TWI480376B - 鑑別薊馬種類之方法 - Google Patents
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Description
本發明是有關於一種用於鑑別薊馬種類之方法，特別是有關於一種利用多對引子對聚合酶連鎖反應同步鑑別多種薊馬種類之方法。
薊馬(Thrip)是一種靠植物汁液維生的昆蟲，其屬於昆蟲綱纓翅目。薊馬的個體小，行動敏捷，且具有隱匿性，多生活在植物花中取食花粉和花蜜，或以植物的嫩梢、葉片及果實為生，而造成葉子與花朵的損傷，成為農作物、花卉及林果的一害。
薊馬在農作物上之危害，在最近數年來愈來愈趨於嚴重，舉凡花卉、蔬菜、果樹等均有不同種類的薊馬存在，除直接刺吸危害外，且傳播病毒病，造成農業生產上重大的損失。
薊馬之鑑別方式，可藉由傳統生物學特徵的鑑別方法或應用分子生物學的技術進行鑑定。然而，利用傳統生物學特徵鑑別方法進行鑑定，所需時間長；而目前應用分子生物學的技術一次試驗僅能測試單一種薊馬的可能性。
因此，本發明提供一種用於鑑定薊馬種類之方法，可以在單一試驗中以多種薊馬的引子對鑑定薊馬的種類。
本發明之一態樣是在提供一種用於在一包含不同種屬薊馬的群組中鑑別澳洲疫薊馬及玫瑰花薊馬之套組，其中
該不同種屬薊馬群組係由澳洲疫薊馬(Thrips imgginis
)、玫瑰花薊馬(Thrips fuscipennis
)、豆花薊馬(Megalurothrips usitatus
)、稻薊馬(Stenchaetothrips biformis
)、小黃薊馬(Scirtothrips dorsalis
)、青蔥薊馬(Thrips alliorum
)、台灣花薊馬(Frankliniella intonsa
)、西方花薊馬(Frankliniella occidentalis
)、花薊馬(Thrips hawaiiensis
)、蔥薊馬(Thrips tabaci
)、黑角貝薊馬(Bathrips melanicornis
)、司密蘭花薊馬(Dichromothrips smithi
)、褐尾包薊馬(Bolacothrips graminis
)、菊花薊馬(Microcephalothrips abdominalis
)、腹鉤薊馬(Rhipiphorothrips cruentatus
)、尤加律薊馬(Taeniothrips eucharii
)、赤帶薊馬(Selenothrips rubrocinctus
)、直毛薊馬屬(Stenchaetothrips sp
.)、玉米薊馬(Frankliniella williamsi
)、蔗腹齒薊馬(Fulmekiola serrata
)、南黃薊馬(Thrips palmi
)、赤帶薊馬(Selenothrips rubrocinctus
)、網紋薊馬屬(Helionothrips sp
.)、棉紋薊馬(Ayyaria chaetophora
)、板背薊馬屬(Hydatothrip sp
.)、栗帶薊馬(Anaphothrips sudanensis
)、梳缺花薊馬屬(Frankliniella schultzei
)所組成，此套組包含二對引子對：第一引子對，其中該第一引子對為具有如序列辨識編號3所示序列與具有如序列辨識編號4所示序列之一第五引子對，或具有如序列辨識編號6所示序列與具有如序列辨識編號7所示序列之一第六引子對。以及第二引子對，具有如序列辨識編號14所示序列與具有如序列辨識編號15所示序列之引子對。
本發明之另一態樣是在提供一種在一包含不同種屬薊馬的群組中鑑別澳洲疫薊馬及玫瑰花薊馬種類之方法，其
中該不同種屬薊馬群組係由澳洲疫薊馬(Thrips imaginis
)、玫瑰花薊馬(Thrips fuscipennis
)、豆花薊馬(Megalurothrips usitatus
)、稻薊馬(Stenchaetothrips biformis
)、小黃薊馬(Scirtothrips dorsalis
)、青蔥薊馬(Thrips alliorum
)、台灣花薊馬(Frankliniella intonsa
)、西方花薊馬(Frankliniella occidentalis
)、花薊馬(Thrips hawaiiensis
)、蔥薊馬(Thrips tabaci
)、黑角貝薊馬(Bathrips melanicornis
)、司密蘭花薊馬(Dichromothrips smithi
)、褐尾包薊馬(Bolacothrips graminis
)、菊花薊馬(Microcephalothrips abdominalis
)、腹鉤薊馬(Rhipiphorothrips cruentatus
)、尤加律薊馬(Taeniothrips eucharii
)、赤帶薊馬(Selehothrips rubrocinctus
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.)、玉米薊馬(Frankliniella williamsi
)、蔗腹齒薊馬(Fulmekiola serrata
)、南黃薊馬(Thrips palmi
)、赤帶薊馬(Selenothrips rubrocinctus
)、網紋薊馬屬(Helionothrips sp
.)、棉紋薊馬(Ayyaria chaetophora
)、板背薊馬屬(Hydatothrip sp
.)、栗帶薊馬(Anaphothrips sudanensis
)、梳缺花薊馬屬(Frankliniella schultzei
)所組成，該方法包含萃取一薊馬樣本之基因體去氧核醣核酸，再以二對引子對進行多對引子對聚合酶連鎖反應，其中二對引子包含：第一引子對，其中該第一引子對為具有如序列辨識編號3所示序列與具有如序列辨識編號4所示序列之一第五引子對，或具有如序列辨識編號6所示序列與具有如序列辨識編號7所示序列之一第六引子對；以及第二引子對，具有如序列辨識編號14所示序列與具有如序列辨識編號15所示序列之引子對。之後，以多對引子對聚合酶連鎖反應結果有無增幅出核酸片段為基礎，
判斷該或該些薊馬樣本中是否包含澳洲疫薊馬或玫瑰花薊馬，以及根據增幅出的核酸片段判斷該薊馬樣本之種類。
依據本發明之一實施方式，上述用於鑑定薊馬種類之套組或方法，更至少包含內部控制引子對，且此內部控制引子對具有如序列辨識編號20所示序列與具有如序列辨識編號21所示序列之第九引子對。
依據本實施方式之一實施例，其中利用瓊脂膠體電泳比對該至少一核酸片段之大小。
依據本實施方式之一實施例，其中利用去氧核醣核酸定序比對該至少一核酸片段之核酸序列。
根據上述可知，本發明實施例之方法排除使用單一引子對進行鑑定，而是採用多對引子對聚合酶連鎖反應，可同步快速且準確地鑑定薊馬的種類。
本發明首先是收集四種欲鑑別之薊馬樣本，再萃取薊馬的去氧核醣核酸，進行定序並分析各種薊馬的序列，以設計各薊馬之專一性引子。藉由設計出的引子對，可進行多對引子對聚合酶連鎖反應(multiplex PCR)。
以下將分為兩大部分闡述本發明實施態樣之應用基礎及可行性：第一部分為揭示分析比對各薊馬之去氧核醣核酸序列，並設計各薊馬的專一性引子，以建立專一性引子可運用於多對引子對聚合酶連鎖反應以同步鑑別多種薊馬之應用基礎；
第二部分則應用第一部分設計之引子，以實施例說明以多對引子對聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之方法，以供產業應用。
四種薊馬分別為玫瑰花薊馬(Thrips fuscipennis
,Tfus)、西方花薊馬(Frankliniella occidentalis
,Focc)、蔥薊馬(Thrips tabaci
,Ttab)和澳洲疫薊馬(Thrips imaginis
,Tima)。蔥薊馬標本係採自台灣及太平洋地區國家，而西方花薊馬、玫瑰花薊馬、澳洲疫薊馬則分別來自美國、加拿大及澳洲之薊馬標本。
