CN111500747A

CN111500747A - 一种检测柑橘半穿刺线虫的引物和探针组合及其应用

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Publication number: CN111500747A
Application number: CN202010440715.4A
Authority: CN
Inventors: 宋志强; 杨喜爱; 张晓伟; 梅时勇
Original assignee: Institute of Bast Fiber Crops of CAAS
Current assignee: Institute of Bast Fiber Crops of CAAS
Priority date: 2020-05-22
Filing date: 2020-05-22
Publication date: 2020-08-07

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种检测柑橘半穿刺线虫的引物和探针组合及其应用。该引物和探针组合包括正向引物Ts‑RPA‑F、反向引物Ts‑RPA‑R、探针Ts‑RPA‑P；正向引物Ts‑RPA‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；反向引物Ts‑RPA‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；探针Ts‑RPA‑P的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。本发明引物和探针组合及其检测方法具有特异性强、灵敏度高、设备简单、检测快速等优点。

Description

一种检测柑橘半穿刺线虫的引物和探针组合及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种检测柑橘半穿刺线虫的引物和探针组合及其应用。

背景技术

柑橘半穿刺线虫(Tylenchulus semipenetrans)是一种广泛分布于全世界柑橘产区的定居型半内寄生线虫，能引起柑橘慢衰病(Citrusslowdecline disease)，可造成重大的经济损失。柑橘被侵染后活力减退，叶片褪绿黄化，长势衰弱似缺肥、缺水、生长不良症状，严重时叶片脱落，果实变小，甚至枯死。柑橘受害后一般减产30％～50％，严重时达100％。

由于柑橘半穿刺线虫在柑橘根部侵染危害，虫体细小，无法用肉眼观察到，虽发生普遍，危害严重，但其引起的柑橘慢衰病在柑橘生产中却得不到重视，基层技术人员和种植户基本不认识或不了解该病害，所表现的黄化症状常被误诊为柑橘黄龙病，而进行抛荒、砍伐或挖除，造成重大经济损失。快速、准确地鉴定和检测柑橘半穿刺线虫，对柑橘慢衰病的田间检测和监测及有效防控至关重要。

柑橘半穿刺线虫的鉴定和检测方法主要包括传统的形态学鉴定和以PCR为基础的分子检测。由于形态学鉴定不仅耗时、费力，而且需要专业的技能和丰富的线虫形态学鉴定经验，难以达到快速诊断和检测的目的。虽然PCR检测方法在一定程度上克服了形态学鉴定上的缺陷，但需要昂贵的仪器设备，检测过程复杂、时间较长，不利于现场快速检测及基层普及应用。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)技术是一种新型体外恒温核酸扩增技术，该技术依赖于一对30～35bp长度的引物和三种酶(重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶)，在37～42℃恒温条件下反应5～20min，就可快速完成核酸的大量扩增。RPA扩增产物结合侧流层析试纸条技术(Lateral flow dipstick，LFD)，可在30min内完成对柑橘半穿刺线虫的可视化检测。由于RPA技术不需要专业的仪器设备，在普通的水浴锅或简单的恒温器中即可完成，具有操作简单、快速、特异性强、灵敏度高、检测方便等优点，可以真正实现便携式的快速核酸检测。目前，尚未见其在柑橘半穿刺线虫检测方面的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种检测柑橘半穿刺线虫的引物和探针组合及其应用。该引物和探针组合及其检测方法具有特异性强、灵敏度高、设备简单、检测快速等优点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测柑橘半穿刺线虫的引物和探针组合，包括正向引物Ts-RPA-F、反向引物Ts-RPA-R、探针Ts-RPA-P；

正向引物Ts-RPA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

反向引物Ts-RPA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

探针Ts-RPA-P的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

作为优选，反向引物Ts-RPA-R核苷酸序列的5’端标记有生物素；探针Ts-RPA-P核苷酸序列的5’端标记有荧光素，距离5’端至少31bp处的碱基进行脱碱基位点修饰，3’端修饰有阻断聚合酶扩增的基团。

