和406bp。
依據本發明之第十三實施例，第十三引子對組合包含二種引子對組合，係選自SEQ ID NO：49-52所示序列之寡核苷酸引子，可用以鑑定豆花薊馬。其中，由SEQ ID NO：49序列與SEQ ID NO：50序列所組成之引子對，可於含豆花薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出376bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：89所示。另，由SEQ ID NO：51序列與SEQ ID NO：52序列所組成之引子對，可於含豆花薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出179bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：90所示。
請參照第13圖，為第十三引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。其中M為去氧核醣核酸之分子量標記。泳道上號碼所對應的薊馬物種請參照表一。第13圖(A)部分為加入之引子對為SEQ ID NO：49序列與SEQ ID NO：50序列所組成之引子對，第13圖(B)部分為加入引子對SEQ ID NO：51序列與SEQ ID NO：52序列所組成之引子對。結果顯示，內部控制組引子可於上述16種薊馬樣本中增幅出一致的去氧核醣核酸片段，僅泳道16的豆花薊馬樣本額外增幅出一專一性去氧核醣核酸片段，其分子量大小分別為376bp和179bp。
依據本發明之第十四實施例，第十四引子對組合包
含二種引子對組合，係選自SEQ ID NO：53-56所示序列之寡核苷酸引子，可用以鑑定青蔥薊馬。其中，由SEQ ID NO：53序列與SEQ ID NO：54序列所組成之引子對，可於含青蔥薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出254bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：91所示。另，由SEQ ID NO：55序列與SEQ ID NO：56序列所組成之引子對，可於含青蔥薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出326bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：92所示。
請參照第14圖，為第十四引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。其中M為去氧核醣核酸之分子量標記。泳道上號碼所對應的薊馬物種請參照表一。第14圖(A)部分為加入之引子對為SEQ ID NO：53序列與SEQ ID NO：54序列所組成之引子對，第14圖(B)部分為加入之引子對為SEQ ID NO：55序列與SEQ ID NO：56序列所組成之引子對。結果顯示，內部控制組引子可於16種薊馬樣本中增幅出一致的去氧核醣核酸片段，僅青蔥薊馬樣本額外增幅出一專一性去氧核醣核酸片段，其分子量大小為254bp和326bp。
依據本發明之第十五實施例，第十五引子對組合包含二種引子對組合，係選自SEQ ID NO：57-60所示序列之寡核苷酸引子，可用以鑑定玫瑰花薊馬。其中，由SEQ ID NO：57序列與SEQ ID NO：58序列所組成之引子對，可
於含玫瑰花薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出234bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：93所示。另，由SEQ ID NO：59序列與SEQ ID NO：60序列所組成之引子對，可於含玫瑰花薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出171bp的片段，所增幅之特定去氧核醣核酸片段序列如SEQ ID NO：94所示。
請參照第15圖，為第十五引子對組合對各種薊馬樣本的測試結果之洋菜瓊脂膠電泳圖。其中M為去氧核醣核酸之分子量標記。泳道上號碼所對應的薊馬物種請參照表一。第15圖(A)部分為加入之引子對為SEQ ID NO：57序列與SEQ ID NO：58序列所組成之引子對，第15圖(B)部分為加入引子對SEQ ID NO：59序列與SEQ ID NO：60序列所組成之引子對。結果顯示，內部控制組引子可於16種薊馬樣本中增幅出一致的去氧核醣核酸片段，僅玫瑰花薊馬樣本額外增幅出一專一性去氧核醣核酸片段，其分子量大小分別為234bp和171bp。
根據上述，本發明係運用分子生物學技術，利用不同薊馬種類於基因體分子層次上的差異，設計具有專一性之寡核苷酸引子對，用以快速、準確鑑定不同薊馬害蟲。本發明之檢驗套組及其方法不僅靈敏度高且具鑑定之特異性，可快速鑑別包含蔥薊馬、台灣花薊馬、稻薊馬、玉米薊馬、司密蘭花薊馬、褐花薊馬、花薊馬、南黃薊馬、西方花薊馬、尖角薊馬、菊花薊馬、小黃薊馬、豆花薊馬、青蔥薊馬及玫瑰花薊馬等十五種薊馬，優於傳統形態鑑定
之不確定性。
本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
<110> 國立中興大學
<120> 鑑定薊馬之檢驗套組及其方法
<160> 94
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅蔥薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅蔥薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 2
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅蔥薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 3
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅蔥薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 4
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅台灣花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 5
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅台灣花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 6
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅台灣花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 7
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅台灣花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 8
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅稻薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 9
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅稻薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 10
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅稻薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 11
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅稻薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 12
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅玉米薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 13
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅玉米薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 14
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅玉米薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 15
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅玉米薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 16