首先，分別萃取各種薊馬之基因體去氧核醣核酸，萃取方法係參考Yeh et al.(1997)之方法略加修改而成。首先將單隻薊馬自酒精中取出，待酒精揮發後，放入1.5ml離心管中，將60μl的EPICENTRE®
Biotechnologies Kit(Protec)純化試劑溶液加入離心管，震盪20秒後，再將離心管放入乾熱器內，以65℃，300rpm，反應15分鐘至20分鐘。之後，將離心管取出，震盪20秒，再放入乾熱器內，以98℃，300rpm，反應2分鐘。而後保存於-20℃冰箱中，以備用於聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction；PCR)。
接著利用引子對序列辨識編號1及序列辨識編號2以聚合酶連鎖反應增幅薊馬的間隔2區(intergenic spacer 2；ITS2)序列片段。反應物及試劑依下述比例進行：5μl之10XTaq
緩衝液(含20mM MgCl2
)、0.4μl之25mM dNTP混合
液、10μM之引子各1μl、1μl之Taq
DNA polymerase(2U/μl)和4μl的基因體去氧核醣核酸萃取液，最後加入滅菌之二次去離子水，調整總體積為50μl，將溶液混合均勻後進行聚合酶連鎖反應。反應條件為變性95℃反應2分鐘，接著進行35個周期之熱循環，包括變性95℃反應40秒、黏合45℃反應50秒、延長72℃反應40秒，之後進行最終延長72℃反應10分鐘，終止溫度為4℃，再儲存於-20℃冰箱中備用。
PCR產物回收可以瓊脂醣膠體電泳進行分離。將含有目標片段之膠體切下，並利用本技術領域中常用回收DNA的方法或商品化套組進行回收。回收所得之去氧核醣核酸經核酸自動定序儀(Automatic sequencer)進行定序。
接著，利用BioEdit(1999)軟體比對分析各個增幅出之間隔2區序列片段，並搜尋各薊馬間序列差異之處以設計各薊馬之專一性引子。設計出的專一性引子分別用16屬21種薊馬進行測試，以檢測專一性引子的專一性及穩定性。
以澳洲疫薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，利用引子對序列辨識編號3及序列辨識編號4，可增幅出序列辨識編號5之片段。而利用引子對序列辨識編號6及序列辨識編號7，可增幅出序列辨識編號8之片段。
請參照第1(A)圖與第1(B)圖，其為澳洲疫薊馬專一性引子對各種薊馬的測試結果。第1(A)圖為以13屬21種薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，利用引子對序列辨識編號3及序列辨識編號4進行增幅，再以瓊脂醣膠體電泳分
離增幅出之片段；第1(B)圖則為以13屬21種薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，利用引子對序列辨識編號6及序列辨識編號7進行增幅，再以瓊脂醣膠體電泳分離增幅出之片段。
聚合酶連鎖反應之反應物及試劑依下述比例進行：2.5μl之10XTaq
緩衝液(含20mM MgCl2
)、0.2μl之25mM dNTP混合液、10μM之引子各0.5μl、0.5μl之Taq
DNA polymerase(2U/μl)和2μl的基因體去氧核醣核酸萃取液，最後加入滅菌之二次去離子水，調整總體積為25μl，將溶液混合均勻後進行聚合酶連鎖反應。反應條件為變性95℃反應2分鐘，接著進行35個周期之熱循環，包括變性95℃反應40秒、黏合60℃反應20秒、延長72℃反應20秒，之後進行最終延長72℃反應10分鐘，終止溫度為4℃。
第1(A)圖與第1(B)圖中的M為去氧核醣核酸之分子量標記，泳道1為豆花薊馬(Megalurothrips usitatus
)，泳道2為稻薊馬(Stenchaetothrips biformis
)，泳道3為小黃薊馬(Scirtothrips dorsalis
)，泳道4為青蔥薊馬(Thrips alliorum
)，泳道5為台灣花薊馬(Frankliniella intonsa
)，泳道6為西方花薊馬(Frankliniella occidentalis
)，泳道7為花薊馬(Thrips hawaiiensis
)，泳道8為澳洲疫薊馬(Thrips imaginis
)，泳道9為蔥薊馬(Thrips tabaci
)，10泳道為黑角貝薊馬(Bathrips melanicornis
)，泳道11為司密蘭花薊馬(Dichromothrips smithi
)，泳道12為褐尾包薊馬(Bolacothrips graminis
)，泳道13為菊花薊馬(Microcephalothrips abdominalis
)，泳道14為腹鉤薊馬(Rhipiphorothrips cruentatus
)，泳道15為尤加律薊馬
(Taeniothrips eucharii
)，泳道16為赤帶薊馬(Selenothrips rubrocinctus
)，泳道17為直毛薊馬屬(Stenchaetothrips sp
.)，泳道18為玉米薊馬(Frankliniella williamsi
)，泳道19為蔗腹齒薊馬(Fulmekiola serrata
)，泳道20為澳洲疫薊馬(Thrips imaginis
)，泳道21為澳洲疫薊馬(Thrips imaginis
)。結果顯示僅泳道8、20和21的澳洲疫薊馬去氧核醣核酸可增幅出專一性產物。
以西方花薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，利用引子對序列辨識編號9及序列辨識編號10，可增幅出序列辨識編號11之片段。而利用引子對序列辨識編號12及序列辨識編號10，可增幅出序列辨識編號13之片段。
請參照第2(A)圖與第2(B)圖，為西方花薊馬專一性引子對各種薊馬的測試結果。第2(A)圖為以16屬20種薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，利用引子對序列辨識編號9及序列辨識編號10進行增幅，再以瓊脂醣膠體電泳分離增幅出之片段；第2(B)圖則為以16屬19種薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，利用引子對序列辨識編號12及序列辨識編號10進行增幅，再以瓊脂醣膠體電泳分離增幅出之片段。
聚合酶連鎖反應之反應物及試劑依下述比例進行：2.5μl之10XTaq
緩衝液(含20mM MgCl2
)、0.2μl之25mM dNTP混合液、10μM之引子各0.5μl、0.5μl之Taq
DNA polymerase(2U/μl)和2μl的基因體去氧核醣核酸萃取液，最後加入滅菌之二次去離子水，調整總體積為25μl，將溶液混合均勻後進行聚合酶連鎖反應。反應條件為變性95℃反應2分鐘，接著進行35個周期之熱循環，包括變性95℃
反應40秒、黏合60℃反應20秒、延長72℃反應20秒，之後進行最終延長72℃反應10分鐘，終止溫度為4℃。
第2(A)圖中的M為去氧核醣核酸之分子量標記，泳道1為菊花薊馬(Microcephalothrips abdominalis
)，泳道2為南黃薊馬(Thrips palmi
)，泳道3為赤帶薊馬(Selenothrips rubrocinctus
)，泳道4為腹鉤薊馬(Rhipiphorothrips cruentatus
)，泳道5為西方花薊馬(Frankliniella occidentalis
)，泳道6為豆花薊馬(Megalurothrips usitatus
)，泳道7為小黃薊馬(Scirtothrips dorsalis
)，泳道8為黑角貝薊馬(Bathrips melanicornis
)，泳道9為司密蘭花薊馬(Dichromothrips smithi
)，泳道10為玉米薊馬(Frankliniella williamsi
)，泳道11為網紋薊馬屬(Helionothrips sp
.)，泳道12為棉紋薊馬(Ayyaria chaetophora
)，泳道13為板背薊馬屬(Hydatothrip sp.