在本发明提供的具体实施例中，反向引物Ts-RPA-R核苷酸序列的5’端标记有生物素Biotin；探针Ts-RPA-P核苷酸序列5’端标记有荧光素FAM，距离5’端31bp处的碱基用四氢呋喃(THF)替代，3’端修饰有C3-spacer。

本发明还提供了该引物和探针组合在制备检测柑橘半穿刺线虫的试剂或试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种基于RPA技术检测柑橘半穿刺线虫的试剂盒，包括上述引物和探针组合，以及RPA冻干酶粉、Rehydration Buffer、MgAc、ddH₂O、检测缓冲液、侧流层析试纸条中的一种或几种。

本发明还提供了一种基于RPA技术检测柑橘半穿刺线虫的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的DNA；

(2)以待测样品的DNA为模板，利用上述引物和探针组合或上述试剂盒进行RPA扩增；

(3)根据步骤(2)中RPA扩增的结果判定待测样品中是否含有柑橘半穿刺线虫。

作为优选，RPA扩增的反应体系为：

在本发明提供的具体实施例中，RPA扩增的反应体系为：

作为优选，RPA扩增的反应条件为：25～45℃反应5～60min。

在本发明提供的具体实施例中，RPA扩增的反应条件为：39℃反应20min。

作为优选，步骤(2)中利用上述试剂盒进行RPA扩增，步骤(3)为：将扩增产物与检测缓冲液混匀制备混合液，将侧流层析试纸条上样区置于混合液中，室温放置2～6min后观察结果；若侧流层析试纸条的质控线和检测线均出现条带时，检测结果为阳性，表明待测样品中含有柑橘半穿刺线虫；若试纸条上仅质控线出现条带时，则检测结果为阴性，表明待测样品中不含有柑橘半穿刺线虫；若试纸条上仅检测线出现条带或不出现任何条带，表明检测结果为无效。

在本发明中，待测样品为线虫样品、植物根组织样品或土壤样品中的一种或几种。

本发明提供了一种检测柑橘半穿刺线虫的引物和探针组合及其应用。该引物和探针组合包括正向引物Ts-RPA-F、反向引物Ts-RPA-R、探针Ts-RPA-P；正向引物Ts-RPA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；反向引物Ts-RPA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；探针Ts-RPA-P的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。本发明具有以下有益效果：

(1)特异性强。本发明提供了一种快速检测柑橘半穿刺线虫的RPA引物和探针组合，该引物和探针是根据柑橘半穿刺线虫与同属中另外4种线虫的rDNA-ITS序列之间的差异设计，能够从14种供试植物线虫种群中特异性地检测出柑橘半穿刺线虫。

(2)灵敏度高。本发明建立的柑橘半穿刺线虫RPA检测方法在0.5g土壤中可检测到0.01条柑橘半穿刺线虫2龄幼虫，比常规PCR的检测灵敏度高10倍。

(3)设备简单、检测快速。本发明建立的柑橘半穿刺线虫RPA检测方法不需要复杂的仪器设备，在：25～45℃恒温条件下反应5～60min左右即可完成扩增反应；应用侧流层析试纸条检测扩增产物，在5min内便可通过肉眼观察检测线和质控线的有无来判定检测结果；该方法可以直接检测线虫样品、植物根组织或土壤样品中的柑橘半穿刺线虫，从提取DNA到获得检测结果仅需要1h左右，利于现场快速检测和基层应用。

附图说明

图1为本发明实施例1中柑橘半穿刺线虫RPA引物筛选结果图；

图2为本发明实施例2中柑橘半穿刺线虫RPA-LFD检测结果图；

图3为本发明实施例3中柑橘半穿刺线虫RPA-LFD特异性检测结果图；

图4为本发明实施例4中土壤中柑橘半穿刺线虫2龄幼虫RPA-LFD灵敏度检测结果图；

图5为本发明实施例5中土壤中柑橘半穿刺线虫2龄幼虫常规PCR灵敏度电泳检测结果图。

具体实施方式

本发明公开了一种检测柑橘半穿刺线虫的引物和探针组合及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的检测柑橘半穿刺线虫的引物和探针组合及其应用中所用试剂和材料均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1线虫DNA提取

