CN104789658A - 一种快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增引物及其应用 - Google Patents

一种快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增引物及其应用。所述引物包括引物对TSF3/TSB3和引物对TSFIP/TSBIP，引物的序列分别如SEQ ID NO.1～4所示。本发明以该引物建立了环等温扩增方法，以样品DNA为模板进行环等温扩增，反应结束后可通过两种方式判断结果：一是扩增产物进行电泳，出现特异阶梯状条带的样品判定为阳性；二是通过向反应体系中加入SYBR green I，通过肉眼观察出现颜色变化的样品为阳性。该环等温扩增方法对仪器设备要求低、快速、安全、特异性好、敏感性强，为柑橘半穿刺线虫的检测，尤其是基层检疫单位对柑橘半穿刺线虫的快速检测工作提供了技术支持，具有很好的推广应用价值。

Description

一种快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增引物及其应用
技术领域
 本发明属于植物病原检测技术领域。更具体地，涉及一种快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增引物及其应用。
背景技术
在柑橘根围有多种的植物寄生线虫，但只有少数的几种能对柑橘的产量造成影响，其中柑橘半穿刺线虫危害最严重的一种线虫，每年造成10～30%柑橘产量的损失。柑橘半穿刺线虫（Tylenchulus semipenetrans）分布广泛，目前在世界各个主要的柑橘种植区域都发现该种线虫。在美国，高达60～90%的柑橘园受到这种线虫的危害。在国内，这种线虫危害也非常普遍，如在四川省的柑橘园柑橘半穿刺线虫的发病率达到87.14%，在云南省发病率甚至达到100%。
柑橘半穿刺线虫危害后会引起柑橘的“慢性衰退病”。这种病的诊断非常困难，因为该病的症状主要是黄化、萎蔫、植株生长缓慢、叶片较小和较少、果实较小和产量下降，这些症状与由于缺水或缺乏营养导致的症状类似。目前，准确的诊断该病的唯一方法就是鉴定土壤中是否存在柑橘半穿刺线虫。这就需要进行土壤采样，然后鉴定线虫种类和测量柑橘半穿刺线虫的数量。
然而，目前还主要是通过形态学鉴定半穿刺线虫，但是形态学鉴定需要认真的观察线虫的形态和测量线虫线虫不同结构的大小，这要求鉴定的人员有多年的线虫鉴定经验，专业要求很高。刘国坤首先开发出一种通过PCR方法鉴定柑橘半穿刺线虫的方法；但是，该方法需要使用昂贵的PCR仪，而且，还需要进行电泳检测，对操作人员的技术要求较高，同样不利于在基层检测单位中推广和使用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有柑橘半穿刺线虫检测技术的不足，提供一种安全、简单、快速、特异性高、敏感性好的检测柑橘半穿刺线虫的等温PCR方法，该方法仅需要使用恒温水浴，而且可以通过裸眼观察直接判断样品中是否含有靶标的柑橘半穿刺线虫。
本发明的目的是提供一种快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增引物。
本发明另一目的是提供上述环等温扩增引物的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增引物，包括引物对TSF3/ TSB3和引物对TSFIP/ TSBIP；引物TSF3的序列如SEQ ID NO.1所示），引物TSB3的序列如SEQ ID NO.2所示，引物TSFIP的序列如SEQ ID NO.3所示，引物TSBIP的序列如SEQ ID NO.4所示。
上述环等温扩增引物在检测柑橘半穿刺线虫方面的应用或者在制备检测柑橘半穿刺线虫的试剂或试剂盒方面的应用，也都应在本发明的保护范围之内。
一种快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增方法，该方法是以样品DNA为模板，利用上述引物对TSF3/ TSB3和引物对TSFIP/ TSBIP进行环介导等温扩增反应。
所述环介导等温扩增反应结果的判定方法为：将扩增产物进行凝胶电泳，如果出现特异性阶梯状条带，则判定样品中含有柑橘半穿刺线虫DNA，即为柑橘半穿刺线虫阳性；或者向扩增产物中加入SYBR green I或钙黄绿素，如果扩增产物由橘红色变为浅绿色，则判定样品中含有柑橘半穿刺线虫DNA，即为柑橘半穿刺线虫阳性。
优选地，所述环等温扩增方法的反应体系为：1μL DNA，引物TSFIP和TSBIP各1.6μM，引物TSF3和TSB3各0.2μM，dNTP 0.35 μM，2.5μL 10×BST2.0 DNA聚合酶缓冲液，0.8M甜菜碱，1.5 μL MgSO4(100 mM)，1 μL BST2.0 DNA聚合酶，余量ddH2O补足，共25 μL。