)，泳道14為直毛薊馬屬(Stenchaetothrips sp
.)，泳道15為蔗腹齒薊馬(Fulmekiola serrata
)，泳道16為菊花薊馬(Microcephalothrips abdominalis
)，泳道17為花薊馬(Thrips hawaiiensis
)，泳道18為褐尾包薊馬(Bolacothrips graminis
)，泳道19為尤加律薊馬(Taeniothrips eucharii
)，泳道20為台灣花薊馬(Frankliniella intonsa
)，泳道21為玉米薊馬(Frankliniella williamsi
)，泳道22為西方花薊馬(Frankliniella occidentalis
)，泳道23為陰性對照組(negative control)。結果顯示僅泳道5和22的西方花薊馬去氧核醣核酸可增幅出專一性產物。
第2(B)圖中的M為去氧核醣核酸之分子量標記，泳道1為台灣花薊馬(Frankliniella intonsa
)，泳道2為小黃薊馬(Scirtothrips dorsalis
)，泳道3為玉米薊馬(Frankliniella williamsi
)，泳道4為赤帶薊馬(Selenothrips rubrocinctus
)，泳道5為南黃薊馬(Thrips palmi
)，泳道6為腹鉤薊馬(Rhipiphorothrips cruentatus
)，泳道7為西方花薊馬(Frankliniella occidentalis
)，泳道8為西方花薊馬(Frankliniella occidentalis
)，泳道9為西方花薊馬(Frankliniella occidentalis
)，泳道10為西方花薊馬(Frankliniella occidentalis
)，泳道11為網紋薊馬屬(Helionothrips sp
.)，泳道12為棉紋薊馬(Ayyaria chaetophora
)，泳道13為板背薊馬屬(Hydatothrip sp
.)，泳道14為直毛薊馬屬(Stenchaetothrips sp
.)，泳道15為蔗腹齒薊馬(Fulmekiola serrata
)，泳道16為菊花薊馬(Microcephalothrips abdominalis
)，泳道17為花薊馬(Thrips hawaiiensis
)，泳道18為褐尾包薊馬(Bolacothrips graminis
)，泳道19為黑角貝薊馬(Bathrips melanicornis
)，泳道20為司密蘭花薊馬(Dichromothrips smithi
)，泳道21為尤加律薊馬(Taeniothrips eucharii
)，泳道22為西方花薊馬(Frankliniella occidentalis
)，泳道23為陰性對照組。結果顯示僅泳道7、8、9、10和22的西方花薊馬去氧核醣核酸可增幅出專一性產物。
以玫瑰花薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，利用引子對序列辨識編號14及序列辨識編號15，可增幅出序列辨識編號16之片段。
請參照第3圖，為玫瑰花薊馬專一性引子對各種薊馬的測試結果。第3圖為以11屬15種薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，利用引子對序列辨識編號14及序列辨識編號15進行增幅，再以瓊脂醣膠體電泳分離增幅出之片段。
聚合酶連鎖反應之反應物及試劑依下述比例進行：2.5μl之10XTaq
緩衝液(含20mM MgCl2
)、0.2μl之25mM dNTp混合液、10μM之引子各0.5μl、0.5μl之Taq
DNA polymerase(2U/μl)和2μl的基因體去氧核醣核酸萃取液，最後加入滅菌之二次去離子水，調整總體積為25μl，將溶液混合均勻後進行聚合酶連鎖反應。反應條件為變性95℃反應2分鐘，接著進行35個周期之熱循環，包括變性95℃反應40秒、黏合60℃反應20秒、延長72℃反應20秒，之後進行最終延長72℃反應10分鐘，終止溫度為4℃。
第3圖中的M為去氧核醣核酸之分子量標記，泳道1為玫瑰花薊馬(Thrips fuscipennis
)，泳道2為黑角貝薊馬(Bathrips melanicornis
)，泳道3為司密蘭花薊馬(Dichromothrips smithi
)，泳道4為尤加律薊馬(Taeniothrips eucharii
)，泳道5為褐尾包薊馬(Bolacothrips graminis
)，泳道6為蔗腹齒薊馬(Fulmekiola serrata
)，泳道7為玉米薊馬(Frankliniella williamsi
)，泳道8為赤帶薊馬(Selenothrips rubrocinctus
)，泳道9為栗帶薊馬(Anaphothrips sudanensis
)，泳道10為小黃薊馬(Scirtothrips dorsalis
)，泳道11為棉紋薊馬(Ayyaria chaetophora
)，泳道12為南黃薊馬(Thrips palmi
)，泳道13為梳缺花薊馬屬(Frankliniella schultzei
)，泳道14為西方花薊馬(Frankliniella occidentalis
)，泳道15為玫瑰花薊馬(Thrips fuscipennis
)，泳道16為陰性對照組。結果顯示僅泳道1和15的玫瑰花薊馬去氧核醣核酸可增幅出專一性產物。
以蔥薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，利用引子對序列辨識編號17及序列辨識編號18，可增幅出序列辨識
編號19之片段。
請參照第4圖，為蔥薊馬專一性引子對各種薊馬的測試結果。第4圖為以11屬15種薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，利用引子對序列辨識編號17及序列辨識編號18進行增幅，再以瓊脂醣膠體電泳分離增幅出之片段。
聚合酶連鎖反應之反應物及試劑依下述比例進行：2.5μl之10XTaq
緩衝液(含20mM MgCl2
)、0.2μl之25mM dNTP混合液、10μM之引子各0.5μl、0.5μl之Taq
DNA polymerase(2U/μl)和2μl的基因體去氧核醣核酸萃取液，最後加入滅菌之二次去離子水，調整總體積為25μl，將溶液混合均勻後進行聚合酶連鎖反應。反應條件為變性95℃反應2分鐘，接著進行35個周期之熱循環，包括變性95℃反應40秒、黏合60℃反應20秒、延長72℃反應20秒，之後進行最終延長72℃反應10分鐘，終止溫度為4℃。
第4圖中的M為去氧核醣核酸之分子量標記，泳道1為蔥薊馬(Thrips tabaci
)，泳道2為黑角貝薊馬(Bathrips melanicornis
)，泳道3為司密蘭花薊馬(Dichromothrips smithi
)，泳道4為尤加律薊馬(Taeniothrips eucharii
)，泳道5為褐尾包薊馬(Bolacothrips graminis
)，泳道6為蔗腹齒薊馬(Fulmekiola serrata
)，泳道7為玉米薊馬(Frankliniella williamsi
)，泳道8為赤帶薊馬(Selenothrips rubrocinctus
)，泳道9為栗帶薊馬(Anaphothrips sudanensis
)，泳道10為小黃薊馬(Scirtothrips dorsalis
)，泳道11為棉紋薊馬(Ayyaria chaetophora
)，泳道12為南黃薊馬(Thrips palmi
)，泳道13為梳缺花薊馬屬(Frankliniella schultzei
)，泳道14為西方花薊馬(Frankliniella occidentalis
)，泳道15為玫瑰花薊馬
(Thrips fuscipennis
)，泳道16為陰性對照組。結果顯示僅第1泳道的蔥薊馬去氧核醣核酸可增幅出專一性產物。
此外，另自28S rDNA序列設計所有薊馬適用的內部控制引子對序列辨識編號20和序列辨識編號21，可增幅出序列辨識編號22之片段。
根據第一部份設計出之引子對，將其應用於鑑別薊馬之種類。首先萃取薊馬樣本之基因體去氧核醣核酸，再以至少二對引子對進行多對引子對聚合酶連鎖反應，以增幅出至少一核酸片段，其中此至少二對引子對係選自於由下列引子對所組成之族群：第一引子對、第二引子對、第三引子對、以及第四引子對。