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅司密蘭花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 17
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅司密蘭花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 18
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅司密蘭花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅司密蘭花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅褐花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅褐花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 22
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅褐花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 23
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅褐花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 24
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 25
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 26
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 27
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 28
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅南黃薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 29
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅南黃薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 30
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅南黃薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 31
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅南黃薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 32
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅西方花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 33
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅西方花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 34
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅西方花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 35
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅西方花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 36
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅尖角薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 37
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅尖角薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 38
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅尖角薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 39
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅尖角薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 40
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅菊花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 41
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅菊花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 42
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅菊花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 43
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅菊花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 44
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅小黃薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 45
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅小黃薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 46
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅小黃薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 47
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅小黃薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 48
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅豆花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 49
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅豆花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 50
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅豆花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 51
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅豆花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 52
<210> 53
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅青蔥薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 53
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅青蔥薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 54
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅青蔥薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 55
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅青蔥薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 56
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅玫瑰花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 57
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅玫瑰花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 58
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅玫瑰花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 59
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅玫瑰花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 60
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400> 61
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400> 62
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的內部控制組引子(forward)
<400> 63
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅薊馬ITS1去氧核醣核酸片段的內部控制組引子(reversed)
<400> 64
<210> 65
<211> 418
<212> DNA
<213>Thrips tabaci
<223> 增幅之蔥薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段1
<400> 65
<210> 66
<211> 387
<212> DNA
<213>Thrips tabaci
<223> 增幅之蔥薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段2
<400> 66
<210> 67
<211> 425
<212> DNA
<213>Frankliniella intonsa
<223> 增幅之台灣花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段1
<400> 67
<210> 68
<211> 437
<212> DNA
<213>Frankliniella intonsa
<223> 增幅之台灣花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段2
<400> 68
<210> 69
<211> 319
<212> DNA
<213>Stenchaetothrips biformis
<223> 增幅之稻薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段1
<400> 69
<210> 70
<211> 139
<212> DNA
<213>Stenchaetothrips biformis
<223> 增幅之稻薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段2
<400> 70
<210> 71
<211> 374
<212> DNA
<213>Frankliniella williamsi
<223> 增幅之玉米薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段1
<400> 71
<210> 72
<211> 162
<212> DNA
<213>Frankliniella williamsi
<223> 增幅之玉米薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段2
<400> 72
<210> 73
<211> 253
<212> DNA
<213>Dichromothrips smithi
<223> 增幅之司密蘭花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段1
<400> 73
<210> 74
<211> 384
<212> DNA
<213>Dichromothrips smithi
<223> 增幅之司密蘭花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段2
<400> 74
<210> 75
<211> 414
<212> DNA
<213>Thrips florum
<223> 增幅之褐花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段1
<400> 75
<210> 76
<211> 314
<212> DNA
<213>Thrips florum
<223> 增幅之褐花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段2
<400> 76
<210> 77
<211> 267
<212> DNA
<213>Thrips hawaiiensis
<223> 增幅之花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段1
<400> 77
<210> 78
<211> 356
<212> DNA
<213>Thrips hawaiiensis
<223> 增幅之花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段2
<400> 78
<210> 79
<211> 149
<212> DNA
<213>Thrips palmi
<223> 增幅之南黃薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段1
<400> 79
<210> 80
<211> 305
<212> DNA
<213>Thrips palmi
<223> 增幅之南黃薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段2
<400> 80
<210> 81
<211> 382
<212> DNA
<213>Frankliniella occidentalis
<223> 增幅之西方花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段1
<400> 81
<210> 82
<211> 226
<212> DNA
<213>Frankliniella occidentalis
<223> 增幅之西方花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段2
<400> 82
<210> 83
<211> 462
<212> DNA
<213>Frankliniella cephalica
<223> 增幅之尖角薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段1
<400> 83
<210> 84
<211> 239
<212> DNA
<213>Frankliniella cephalica
<223> 增幅之尖角薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段2
<400> 84
<210> 85
<211> 216
<212> DNA
<213>Microcephalothrips abdominalis
<223> 增幅之菊花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段1
<400> 85
<210> 86
<211> 333
<212> DNA
<213>Microcephalothrips abdominalis
<223> 增幅之菊花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段2
<400> 86
<210> 87
<211> 305
<212> DNA
<213>Scirtothrips dorsalis
<223> 增幅之小黃薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段1
<400> 87
<210> 88
<211> 406
<212> DNA
<213>Scirtothrips dorsalis
<223> 增幅之小黃薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段2
<400> 88
<210> 89