在200μL PCR管的管盖内加入20μL裂解液[10×PCR buffer(Mg²⁺free):1mg/mL蛋白酶K:ddH₂O＝8:1:1]，挑取单条线虫放入裂解液中，用灭菌的细针将线虫切断，盖上管盖，瞬时离心，将裂解液收集至管底；将PCR管置于56℃温育15min，95℃加热10min，获得单条线虫DNA提取液。

土壤中线虫DNA的提取采用MP Biomedicals公司的Fast DNA SPIN Kit forSoil试剂盒，具体操作方法参见试剂盒说明书。

实施例2柑橘半穿刺线虫RPA引物的设计与筛选

2.1 RPA引物的设计

根据柑橘半穿刺线虫与同属中另外4种线虫的rDNA-ITS序列间的差异性，依据RPA引物设计原则，利用Primer Premier5.0软件设计可用于

Basic试剂盒的多组引物组，通过初步筛选得到下述四组RPA引物组，包括Ts-RPA-F/Ts-RPA-R、Ts-RPA-F1/Ts-RPA-R1、Ts-RPA-F2/Ts-RPA-R2和Ts-RPA-F3/Ts-RPA-R3。引物由北京擎科生物科技有限公司湖南分公司合成。

设计的四组引物及其核苷酸序列如下：

Ts-RPA-F(SEQ ID NO：1)：5’-AAGCTTCTACCAGGTTGAGCAGAGTCCTTG-3’；

Ts-RPA-R(SEQ ID NO：2)：5’-CCTTCCTCAGCGGCAGAGGAAGTATGACCA-3’；

Ts-RPA-F1(SEQ ID NO：3)：5’-CAACGACACACGTAATGCTTTTGCCCCGTT-3’；

Ts-RPA-R1(SEQ ID NO：4)：5’-GTATCCCTTCCTCAGCGGCAGAGGAAGTAT-3’；

Ts-RPA-F2(SEQ ID NO：5)：5’-GCCCCGTTGTGGCCGGCTGGTAAGCTTCTAC-3’；

Ts-RPA-R2(SEQ ID NO：6)：5’-TATCCCTTCCTCAGCGGCAGAGGAAGTATG-3’；

Ts-RPA-F3(SEQ ID NO：7)：5’-CTTCCTCTGCCGCTGAGGAAGGGATACTGAG-3’；

Ts-RPA-R3(SEQ ID NO：8)：5’-TCCACAGCGACATGTGGAGAAGGCTATCGT-3’。

2.2 RPA扩增反应体系

2.3 RPA扩增反应条件

将以上各组分加入反应管中混合并瞬时离心后，置于39℃金属浴中反应20min，得到扩增产物。

2.4 RPA引物的筛选

向上述RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀，12000r/min离心2min，取5μL上清液于2％琼脂糖凝胶中电泳，在紫外光下观察结果。

检测结果如图1所示，其中1泳道为Ts-RPA-F1/Ts-RPA-R1引物组；2泳道为Ts-RPA-F2/Ts-RPA-R2引物组；3泳道为Ts-RPA-F3/Ts-RPA-R3引物组；4泳道为Ts-RPA-F/Ts-RPA-R引物组。结果显示：只有Ts-RPA-F/Ts-RPA-R引物组扩增出的条带最清晰且没有杂带，为检测柑橘半穿刺线虫的最佳RPA引物组合。

实施例3柑橘半穿刺线虫RPA-LFD检测方法的建立

3.1 RPA-LFD引物及探针的设计与合成

选择实施例2中筛选获得的Ts-RPA-F(SEQ ID NO：1)和Ts-RPA-R(SEQ ID NO：2)作为RPA-LFD引物，并依据RPA探针设计原则，在该引物扩增片段中设计探针Ts-RPA-P。所有引物和探针均由北京擎科生物科技有限公司合成，引物和探针的核苷酸序列如下：