第一引子對為具有如序列辨識編號3所示序列與具有如序列辨識編號4所示序列之第五引子對，或具有如序列辨識編號6所示序列與具有如序列辨識編號7所示序列之第六引子對。
第三引子對為具有如序列辨識編號9所示序列與具有如序列辨識編號10所示序列之第七引子對，或具有如序列辨識編號12所示序列與具有如序列辨識編號10所示序列之第八引子對。
第二引子對為具有如序列辨識編號14所示序列與具有如序列辨識編號15所示序列之引子對，第四引子對則為具有如序列辨識編號17所示序列與具有如序列辨識編號18所示序列之引子對。
接著，再比對此增幅出之至少一核酸片段與已知序列
之近似度，以判斷該薊馬樣本之種類。其中已知序列係選自於由如序列辨識編號5所示序列、如序列辨識編號8所示序列、如序列辨識編號11所示序列、如序列辨識編號13所示序列、如序列辨識編號16所示序列、如序列辨識編號19所示序列及其任意組合所組成之族群，且近似度為95%至100%。
根據本案之一實施方式，可利用瓊脂膠體電泳比對該至少一核酸片段之大小，或以去氧核醣核酸定序比對至少一核酸片段之核酸序列。
因此，在下面之實施例中，敘述混合各薊馬專一性之引子，以多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之方法。
實施例均是先自薊馬分離基因體去氧核醣核酸以作為模板，混合各薊馬專一性之引子，再以聚合酶連鎖反應進行鑑別。此外，為增加本測試的客觀性，每一反應更包含內部控制引子對，其為具有如序列辨識編號20所示序列與具有如序列辨識編號21所示序列之第九引子對，以確定薊馬去氧核醣核酸純化的客觀性。
請參照第5圖，為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示1圖。第5圖的每一反應均混合加入蔥薊馬專一性引子對(序列辨識編號17和序列辨識編號18)、澳洲疫薊馬專一性引子對(序列辨識編號3和序列辨識編號4)、西方花薊馬專一性引子對(序列辨識編號9和序列辨識編號10)及內部控制引子對(序列辨識編號20和序列辨識編號21)，以
進行多對引子聚合酶連鎖反應。反應物及試劑依下述比例進行：2.5μl之10XTaq
緩衝液(含20mM MgCl2
)、0.3μl之25mM dNTP混合液、1μl之25mM MgCl2
、10μM之引子對序列辨識編號17和序列辨識編號18各0.75μl、引子對序列辨識編號9和序列辨識編號10各0.5μl、引子對序列辨識編號3和序列辨識編號4各0.5μl、引子對序列辨識編號20和序列辨識編號21各0.75μl、0.5μl之Taq
DNA polymerase(2U/μl)和2μl的基因體去氧核醣核酸萃取液，最後加入滅菌之二次去離子水，調整總體積為25μl，將溶液混合均勻後進行聚合酶連鎖反應。反應條件為變性95℃反應2分鐘，接著進行35個周期之熱循環，包括變性95℃反應40秒、黏合58℃反應20秒、延長72℃反應20秒，之後進行最終延長72℃反應10分鐘，終止溫度為4℃。
泳道1及2之反應為以蔥薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到蔥薊馬專一性序列辨識編號19之片段(如圖中紅色框線所示)；泳道3及4之反應為以澳洲疫薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到澳洲疫薊馬專一性序列辨識編號5之片段(如圖中黃色框線所示)；泳道5及6之反應為以西方花薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到西方花薊馬專一性序列辨識編號11之片段(如圖中藍色框線所示)；泳道7為陰性對照組。綠色框線則為內部控制引子對所增幅出之序列辨識編號22片段。
請參照第6圖，為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示2圖。第6圖的每一反應均混合加入西方花薊馬專
一性引子對(序列辨識編號12和序列辨識編號10)、玫瑰花薊馬專一性引子對(序列辨識編號14和序列辨識編號15)、澳洲疫薊馬專一性引子對(序列辨識編號6和序列辨識編號7)及內部控制引子對(序列辨識編號20和序列辨識編號21)，以進行多對引子聚合酶連鎖反應。反應物及試劑依下述比例進行：2.5μl之10XTaq
緩衝液(含20mM MgCl2
)、0.3μl之25mM dNTP混合液、1μl之25mM MgCl2
、10μM之引子對序列辨識編號14和序列辨識編號15各0.5μl、引子對序列辨識編號12和序列辨識編號10各0.5μl、引子對序列辨識編號6和序列辨識編號7各0.5μl、引子對序列辨識編號20和序列辨識編號21各0.75μl、0.5μl之Taq
DNA polymerase(2U/μl)和2μl的基因體去氧核醣核酸萃取液，最後加入滅菌之二次去離子水，調整總體積為25μl，將溶液混合均勻後進行聚合酶連鎖反應。反應條件為變性95℃反應2分鐘，接著進行35個周期之熱循環，包括變性95℃反應40秒、黏合58℃反應20秒、延長72℃反應20秒，之後進行最終延長72℃反應10分鐘，終止溫度為4℃。
泳道1之反應為以西方花薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到西方花薊馬專一性序列辨識編號13之片段；泳道2之反應為以玫瑰花薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到玫瑰花薊馬專一性序列辨識編號16之片段；泳道3之反應為以澳洲疫薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到澳洲疫薊馬專一性序列辨識編號8之片段。綠色框線則為內部控制引子對所增幅出之序列辨識編號22片段。
請參照第7圖，為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示3圖。第7圖的每一反應均混合加入蔥薊馬專一性引子對(序列辨識編號17和序列辨識編號18)、澳洲疫薊馬專一性引子對(序列辨識編號6和序列辨識編號7)、西方花薊馬專一性引子對(序列辨識編號9和序列辨識編號10)及內部控制引子對(序列辨識編號20和序列辨識編號21)，以進行多對引子聚合酶連鎖反應，反應物及試劑依下述比例進行：2.5μl之10XTaq
緩衝液(含20mM MgCl2
)、0.3μl之25mM dNTP混合液、1μl之25mM MgCl2
、10μM之引子對序列辨識編號17和序列辨識編號18各0.75μl、引子對序列辨識編號6和序列辨識編號7各0.5μl、引子對序列辨識編號9和序列辨識編號10各0.5μl、引子對序列辨識編號20和序列辨識編號21各0.75μl、0.5μl之Taq
DNA polymerase(2U/μl)和2μl的基因體去氧核醣核酸萃取液，最後加入滅菌之二次去離子水，調整總體積為25μl，將溶液混合均勻後進行聚合酶連鎖反應。反應條件為變性95℃反應2分鐘，接著進行35個周期之熱循環，包括變性95℃反應40秒、黏合58℃反應20秒、延長72℃反應20秒，之後進行最終延長72℃反應10分鐘，終止溫度為4℃。
泳道1之反應為以蔥薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到蔥薊馬專一性序列辨識編號19之片段；泳道2之反應為以澳洲疫薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到澳洲疫薊馬專一性序列辨識編號8之片段；泳道3之反應為以西方花薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到西方花薊馬專一性序列辨識編號11之片段。綠色框線則為內部控制引子對所增幅出之序列辨識編號22片段。
請參照第8圖，為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示4圖。第8圖的每一反應均混合加入蔥薊馬專一性引子對(序列辨識編號17和序列辨識編號18)、澳洲疫薊馬專一性引子對(序列辨識編號3和序列辨識編號4)、西方花薊馬專一性引子對(序列辨識編號12和序列辨識編號10)及內部控制引子對(序列辨識編號20和序列辨識編號21),以進行多對引子聚合酶連鎖反應，反應物及試劑依下述比例進行：2.5μl之10XTaq
緩衝液(含20mM MgCl2