优选地，所述环等温扩增方法的反应条件为：65℃反应60min。
一种快速检测柑橘半穿刺线虫的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物对TSF3/ TSB3和引物对TSFIP/ TSBIP。
所述试剂盒所使用的检测方法即为上述环等温扩增方法。
上述环等温扩增方法或上述试剂盒在检测柑橘半穿刺线虫方面的应用也都在本发明的保护范围之内。
本发明通过大量的研究和探索，最终得到的引物对TSF3/ TSB3和引物对TSFIP/ TSBIP配方使用，建立的环等温扩增方法，不仅能够非常特异的检测柑橘半穿刺线虫，而且检测灵敏性达到了单条，甚至是0.1条的灵敏度，检测效果非常好。而且环等温扩增方法不需要依赖于任何昂贵的仪器，对实验检测人员的要求也很低，是一种安全、简单、快速、成本低的检测方法。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一组快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增引物。所述引物特异性强、灵敏度好、且具有很好的重复性。本发明利用所述引物进行环介导等温扩增反应检测柑橘半穿刺线虫，检测灵敏性达到了单条，甚至是0.1条的灵敏度。
本发明仅需使用简单的恒温仪器就能完成全部的检测，不需要依赖于任何昂贵的仪器，并且检测时间仅为60min，比普通的RT-PCR提前了2～3h，简单快速、对环境要求低、无需大型仪器，非常适合在基层检测单位中使用。
另外，本方法检测结果的判定方法多样，可根据实际情况进行选择。本方法还可以实现扩增反应结果的可视化，准确可靠，无需电泳检测，不使用溴化乙锭，保障了工作人员的安全，为柑橘半穿刺线虫的检测，尤其是检验检疫工作提供了技术支持，具有非常好的推广应用价值。
附图说明
图1为不同退火温度对扩增效率的影响。
图2为反应时间与LAMP产物的量的关系；图中100、80、50、10、1和0.1表示使用的DNA来自于100、80、50、10、1和0.1条柑橘半穿刺线虫，CK表示使用灭菌水作为模板；图中Y轴为荧光强度，X轴为反应的循环数，每个循环为2min。
图3为LAMP检测柑橘半穿刺线虫的电泳检测图；图中0.1、1、10和100表示使用的DNA来自于0.1、1、10和100条柑橘半穿刺线虫，CK表示使用灭菌水作为模板，M为DNA分子量marker。
图4为LAMP检测柑橘半穿刺线虫的可视化检测效果图；图中0.1、1、10和100表示使用的DNA来自于0.1、1、10和100条柑橘半穿刺线虫，CK表示使用灭菌水作为模板。
图5为LAMP检测柑橘半穿刺线虫的特异性；图中1～5为不同种群的柑橘半穿刺线虫，6～21为非靶标线虫（具体种类见表1），22为阴性对照。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
本发明所述的“0.1条柑橘半穿刺线虫的DNA模板”是指用1条线虫提取的DNA稀释10倍后的DNA模板。其中用1条线虫提取DNA的方法采用Subbotin et al. (2008)所述方法进行。
实施例1 引物的设计
根据NCBI中柑橘半穿刺线虫的ITS DNA序列（基因登录号为：FJ969705、GU433381 JN112270、JN112269、GU433403、GU433405 ）设计引物，引物设计使用软件PRIMEREXPLORER v.4 software (http://primerexplorer.jp)进行。
设计的引物及其序列如下：
TSF3（如SEQ ID NO.1所示）：
GCATCTGGCGAGTCTGTG。
TSB3（如SEQ ID NO.2所示）：
GCACCGAATCTGGAACTCAT。
TSFIP（如SEQ ID NO.3所示）：
CRGGTAAGAGCCGAgaAGGACAggatccGTCATACTTCCTCTgcCGCT。
TSBIP（如SEQ ID NO.4所示）：
TGTAACGCTGAGCgaCTGTTGAttttttGCGACATGTGGAGAAGGC。
实施例2 引物反应条件优化
1、反应温度（引物退火温度）优化
使用柑橘半穿刺线虫DNA作为模板，优化上述引物的退火温度。
（1）提取DNA
所述DNA的提取按照本领域常规方法进行。本实施例是采用Subbotin et al. (2008)所述方法进行，具体如下：通过离心法收集线虫或在体视镜下挑取1条线虫，然后加入16 μL 灭菌双蒸水，2 μL 10×PCR buffer (无Mg2+) (购于Takara)和 2 μL 蛋白酶 K (600 mAnson U/mL) (购于Takara)，接着用针头切割线虫，随后把该混合物置于65℃中1h和95℃中15min。