<211> 376
<212> DNA
<213>Megalurothrips usitatus
<223> 增幅之豆花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段1
<400> 89
<210> 90
<211> 179
<212> DNA
<213>Megalurothrips usitatus
<223> 增幅之豆花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段2
<400> 90
<210> 91
<211> 254
<212> DNA
<213>Thrips alliorum
<223> 增幅之青蔥薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段1
<400> 91
<210> 92
<211> 326
<212> DNA
<213>Thrips alliorum
<223> 增幅之青蔥薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段2
<400> 92
<210> 93
<211> 234
<212> DNA
<213>Thrips fuscipennis
<223> 增幅之玫瑰花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段1
<400> 93
<210> 94
<211> 171
<212> DNA
<213>Thrips fuscipennis
<223> 增幅之玫瑰花薊馬ITS1去氧核醣核酸片段序列片段2
<400> 94
Claims (7)
- 一種鑑定十五種薊馬之檢驗套組，包含：一第一引子對組合，為SEQ ID：1與SEQ ID：2之引子對或SEQ ID：3與SEQ ID：4之引子對，用以鑑別蔥薊馬；一第二引子對組合，為SEQ ID：5與SEQ ID：6之引子對或SEQ ID：7與SEQ ID：8之引子對，用以鑑別台灣花薊馬；一第三引子對組合，為SEQ ID：9與SEQ ID：10之引子對或SEQ ID：11與SEQ ID：12之引子對，用以鑑別稻薊馬；一第四引子對組合，為SEQ ID：13與SEQ ID：14之引子對或SEQ ID：15與SEQ ID：16之引子對，用以鑑別玉米薊馬；一第五引子對組合，為SEQ ID：17與SEQ ID：18之引子對或SEQ ID：19與SEQ ID：20之引子對，用以鑑別司密蘭花薊馬；一第六引子對組合，為SEQ ID：21與SEQ ID：22之引子對或SEQ ID：23與SEQ ID：24之引子對，用以鑑別褐花薊馬；一第七引子對組合，為SEQ ID：25與SEQ ID：26之引子對或SEQ ID：27與SEQ ID：28之引子對，用以鑑別花薊馬； 一第八引子對組合，為SEQ ID：29與SEQ ID：30之引子對或SEQ ID：31與SEQ ID：32之引子對，用以鑑別南黃薊馬；一第九引子對組合，為SEQ ID：33與SEQ ID：34之引子對或SEQ ID：35與SEQ ID：36之引子對，用以鑑別西方花薊馬；一第十引子對組合，為SEQ ID：37與SEQ ID：38之引子對或SEQ ID：39與SEQ ID：40之引子對，用以鑑別尖角薊馬；一第十一引子對組合，為SEQ ID：41與SEQ ID：42之引子對或SEQ ID：43與SEQ ID：44之引子對，用以鑑別菊花薊馬；一第十二引子對組合，為SEQ ID：45與SEQ ID：46之引子對或SEQ ID：47與SEQ ID：48之引子對，用以鑑別小黃薊馬；一第十三引子對組合，為SEQ ID：49與SEQ ID：50之引子對或SEQ ID：51與SEQ ID：52之引子對，用以鑑別豆花薊馬；一第十四引子對組合，為SEQ ID：53與SEQ ID：54之引子對或SEQ ID：55與SEQ ID：56之引子對，用以鑑別青蔥薊馬；以及一第十五引子對組合，為SEQ ID：57與SEQ ID：58之引子對或SEQ ID：59與SEQ ID：60之引子對，用以鑑別玫瑰花薊馬。
- 如請求項1所述之鑑定十五種薊馬之檢驗套組，更包含至少一內部控制引子對，該內部控制引子對由具有如SEQ ID：63所示之序列的引子與具有如SEQ ID：64所示之序列的引子組成。
- 如請求項1所述之鑑定十五種薊馬之檢驗套組，更包含萃取一薊馬樣本之去氧核醣核酸所需之一試劑。
- 如請求項1所述之鑑定十五種薊馬之檢驗套組，更包含進行聚合酶連鎖反應所需要之一試劑。
- 如請求項1所述之鑑定十五種薊馬之檢驗套組，更包含進行電泳分析所需要之一試劑。
- 一種鑑定十五種薊馬之方法，包含：提供一薊馬樣本之去氧核醣核酸做為一模版；使用十五對引子對與該模版進行聚合酶連鎖反應，所述之十五對引子對係為如請求項1至5任一項所述之第一引子對組合、第二引子對組合、第三引子對組合、第四引子對組合、第五引子對組合、第六引子對組合、第七引子對組合、第八引子對組合、第九引子對組合、第十引子對組合、第十一引子對組合、第十二引子對組合、第十三引子對組合、第十四引子對組合及第十五引子對組合；以及分析聚合酶連鎖反應增幅之一目標核酸片段之分子量 大小判斷該薊馬樣本之種類，其中：該目標核酸片段之分子量大小為418bp或387bp，該薊馬樣本為蔥薊馬；該目標核酸片段之分子量大小為425bp或437bp，該薊馬樣本為台灣花薊馬；該目標核酸片段之分子量大小為319bp或139bp，該薊馬樣本為稻薊馬；該目標核酸片段之分子量大小為374bp或162bp，該薊馬樣本為玉米薊馬；該目標核酸片段之分子量大小為253bp或384bp，該薊馬樣本為司密蘭花薊馬；該目標核酸片段之分子量大小為414bp或314bp，該薊馬樣本為褐花薊馬；該目標核酸片段之分子量大小為267bp或356bp，該薊馬樣本為花薊馬；該目標核酸片段之分子量大小為149bp或305bp，該薊馬樣本為南黃薊馬；該目標核酸片段之分子量大小為382bp或226bp，該薊馬樣本為西方花薊馬；該目標核酸片段之分子量大小為462bp或239bp，該薊馬樣本為尖角薊馬；該目標核酸片段之分子量大小為216bp或333bp，該薊馬樣本為菊薊馬；該目標核酸片段之分子量大小為305bp或406bp，該薊馬樣本為小黃薊馬；該目標核酸片段之分子量大小為376bp或179bp，該薊馬樣本為豆花薊馬；該目標核酸片段之分子量大小為254bp或326bp，該薊馬樣本為青蔥薊馬；及該目標核酸片段之分子量大小為234bp或171bp，該薊馬樣本為玫瑰花薊馬。
- 如請求項6所述之鑑定十五種薊馬之方法，其中該模版係為該薊馬樣本之ITS1基因片段。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| TW103109625A TWI495728B (zh) | 2014-03-14 | 2014-03-14 | 鑑定薊馬之檢驗套組及其方法 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW103109625A TWI495728B (zh) | 2014-03-14 | 2014-03-14 | 鑑定薊馬之檢驗套組及其方法 |
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|---|---|
| TWI495728B true TWI495728B (zh) | 2015-08-11 |
| TW201534731A TW201534731A (zh) | 2015-09-16 |
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ID=54343322
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| CN110283917A (zh) * | 2019-07-24 | 2019-09-27 | 南昌师范高等专科学校 | 一种快速检测鉴定茶黄蓟马的lamp引物组及方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| TW201307568A (zh) * | 2011-08-08 | 2013-02-16 | Univ Nat Chunghsing | 鑑別薊馬種類之方法 |
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2014
- 2014-03-14 TW TW103109625A patent/TWI495728B/zh not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 劉逸琪，應用分生技術快速鑑定西方花薊馬，動植物防疫檢疫季刊，2004年8月，第22-25頁 第22頁第2段、第23頁第1段 * |
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| Publication number | Publication date |
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| TW201534731A (zh) | 2015-09-16 |
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