)、0.3μl之25mM dNTP混合液、1μl之25mM MgCl2
、10μM之引子對序列辨識編號17和序列辨識編號18各0.75μl、引子對序列辨識編號3和序列辨識編號4各0.5μl、引子對序列辨識編號12和序列辨識編號10各0.5μl、引子對序列辨識編號20和序列辨識編號21各0.75μl、0.5μl之Taq
DNA polymerase(2U/μl)和2μl的基因體去氧核醣核酸萃取液，最後加入滅菌之二次去離子水，調整總體積為25μl，將溶混合均勻後進行聚合酶連鎖反應。反應條件為變性95℃反應2分鐘，接著進行35個周期之熱循環，包括變性95℃反應40秒、黏合58℃反應20秒、延長72℃反應20秒，之後進行最終延長72℃反應10分鐘，終止溫度為4℃。
泳道1之反應為以蔥薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到蔥薊馬專一性序列辨識編號19之片段；泳道2之反應為以澳洲疫薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到澳洲疫薊馬專一性序列辨識編號5之片段；泳道3之反應為以西方花薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到西方
花薊馬專一性序列辨識編號13之片段。綠色框線則為內部控制引子對所增幅出之序列辨識編號22片段。
請參照第9圖，為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示5圖。第9圖的每一反應均混合加入玫瑰花薊馬專一性引子對(序列辨識編號14和序列辨識編號15)、澳洲疫薊馬專一性引子對(序列辨識編號3和序列辨識編號4)、西方花薊馬專一性引子對(序列辨識編號12和序列辨識編號10)及內部控制引子對(序列辨識編號20和序列辨識編號21)，以進行多對引子聚合酶連鎖反應，反應物及試劑依下述比例進行：2.5μl之10XTaq
緩衝液(含20mM MgCl2
)、0.3μl之25mM dNTP混合液、1μl之25mM MgCl2
、10μM之引子對序列辨識編號14和序列辨識編號15各0.5μl、引子對序列辨識編號3和序列辨識編號4各0.5μl、引子對序列辨識編號12和序列辨識編號10各0.5μl、引子對序列辨識編號20和序列辨識編號21各0.75μl、0.5μl之Taq
DNA polymerase(2U/μl)和2μl的基因體去氧核醣核酸萃取液，最後加入滅菌之二次去離子水，調整總體積為25μl，將溶液混合均勻後進行聚合酶連鎖反應。反應條件為變性95℃反應2分鐘，接著進行35個周期之熱循環，包括變性95℃反應40秒、黏合58℃反應20秒、延長72℃反應20秒，之後進行最終延長72℃反應10分鐘，終止溫度為4℃。
泳道1之反應為以玫瑰花薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到玫瑰花薊馬專一性序列辨識編號16之片段；泳道2之反應為以澳洲疫薊馬之基因體去氧核醣核酸為模
板，得到澳洲疫薊馬專一性序列辨識編號5之片段；泳道3之反應為以西方花薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到西方花薊馬專一性序列辨識編號13之片段。綠色框線則為內部控制引子對所增幅出之序列辨識編號22片段。
請參照第10圖，為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示6圖。第10圖的每一反應均混合加入玫瑰花薊馬專一性引子對(序列辨識編號14和序列辨識編號15)、澳洲疫薊馬專一性引子對(序列辨識編號6和序列辨識編號7)、西方花薊馬專一性引子對(序列辨識編號9和序列辨識編號10)及內部控制引子對(序列辨識編號20和序列辨識編號21)，以進行多對引子聚合酶連鎖反應，反應物及試劑依下述比例進行：2.5μl之10XTaq
緩衝液(含20mM MgCl2
)、0.3μl之25mM dNTP混合液、1μl之25mM MgCl2
、10μM之引子對序列辨識編號14和序列辨識編號15各0.5μl、引子對序列辨識編號6和序列辨識編號7各0.5μl、引子對序列辨識編號9和序列辨識編號10各0.5μl、引子對序列辨識編號20和序列辨識編號21各0.75μl、0.5μl之Taq
DNA polymerase(2U/μl)和2μl的基因體去氧核醣核酸萃取液，最後加入滅菌之二次去離子水，調整總體積為25μl，將溶液混合均勻後進行聚合酶連鎖反應。反應條件為變性95℃反應2分鐘，接著進行35個周期之熱循環，包括變性95℃反應40秒、黏合58℃反應20秒、延長72℃反應20秒，之後進行最終延長72℃反應10分鐘，終止溫度為4℃。
泳道1之反應為以玫瑰花薊馬之基因體去氧核醣核酸
為模板，得到玫瑰花薊馬專一性序列辨識編號16之片段；泳道2之反應為以澳洲疫薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到澳洲疫薊馬專一性序列辨識編號8之片段；泳道3之反應為以西方花薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到西方花薊馬專一性序列辨識編號11之片段。綠色框線則為內部控制引子對所增幅出之序列辨識編號22片段。
請參照第11圖，為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示7圖。第11圖的每一反應均混合加入蔥薊馬專一性引子對(序列辨識編號17和序列辨識編號18)、玫瑰花薊馬專一性引子對(序列辨識編號14和序列辨識編號15)、澳洲疫薊馬專一性引子對(序列辨識編號3和序列辨識編號4)及內部控制引子對(序列辨識編號20和序列辨識編號21)，以進行多對引子聚合酶連鎖反應，反應物及試劑依下述比例進行：2.5μl之10XTaq
緩衝液(含20mM MgCl2
)、0.3μl之25mM dNTP混合液、1μl之25mM MgCl2
、10μM之引子對序列辨識編號17和序列辨識編號18各0.75μl、引子對序列辨識編號14和序列辨識編號15各0.5μl、引子對序列辨識編號3和序列辨識編號4各0.5μl、引子對序列辨識編號20和序列辨識編號21各0.75μl、0.5μl之Taq
DNA polymerase(2U/μl)和2μl的基因體去氧核醣核酸萃取液，最後加入滅菌之二次去離子水，調整總體積為25μl，將溶液混合均勻後進行聚合酶連鎖反應。反應條件為變性95℃反應2分鐘，接著進行35個周期之熱循環，包括變性95℃反應40秒、黏合58℃反應20秒、延長72℃反應20秒，
之後進行最終延長72℃反應10分鐘，終止溫度為4℃。
泳道1之反應為以蔥薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到蔥薊馬專一性序列辨識編號19之片段；泳道2之反應為以玫瑰花薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到玫瑰花薊馬專一性序列辨識編號16之片段；泳道3之反應為以澳洲疫薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到澳洲疫薊馬專一性序列辨識編號5之片段。綠色框線則為內部控制引子對所增幅出之序列辨識編號22片段。
請參照第12圖，為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示8圖。第12圖的每一反應均混合加入蔥薊馬專一性引子對(序列辨識編號17和序列辨識編號18)、玫瑰花薊馬專一性引子對(序列辨識編號14和序列辨識編號15)、澳洲疫薊馬專一性引子對(序列辨識編號6和序列辨識編號7)及內部控制引子對(序列辨識編號20和序列辨識編號21)，以進行多對引子聚合酶連鎖反應，反應物及試劑依下述比例進行：2.5μl之10XTaq
緩衝液(含20mM MgCl2
)、0.3μl之25mM dNTP混合液、1μl之25mM MgCl2
、10μM之引子對序列辨識編號17和序列辨識編號18各0.75μl、引子對序列辨識編號14和序列辨識編號15各0.5μl、引子對序列辨識編號6和序列辨識編號7各0.5μl、引子對序列辨識編號20和序列辨識編號21各0.75μl、0.5μl之Taq