Ts-RPA-F(SEQ ID NO：1)：5’-AAGCTTCTACCAGGTTGAGCAGAGTCCTTG-3’；

Ts-RPA-R(SEQ ID NO：2)：5’-CCTTCCTCAGCGGCAGAGGAAGTATGACCA-3’；

Ts-RPA-P(SEQ ID NO：9)：5’-GAGAGGACAAGCCAGTTTGTTGGGAGCTGTCGCTGCTTCTGGCATC-3’；

其中反向引物Ts-RPA-R核苷酸序列的5’端用生物素Biotin标记；探针Ts-RPA-P核苷酸序列的5’端用荧光素FAM标记，距离5’端31bp处的碱基用四氢呋喃(THF)替代，3’端用C3-spacer阻断。获得的序列如下所示：

Ts-RPA-R：5’-[Biotin]CCTTCCTCAGCGGCAGAGGAAGTATGACCA-3’；

Ts-RPA-P：5’-[FAM]GAGAGGACAAGCCAGTTTGTTGGGAGCTGT[THF]GCTGCTTCTGGCATC[C3-spacer]-3’；

3.2 RPA-LFD扩增反应体系

3.3 RPA-LFD扩增反应条件

3.4 RPA-LFD扩增反应结果判定

RPA反应结束后，取5μL扩增产物与95μL检测缓冲液混匀制备混合液，将侧流层析试纸条上样区置于混合液中，室温放置5min后观察结果。若试纸条上质控线和检测线均出现条带时，检测结果为阳性，表明待测样品中含有柑橘半穿刺线虫；若试纸条上仅质控线出现条带时，则检测结果为阴性，表明待测样品中不含有柑橘半穿刺线虫；若试纸条上仅检测线出现条带或不出现任何条带，表明检测结果为无效。

检测结果如图2所示，编号1含有柑橘半穿刺线虫DNA，可以观察到试纸条上质控线和检测线均出现条带；编号2为阴性对照，则试纸条上仅质控线出现条带。

实施例4柑橘半穿刺线虫RPA-LFD特异性检测

收集柑橘半穿刺线虫、南方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫、北方根结线虫、象耳豆根结线虫、拟禾本科根结线虫、水稻潜根线虫、旱稻孢囊线虫、肾形肾状线虫、咖啡短体线虫、中华隐皮孢囊线虫、双宫螺旋线虫和燕麦滑刃线虫，分别提取其DNA作为模板，按照实施例3中的方法进行RPA-LFD检测，以验证柑橘半穿刺线虫RPA-LFD检测方法的特异性。表1为各供试样本的植物线虫群体种类及来源。

表1供试的植物线虫群体种类及来源

检测结果如图3所示，其中编号1～17采用表1中的供试样本，编号18为阴性对照。结果显示：编号1～4(含有柑橘半穿刺线虫DNA)试纸条上质控线和检测线均出现条带，其它13个样本和阴性对照的试纸条上仅质控线出现条带。

结果表明本发明所述的RPA-LFD引物和探针在检测柑橘半穿刺线虫时具有高度的特异性。

实施例5柑橘半穿刺线虫RPA-LFD灵敏度检测

取0.5g含有100条柑橘半穿刺线虫2龄幼虫的土壤，利用试剂盒提取土壤总DNA，按10倍梯度稀释成6个浓度，则每0.5g土壤中分别含有100～1.0×10^-3条2龄幼虫，将各个浓度梯度各取2μL作为模板，按照实施例3中的方法进行RPA-LFD检测。

同时以上述各个浓度梯度的DNA为模板，以柑橘半穿刺线虫特异性引物Ts-SF(5’-TACCAGGTTGAGCAGAGTTCTT-3’)和Ts-SR(5’-TCCTACCCTTCCACAGCGAAAATCCACC-3’)为引物，进行常规PCR检测。PCR扩增反应采用25μL体系：10×EasyTaq buffer(含Mg²⁺)3μL，2.5mmol/L dNTPs2μL，10μmol/L引物Ts-SF和Ts-SR各1μL，5U/μL EasyTaq DNA Polymerase0.5μL，模板DNA 1μL，ddH₂O补足至25μL。PCR扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