（2）PCR反应
PCR反应体系为：1μL DNA，引物TSFIP/TSBIP各1.6μM，引物TSF3/TSB3各0.2μM，dNTP 0.35 μM，2.5μL 10×BST2.0 DNA聚合酶butter（BST2.0 DNA polymerase buffer），0.8M甜菜碱，1.5 μL MgSO4(100 mM)，1 μL BST2.0 DNA聚合酶（BST2.0 DNA polymerase）和余量ddH2O，共25 μL。
PCR反应条件：温度分别取58℃、60℃、62℃、63℃、65℃、67℃、68℃，反应90 min。
（3）反应结束后，各组分别取10μL PCR产物用2%琼脂糖电泳分离，结果如附图1所示，表明该组特异引物在温度为62～68℃时扩增出典型LAMP产物。其中，反应温度为65～67℃时，合成效率最高，再综合考虑其他因素，选择65℃作为最佳反应温度。
2、反应时间优化
由于LAMP反应时间过长会增加假阳性机会，然而反应时间过短则会产生假阴性的结果，因此我们使用实时荧光PCR仪来优化反应时间。
PCR反应体系为：1μL DNA，引物TSFIP/TSBIP各1.6μM，引物TSF3/TSB3各0.2μM，dNTP 0.35 μM，2.5μL 10×BST2.0 DNA聚合酶butter（BST2.0 DNA polymerase buffer），0.8M甜菜碱，1.5 μL MgSO4(100 mM)，1 μL BST2.0 DNA聚合酶（BST2.0 DNA polymerase），另外再加入1.5μL 20×EvaGreen荧光染料（购于广州美津生物），余量ddH2O补足，共25 μL。
反应在65℃下进行，每两分钟采集一次荧光信号。
结果如附图2所示，反应到达平台期的时间与靶标线虫的数量成负相关，在柑橘半穿刺线虫数量较多时（100条）反应40min中荧光强度达到最大值，在线虫数量较小时（0.1条），反应60min能达到最大值。
综上所述，我们选择的反应条件为65℃反应60min。
实施例3LAMP反应的可视化检测及检测灵敏性
1、综上所述，本发明建立的快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增方法如下：
PCR反应体系为：1μL DNA，引物TSFIP/TSBIP各1.6μM，引物TSF3/TSB3各0.2μM，dNTP 0.35 μM，2.5μL 10×BST2.0 DNA聚合酶缓冲液（BST2.0 DNA polymerase buffer），0.8M甜菜碱，1.5 μL MgSO4(100 mM)，1 μL BST2.0 DNA聚合酶（BST2.0 DNA polymerase），余量ddH2O补足，共25 μL。
反应条件：65℃反应60min。
2、根据上述反应体系和优化后的反应条件进行LAMP反应，反应结束后，不仅能通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，还能够通过添加SYBR Green I染料或钙黄绿素进行可视化检测，结果判断方法更灵活、更方便。
3、分别以不同浓度的柑橘半穿刺线虫DNA为模板，以上述反应体系和反应条件进行LAMP反应，反应结束后，使用2%琼脂糖凝胶电泳对上述产物进行检测，结果如附图3所示。
同时，在LAMP反应产物中加入1μL 5000×SYBR Green I染料（购自鼎国生物，使用前加入灭菌水稀释至5000X的浓度）混匀后观察结果，阳性产物呈现出由橘红色变为荧光黄或荧光绿色的颜色变化（如附图4所示）（具体颜色的深浅由产物的含量决定），说明验证可视化结果的准确。
电泳检测与可视化的结果一致，也说明了本发明检测方法结果的稳定性和可靠性。
同时上述结果也说明了本发明所述的LAMP反应方法能检测到0.1条柑橘半穿刺线虫的DNA模板，具有非常好的检测灵敏性。
实施例4 LAMP反应的特异性
1、为验证本发明引物和LAMP反应体系的有效性和特异性，我们同时使用了多个不同种群的柑橘半穿刺线虫和其他非靶标的线虫作为模板进行检测，具体线虫种类如表1所示。
表1 实验使用的线虫种群及对应的可视化检测结果
2、PCR反应体系和条件与实施例3相同。DNA模板分别提取自表1中各种群的单条线虫。
3、结果如附图5所示，只有1～5的靶标线虫（柑橘半穿刺线虫）颜色变化，即出现了橘红色变为荧光黄。说明本发明所述的LAMP反应方法能有效的检测不同种群的靶标线虫（柑橘半穿刺线虫）。并且对非靶标线虫不会有非特异性的扩增，即对非靶标线虫均呈现阴性。
同时也说明了本发明所述的LAMP反应方法能有效的检测到单条的靶标线虫，不仅特异性非常好，还具有非常好的检测灵敏性，能够满足实际检测和定量工作的需要。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  华南农业大学
 