DNA polymerase(2U/μl)和2μl的基因體去氧核醣核酸萃取液，最後加入滅菌之二次去離子水，調整總體積為25μl，將溶液混合均勻後進行聚合酶連鎖反應。反應條件為變性95℃
反應2分鐘，接著進行35個周期之熱循環，包括變性95℃反應40秒、黏合58℃反應20秒、延長72℃反應20秒，之後進行最終延長72℃反應10分鐘，終止溫度為4℃。
泳道1之反應為以蔥薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到蔥薊馬專一性序列辨識編號19之片段；泳道2之反應為以玫瑰花薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到玫瑰花薊馬專一性序列辨識編號16之片段；泳道3之反應為以澳洲疫薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到澳洲疫薊馬專一性序列辨識編號8之片段。綠色框線則為內部控制引子對所增幅出之序列辨識編號22片段。
請參照第13圖，為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示9圖。第13圖的每一反應均混合加入蔥薊馬專一性引子對(序列辨識編號17和序列辨識編號18)、玫瑰花薊馬專一性引子對(序列辨識編號14和序列辨識編號15)、西方花薊馬專一性引子對(序列辨識編號9和序列辨識編號10)及內部控制引子對(序列辨識編號20和序列辨識編號21)，以進行多對引子聚合酶連鎖反應，反應物及試劑依下述比例進行：2.5μl之10XTaq
緩衝液(含20mM MgCl2
)、0.3μl之25mM dNTP混合液、1μl之25mM MgCl2
、10μM之引子對序列辨識編號17和序列辨識編號18各0.75μl、引子對序列辨識編號14和序列辨識編號15各0.5μl、引子對序列辨識編號9和序列辨識編號10各0.5μl、引子對序列辨識編號20和序列辨識編號21各0.75μl、0.5μl之Taq
DNA polymerase(2U/μl)和2μl的基因體去氧核醣核酸萃取液，
最後加入滅菌之二次去離子水，調整總體積為25μl，將溶液混合均勻後進行聚合酶連鎖反應。反應條件為變性95℃反應2分鐘，接著進行35個周期之熱循環，包括變性95℃反應40秒、黏合58℃反應20秒、延長72℃反應20秒，之後進行最終延長72℃反應10分鐘，終止溫度為4℃。
泳道1之反應為以蔥薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到蔥薊馬專一性序列辨識編號19之片段；泳道2之反應為以玫瑰花薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到玫瑰花薊馬專一性序列辨識編號16之片段；泳道3之反應為以西方花薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到西方花薊馬專一性序列辨識編號11之片段。綠色框線則為內部控制引子對所增幅出之序列辨識編號22片段。
請參照第14圖，為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示10圖。第14圖的每一反應均混合加入蔥薊馬專一性引子對(序列辨識編號17和序列辨識編號18)、玫瑰花薊馬專一性引子對(序列辨識編號14和序列辨識編號15)、西方花薊馬專一性引子對(序列辨識編號12和序列辨識編號10)及內部控制引子對(序列辨識編號20和序列辨識編號21)，以進行多對引子聚合酶連鎖反應，反應物及試劑依下述比例進行：2.5μl之10XTaq
緩衝液(含20mM MgCl2
)、0.3μl之25mM dNTP混合液、1μl之25mM MgCl2
、10μM之引子對序列辨識編號17和序列辨識編號18各0.75μl、引子對序列辨識編號14和序列辨識編號15各0.5μl、引子對序列辨識編號12和序列辨識編號10各0.5μl、引子對序
列辨識編號20和序列辨識編號21各0.75μl、0.5μl之Taq
DNA polymerase(2U/μl)和2μl的基因體去氧核醣核酸萃取液，最後加入滅菌之二次去離子水，調整總體積為25μl，將溶液混合均勻後進行聚合酶連鎖反應。反應條件為變性95℃反應2分鐘，接著進行35個周期之熱循環，包括變性95℃反應40秒、黏合58℃反應20秒、延長72℃反應20秒，之後進行最終延長72℃反應10分鐘，終止溫度為4℃。
泳道1之反應為以蔥薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到蔥薊馬專一性序列辨識編號19之片段；泳道2之反應為以玫瑰花薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到玫瑰花薊馬專一性序列辨識編號16之片段；泳道3之反應為以西方花薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到西方花薊馬專一性序列辨識編號13之片段。綠色框線則為內部控制引子對所增幅出之序列辨識編號22片段。
請參照第15圖，為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示11圖。第15圖的每一反應均混合加入蔥薊馬專一性引子對(序列辨識編號17和序列辨識編號18)、澳洲疫薊馬專一性引子對(序列辨識編號6和序列辨識編號7)、西方花薊馬專一性引子對(序列辨識編號12和序列辨識編號10)及內部控制引子對(序列辨識編號20和序列辨識編號21)，以進行多對引子聚合酶連鎖反應，反應物及試劑依下述比例進行：2.5μl之10XTaq
緩衝液(含20mM MgCl2
)、0.3μl之25mM dNTP混合液、1μl之25mM MgCl2
、10μM之
引子對序列辨識編號17和序列辨識編號18各0.75μl、引子對序列辨識編號6和序列辨識編號7各0.5μl、引子對序列辨識編號12和序列辨識編號10各0.5μl、引子對序列辨識編號20和序列辨識編號21各0.75μl、0.5μl之Taq
DNA polymerase(2U/μl)和2μl的基因體去氧核醣核酸萃取液，最後加入滅菌之二次去離子水，調整總體積為25μl，將溶液混合均勻後進行聚合酶連鎖反應。反應條件為變性95℃反應2分鐘，接著進行35個周期之熱循環，包括變性95℃反應40秒、黏合58℃反應20秒、延長72℃反應20秒，之後進行最終延長72℃反應10分鐘，終止溫度為4℃。
泳道1之反應為以蔥薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到蔥薊馬專一性序列辨識編號19片段；泳道2之反應為以澳洲疫薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到澳洲疫薊馬專一性序列辨識編號8片段；泳道3之反應為以西方花薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到西方花薊馬專一性序列辨識編號13片段。綠色框線則為內部控制引子對所增幅出之序列辨識編號22片段。
請參照第16圖，為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示12圖。第16圖的每一反應均混合加入玫瑰花薊.馬專一性引子對(序列辨識編號14和序列辨識編號15)、澳洲疫薊馬專一性引子對(序列辨識編號3和序列辨識編號4)、西方花薊馬專一性引子對(序列辨識編號9和序列辨識編號10)及內部控制引子對(序列辨識編號20和序列辨識編號21)，以進行多對引子聚合酶連鎖反應，反應物及試劑依下
述比例進行：2.5μl之10XTaq
緩衝液(含20mM MgCl2
)、0.3μl之25mM dNTP混合液、1μl之25mM MgCl2
、10μM之引子對序列辨識編號14和序列辨識編號15各0.5μl、引子對序列辨識編號3和序列辨識編號4各0.5μl、引子對序列辨識編號9和序列辨識編號10各0.5μl、引子對序列辨識編號20和序列辨識編號21各0.75μl、0.5μl之Taq
DNA polymerase(2U/μl)和2μl的基因體去氧核醣核酸萃取液，最後加入滅菌之二次去離子水，調整總體積為25μl，將溶液混合均勻後進行聚合酶連鎖反應。反應條件為變性95℃反應2分鐘，接著進行35個周期之熱循環，包括變性95℃反應40秒、黏合58℃反應20秒、延長72℃反應20秒，之後進行最終延長72℃反應10分鐘，終止溫度為4℃。