RPA-LFD检测结果如图4所示，其中编号1～7分别为：0.5g土壤中分别含有100、10、1、10^-1、10^-2、10^-3条2龄幼虫和阴性对照。结果显示：编号1～5试纸条上质控线和检测线均出现条带，其它样本和阴性对照的试纸条上仅质控线出现条带。采用RPA-LFD方法检测土壤中的柑橘半穿刺线虫，其检测灵敏度可达到0.01条2龄幼虫。

常规PCR电泳检测结果如图5所示，其中1～7泳道分别为：0.5g土壤中分别含有100、10、1、10^-1、10^-2、10^-3条2龄幼虫和阴性对照。结果显示：当DNA浓度稀释至0.1条2龄幼虫时，可观察到扩增条带，继续稀释时则不能观察到扩增条带，表明常规PCR检测灵敏度为0.1条2龄幼虫。

上述结果说明，本发明所述的RPA-LFD引物、探针及检测方法可在0.5g土壤中检测到0.01条柑橘半穿刺线虫2龄幼虫，比常规PCR的检测灵敏度高10倍，具有极高的检测灵敏度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院麻类研究所

<120> 一种检测柑橘半穿刺线虫的引物和探针组合及其应用

<130> MP2007557

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagcttctac caggttgagc agagtccttg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccttcctcag cggcagagga agtatgacca 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caacgacaca cgtaatgctt ttgccccgtt 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtatcccttc ctcagcggca gaggaagtat 30

<210> 5

<211> 31

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccccgttgt ggccggctgg taagcttcta c 31

<210> 6

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tatcccttcc tcagcggcag aggaagtatg 30

<210> 7

<211> 31

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cttcctctgc cgctgaggaa gggatactga g 31

<210> 8

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tccacagcga catgtggaga aggctatcgt 30

<210> 9

<211> 46

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gagaggacaa gccagtttgt tgggagctgt cgctgcttct ggcatc 46

Claims

1.一种检测柑橘半穿刺线虫的引物和探针组合，其特征在于，包括正向引物Ts-RPA-F、反向引物Ts-RPA-R、探针Ts-RPA-P；

所述正向引物Ts-RPA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述反向引物Ts-RPA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述探针Ts-RPA-P的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，所述反向引物Ts-RPA-R核苷酸序列的5’端标记有生物素；探针Ts-RPA-P核苷酸序列的5’端标记有荧光素，距离5’端至少31bp处的碱基进行脱碱基位点修饰，3’端修饰有阻断聚合酶扩增的基团。

3.如权利要求1或2所述的引物和探针组合在制备检测柑橘半穿刺线虫的试剂或试剂盒中的应用。

4.一种基于RPA技术检测柑橘半穿刺线虫的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的引物和探针组合，以及RPA冻干酶粉、Rehydration Buffer、MgAc、ddH₂O、检测缓冲液、侧流层析试纸条中的一种或几种。

5.一种基于RPA技术检测柑橘半穿刺线虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的DNA；

(2)以所述待测样品的DNA为模板，利用如权利要求1或2所述的引物和探针组合或如权利要求4所述的试剂盒进行RPA扩增；

(3)根据步骤(2)中RPA扩增的结果判定所述待测样品中是否含有柑橘半穿刺线虫。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述RPA扩增的反应体系为：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述RPA扩增的反应条件为：25～45℃反应5～60min。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中利用如权利要求4所述的试剂盒进行RPA扩增，步骤(3)为：将扩增产物与检测缓冲液混匀制备混合液，将侧流层析试纸条上样区置于混合液中，室温放置2～6min后观察结果；若侧流层析试纸条的质控线和检测线均出现条带时，检测结果为阳性，表明待测样品中含有柑橘半穿刺线虫；若试纸条上仅质控线出现条带时，则检测结果为阴性，表明待测样品中不含有柑橘半穿刺线虫；若试纸条上仅检测线出现条带或不出现任何条带，表明检测结果为无效。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述待测样品为线虫样品、植物根组织样品或土壤样品中的一种或几种。