<120>  一种快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增引物及其应用
 
<130> 
 
<160>  4    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  18
<212>  DNA
<213>  引物TSF3
 
<400>  1
gcatctggcg agtctgtg                                                   18
 
 
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  引物TSB3
 
<400>  2
gcaccgaatc tggaactcat                                                 20
 
 
<210>  3
<211>  48
<212>  DNA
<213>  引物TSFIP
 
<400>  3
crggtaagag ccgagaagga caggatccgt catacttcct ctgccgct                  48
 
 
<210>  4
<211>  46
<212>  DNA
<213>  引物TSBIP
 
<400>  4
tgtaacgctg agcgactgtt gattttttgc gacatgtgga gaaggc                    46
 
 

Claims (10)

1.一种快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增引物，其特征在于，包括引物对TSF3/ TSB3和引物对TSFIP/ TSBIP；引物TSF3的序列如SEQ ID NO.1所示，引物TSB3的序列如SEQ ID NO.2所示，引物TSFIP的序列如SEQ ID NO.3所示，引物TSBIP的序列如SEQ ID NO.4所示。
2. 权利要求1所述环等温扩增引物在检测柑橘半穿刺线虫方面的应用。
3. 权利要求1所述环等温扩增引物在制备检测柑橘半穿刺线虫的试剂或试剂盒方面的应用。
4. 一种快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增方法，其特征在于，该方法是以样品DNA为模板，利用权利要求1所述引物对TSF3/ TSB3和引物对TSFIP/ TSBIP进行环介导等温扩增反应。
5. 根据权利要求4所述环等温扩增方法，其特征在于，所述环介导等温扩增反应结果的判定方法为：将扩增产物进行凝胶电泳，如果出现特异性阶梯状条带，则判定样品中含有柑橘半穿刺线虫DNA，即为柑橘半穿刺线虫阳性；
或者向扩增产物中加入SYBR green I或钙黄绿素，如果扩增产物由橘红色变为浅绿色，则判定样品中含有柑橘半穿刺线虫DNA，即为柑橘半穿刺线虫阳性。
6. 根据权利要求4所述环等温扩增方法，其特征在于，所述环等温扩增方法的反应体系为：1μL DNA，引物TSFIP和TSBIP各1.6μM，引物TSF3和TSB3各0.2μM，dNTP 0.35 μM，2.5μL 10×BST2.0 DNA聚合酶缓冲液，0.8M甜菜碱，1.5 μL MgSO4(100 mM)，1 μL BST2.0 DNA聚合酶，余量ddH2O补足，共25 μL。
7. 根据权利要求4所述环等温扩增方法，其特征在于，所述环等温扩增方法的反应条件为：65℃反应60min。
8. 一种快速检测柑橘半穿刺线虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物对TSF3/ TSB3和引物对TSFIP/ TSBIP。
9. 根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒所使用的检测方法为权利要求4所述环等温扩增方法。
10. 权利要求4所述环等温扩增方法或权利要求8所述试剂盒在检测柑橘半穿刺线虫方面的应用。
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