泳道1之反應為以玫瑰花薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到玫瑰花薊馬專一性序列辨識編號16片段；泳道2之反應為以澳洲疫薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到澳洲疫薊馬專一性序列辨識編號5片段；泳道3之反應為以西方花薊馬之基因體去氧核醣核酸為模板，得到西方花薊馬專一性序列辨識編號11片段。綠色框線則為內部控制引子對所增幅出之序列辨識編號22片段。
值得一提的是，本發明排除以單一種引子對進行鑑別，而是在同一反應同時混合多種薊馬之引子對。通常在單一反應中結合多對引子對會出現非專一性之片段，然而，本發明混合多種引子對，仍可專一性地辨識出薊馬之種類。
由本發明上述實施例可知，本發明利用多對引子聚合
酶連鎖反應鑑定薊馬之方法，其優點在於排除只以單一種引子對做鑑定，可在單一次試驗中以多種薊馬的引子對同步進行鑑別，就可免去多次試驗所花費的時間與金錢。
雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
<110>國立中興大學
<120>一種鑑別薊馬之方法
<160>10
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>primer
<223>進行PCR增幅薊馬ITS2去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400>1
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>primer
<223>進行PCR增幅薊馬ITS2去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400>2
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>primer
<223>進行PCR增幅澳洲疫薊馬ITS2去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400>3
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>primer
<223>進行PCR增幅澳洲疫薊馬ITS2去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400>4
<210>5
<211>149
<212>DNA
<213>Thrips imaginis
<223>增幅之澳洲疫薊馬ITS2去氧核醣核酸片段序列片段
<400>5
<210>6
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>primer
<223>進行PCR增幅澳洲疫薊馬ITS2去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400>6
<210>7
<211>165
<212>DNA
<213>人工序列
<223>進行PCR增幅澳洲疫薊馬ITS2去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400>7
<210>8
<211>197
<212>DNA
<213>Thrips imaginis
<223>增幅之澳洲疫薊馬ITS2去氧核醣核酸片段序列片段
<400>8
<210>9
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>primer
<223>進行PCR增幅西方花薊馬ITS2去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400>9
<210>10
<211>165
<212>DNA
<213>人工序列
<223>進行PCR增幅西方花疫薊馬ITS2去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400>10
<210>11
<211>243
<212>DNA
<213>Frankliniella occidentalis
<223>增幅之西方花疫薊馬ITS2去氧核醣核酸片段序列片段
<400>11
<210>12
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>primer
<223>進行PCR增幅西方花薊馬ITS2去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400>12
<210>13
<211>149
<212>DNA
<213>Frankliniella occidentalis
<223>增幅之西方花疫薊馬ITS2去氧核醣核酸片段序列片段
<400>13
<210>14
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>primer
<223>進行PCR增幅玫瑰花薊馬ITS2去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400>14
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>進行PCR增幅玫瑰花疫薊馬ITS2去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400>15
<210>16
<211>235
<212>DNA
<213>Thrips fuscipennis
<223>增幅之玫瑰花疫薊馬ITS2去氧核醣核酸片段序列片段
<400>16
<210>17
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>primer
<223>進行PCR增幅蔥薊馬ITS2去氧核醣核酸片段的引子(forward)
<400>17
<210>18
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>primer
<223>進行PCR增幅蔥薊馬ITS2去氧核醣核酸片段的引子(reversed)
<400>18
<210>19
<211>345
<212>DNA
<213>Thrips tabaci
<223>增幅之蔥薊馬ITS2去氧核醣核酸片段序列片段
<400>19
<210>20
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>primer
<223>進行PCR增幅薊馬ITS2去氧核醣核酸片段之廣效性引子(forward)
<400>20
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>進行PCR增幅薊馬ITS2去氧核醣核酸片段之廣效性引子(reversed)
<400>21
<210>22
<211>523
<212>DNA
<213>
<223>增幅之薊馬ITS2去氧核醣核酸片段序列片段
<400>22
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1(A)圖與第1(B)圖為澳洲疫薊馬專一性引子對各種薊馬的測試結果。
第2(A)圖與第2(B)圖為西方花薊馬專一性引子對各種薊馬的測試結果。
第3圖為玫瑰花薊馬專一性引子對各種薊馬的測試結果。
第4圖為蔥薊馬專一性引子對各種薊馬的測試結果。
第5圖為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示1圖。
第6圖為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示2圖。
第7圖為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示3圖。
第8圖為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示4
圖。
第9圖為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示5圖。
第10圖為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示6圖。
第11圖為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示7圖。
第12圖為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示8圖。
第13圖為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示9圖。
第14圖為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示10圖。
第15圖為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示11圖。
第16圖為多對引子聚合酶連鎖反應鑑別薊馬之例示12圖。
Claims (6)
- 一種用於在一包含不同種屬薊馬的群組中鑑別澳洲疫薊馬及玫瑰花薊馬之套組，其中該不同種屬薊馬群組係由澳洲疫薊馬(Thrips imaginis )、玫瑰花薊馬(Thrips fuscipennis )、豆花薊馬(Megalurothrips usitatus )、稻薊馬(Stenchaetothrips biformis )、小黃薊馬(Scirtothrips dorsalis )、青蔥薊馬(Thrips alliorum )、台灣花薊馬(Frankliniella intonsa )、西方花薊馬(Frankliniella occidentalis )、花薊馬(Thrips hawaiiensis )、蔥薊馬(Thrips tabaci )、黑角貝薊馬(Bathrips melanicornis )、司密蘭花薊馬(Dichromothrips smithi )、褐尾包薊馬(Bolacothrips graminis )、菊花薊馬(Microcephalothrips abdominalis )、腹鉤薊馬(Rhipiphorothrips cruentatus )、尤加律薊馬(Taeniothrips eucharii )、赤帶薊馬(Selenothrips rubrocinctus )、直毛薊馬屬(Stenchaetothrips sp. )、玉米薊馬(Frankliniella williamsi )、蔗腹齒薊馬(Fulmekiola serrata )、南黃薊馬(Thrips palmi )、赤帶薊馬(Selenothrips rubrocinctus )、網紋薊馬屬(Helionothrips sp .)、棉紋薊馬(Ayyaria chaetophora )、板背薊馬屬(Hydatothrip sp. )、栗帶薊馬(Anaphothrips sudanensis )、梳缺花薊馬屬(Frankliniella schultzei )所組成，該套組包含二對引子對：一第一引子對，其中該第一引子對為具有如序列辨識編號3所示序列與具有如序列辨識編號4所示序列之一第五引子對，或具有如序列辨識編號6所示序列與具有如序列辨識編號7所示序列之一第六引子對；以及一第二引子對，具有如序列辨識編號14所示序列與具 有如序列辨識編號15所示序列之引子對。
- 如請求項1所述之用於在一包含不同種屬薊馬的群組中鑑別鑑別澳洲疫薊馬及玫瑰花薊馬種類之套組，更至少包含一內部控制引子對，該內部控制引子對具有如序列辨識編號20所示序列與具有如序列辨識編號21所示序列之一第九引子對。
- 一種用於在一包含不同種屬薊馬的群組中鑑別澳洲疫薊馬及玫瑰花薊馬種類之方法，其中該不同種屬薊馬群組係由澳洲疫薊馬(Thrips imaginis )、玫瑰花薊馬(Thrips fuscipennis )、豆花薊馬(Megalurothrips usitatus )、稻薊馬(Stenchaetothrips biformis )、小黃薊馬(Scirtothrips dorsalis )、青蔥薊馬(Thrips alliorum )、台灣花薊馬(Frankliniella intonsa )、西方花薊馬(Frankliniella occidentalis )、花薊馬(Thrips hawaiiensis )、蔥薊馬(Thrips tabaci )、黑角貝薊馬(Bathrips melanicornis )、司密蘭花薊馬(Dichromothrips smithi )、褐尾包薊馬(Bolacothrips graminis )、菊花薊馬(Microcephalothrips abdominalis )、腹鉤薊馬(Rhipiphorothrips cruentatus )、尤加律薊馬(Taeniothrips eucharii )、赤帶薊馬(Selenothrips rubrocinctus )、直毛薊馬屬(Stenchaetothrips sp. )、玉米薊馬(Frankliniella williamsi )、蔗腹齒薊馬(Fulmekiola serrata )、南黃薊馬(Thrips palmi )、赤帶薊馬(Selenothrips rubrocinctus )、網紋薊馬屬(Helionothrips sp. )、棉紋薊馬(Ayyaria chaetophora )、板背薊馬屬(Hydatothrip sp. )、栗帶 薊馬(Anaphothrips sudanensis )、梳缺花薊馬屬(Frankliniella schultzei )所組成，該方法包含：萃取該不同種屬薊馬群組中之至少一薊馬樣本之基因體去氧核醣核酸；使用二對引子對進行一多對引子對聚合酶連鎖反應，其中該二對引子對包含：一第一引子對，其中該第一引子對為具有如序列辨識編號3所示序列與具有如序列辨識編號4所示序列之一第五引子對，或具有如序列辨識編號6所示序列與具有如序列辨識編號7所示序列之一第六引子對；以及一第二引子對，具有如序列辨識編號14所示序列與具有如序列辨識編號15所示序列；以該多對引子對聚合酶連鎖反應結果有無增幅出核酸片段為基礎，判斷該或該些薊馬樣本中是否包含澳洲疫薊馬或玫瑰花薊馬；以及根據增幅出的核酸片段判斷該薊馬樣本之種類。
- 如請求項3所述之用於在一包含不同種屬薊馬的群組中鑑別澳洲疫薊馬及玫瑰花薊馬之方法，其中該多對引子對聚合酶連鎖反應更包含一內部控制引子對，且該內部控制引子對具有如序列辨識編號20所示序列與具有如序列辨識編號21所示序列之一第九引子對。
- 如請求項3所述之用於在一包含不同種屬薊馬的群組中鑑別澳洲疫薊馬及玫瑰花薊馬之方法，其中該根據增 幅出的核酸片段判斷該薊馬樣本之種類的方法包含利用瓊脂膠體電泳比對核酸片段之大小。
- 如請求項3所述之用於在一包含不同種屬薊馬的群組中鑑別澳洲疫薊馬及玫瑰花薊馬之方法，其中該根據增幅出的核酸片段判斷該薊馬樣本之種類的方法包含利用去氧核醣核酸定序，比對增幅出的核酸片段序列與一已知序列，其中該已知序列係選自於由如序列辨識編號5、8、16所示序列。
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Citations (1)
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 潘人豪，應用進階啟發式演算法進行多重聚合酶連鎖反應引子設計於蛋白質N端截短衍生物之功能區域研究，朝陽科技大學資訊管理所碩士論文，95年07月21日 * |
| 王穩等人，利用MP primer 設計引物並優化擴增條件以提高多重PCR效率的實驗研究，生物化學與生物物理進展Progress in Biochemistry and Biophysics，2010,37(3)：342~346 * |
| 葉文斌，重要農業有害薊馬及所含Tospovirus分子檢測系統之開發研究成果報告(精簡版)，行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告，97年03月28日 * |
| 葉文斌，重要農業有害螨類及薊馬分子檢測系統之開發研究成果報告(精簡版)，行政院國家科學委員會研究計畫成果報告，96年08月06日 * |
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