CN103333960B - 转基因棉花t304-40的品系特异性检测方法及其试剂盒 - Google Patents
转基因棉花t304-40的品系特异性检测方法及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及转基因棉花T304-40的品系特异性检测方法及其试剂盒。本发明首次揭示一种可特异性鉴定转基因棉花T304-40成分的引物及探针，所述引物及探针基于转基因棉花T304-40品系基因组中外源插入基因区域与棉花基因组DNA邻接区的5’和3’端旁邻序列设计，对于含有转基因棉花T304-40DNA的样品可发生特异性扩增，而对没有转基因棉花T304-40DNA的样品不发生特异性扩增。因而，所述引物可良好地应用于鉴定转基因棉花T304-40品系及其制品，并且具有良好的再现性、灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和核酸检测技术领域。更具体地，本发明涉及转基因棉花T304-40成分的品系特异性检测方法及其试剂盒。
背景技术
2012年，全球转基因作物种植面积达到1.703亿公顷，比2011年增长了6%。作为转基因作物商业化的第17年，在连续16年(1996-2011年)的增长后，2012年转基因作物种植面积持续增加。这一增长使得转基因技术以可观的利润成为现代农业史上应用最迅速的作物技术。
抗虫基因产品继耐除草剂产品之后在转基因作物产品中位居第二，如抗虫水稻、抗虫玉米、抗虫棉花等。2012年，印度和中国继续扩大转Bt基因抗虫棉花的种植面积。。转基因作物给人们带来巨大经济利益的同时，其可能存在的食品和生态安全问题也备受关注。为了加强转基因产品的安全监管，世界各国制订了一系列法律法规和政策来规范转基因作物种植、加工、运输、销售等各个环节，以维护消费者的切身利益。
在我国，除了Mon531，Mon1445，Mon15985，Mon88913和LLcotton25五种转基因棉花品系获得我国农业部颁发的农业转基因生物安全证书以外，还有很多转基因棉花品系未获得批准，棉花T304-40就是其中之一。转基因棉花T304-40品系是由拜耳公司研发的一种同时具有抗虫和耐除草剂复合性状的转基因棉花品种。这两个性状的产生是在常规棉中插入了杀虫(主要是鳞翅目昆虫)晶体蛋白Cry1Ab基因和耐草铵膦除草剂bar基因。目前该品系已在美国和加拿大种植。
我国每年从澳大利亚、美国等国家进口转基因棉籽（粕），但我国目前还未批准转基因棉花T304-40品系的安全证书。同时国内外还缺乏转基因棉花T304-40品系的检测方法。因此为了加强我国相关部门对转基因作物的安全检测和监管，防止未经我国安全性评价的转基因棉花品系进境，研发转基因棉花T304-40品系的检测方法至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供转基因棉花T304-40的品系特异性检测方法及其试剂盒。
在本发明的第一方面，提供一种鉴定转基因棉花T304-40成分的方法，所述方法包括：
以待测样品的DNA为模板，以引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含转基因棉花T304-40成分；
所述的引物选自：
(a)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对；或
(b)SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物对。
在一个优选例中，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物以及SEQID NO:3所示的荧光探针进行实时荧光PCR检测。
在另一优选例中，以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物以及SEQID NO:6所示的荧光探针进行实时荧光PCR检测。
在本发明的另一方面，提供用于鉴定转基因棉花T304-40成分的引物，所述的引物选自：
(a)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对；和/或
(b)SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物对。
在本发明的另一方面，提供用于鉴定转基因棉花T304-40成分的荧光探针，所述的探针序列如SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:6所示。
在本发明的另一方面，提供所述的引物和所述的荧光探针的用途，用于从待测样品中鉴定转基因棉花T304-40成分。
在本发明的另一方面，提供一种鉴定转基因棉花T304-40成分的试剂盒，其中包括：
SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物，SEQ ID NO:3所示的荧光探针；和/或
SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物，SEQ ID NO:6所示的荧光探针。
在一个优选例中，所述试剂盒中还包括：含有转基因棉花T304-40成分的DNA的检测阳性对照物质。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：DNA提取试剂，PCR缓冲液，DNA聚合酶，和/或说明鉴定转基因棉花T304-40成分的方法的使用说明书。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、18SrRNA(A)和ACP1(B)实时荧光PCR扩增结果。
图2、建立的转基因棉花T304-40品系检测方法的特异性实验结果。A、应用T304-40-FP1/RP1/P1引物和探针。B、应用T304-40-FP2/RP2/P2引物和探针。
图3、建立的转基因棉花T304-40品系检测方法的标准曲线(A)以及直线方程(B)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究和试验，根据转基因棉花T304-40基因组中转基因区域(插入片段)与棉花基因组DNA邻接区的3’端和5’端的旁邻序列，分别筛选到一套引物和探针，建立了转基因棉花T304-40的品系特异性检测方法。实验结果表明，建立的检测方法特异性好、灵敏度高，可以用于日常定性和定量的检测。采用所述的引物配合荧光探针，可良好地应用于鉴定转基因棉花T304-40成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。两套引物探针的组合应用将更加提高特异性和灵敏度。
目前开发有效的鉴定各种转基因产品的方法的难点在于在转基因作物品系两端旁邻序列的十分有限的碱基序列上，设计检测灵敏、反应高效的特异性引物和探针。为此，本发明人经过深入的研究和大量的筛选，设计了合适的检测引物和探针，基于此开发了实时荧光PCR检测转基因棉花T304-40品系及其制品的方法。
本发明人通过对引物的筛选，获得一类可特异性鉴定转基因棉花T304-40成分的引物，其对于转基因棉花T304-40的DNA发生特异性扩增，而对没有转基因棉花T304-40的DNA不发生特异性扩增。
因此，本发明提供一种引物，所述的引物具SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或所述的引物具SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
本发明的这些引物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。
为了配合引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的扩增产物的检测，本发明还提供一种探针，所述的探针具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；较佳地，所述的探针是荧光探针，从而便于实时荧光检测。
为了配合引物SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的扩增产物的检测，本发明还提供一种探针，所述的探针具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；较佳地，所述的探针是荧光探针，从而便于实时荧光检测。
利用本发明的引物及探针，只需进行常规的PCR反应和/或琼脂糖凝胶电泳，并通过判断相应的PCR产物的有无，就可以准确、快速地判断待测样品是否含有转基因棉花T304-40成分，而且所需的样品量很少。
基于本发明所提供的适用于鉴定转基因棉花T304-40成分的特异性引物及探针，本发明还提供了一种鉴定转基因棉花T304-40成分的方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物或SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含转基因棉花T304-40成分。
聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明的方法可采用常规的PCR技术进行。
作为本发明的优选方式，利用所述引物，采用实时荧光PCR方法来进行转基因棉花T304-40成分的鉴定。TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan探针和荧光探针。荧光探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-FluorescentQuencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有荧光修饰基团。
获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。
本发明还涉及一种用于鉴定转基因棉花T304-40成分的试剂盒，所述试剂盒中含有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物，和/或含有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物；更佳地，所述的试剂盒中还含有SEQ ID NO:3所示的探针和/或含有SEQ ID NO:6所示的探针。
此外，所述的试剂盒还可含有其它鉴定转基因棉花T304-40成分的试剂，如(但不限于)：
(A)各种PCR反应用试剂，例如但不限于：Taq酶，PCR缓冲液，dNTP，DNA聚合酶等；或
(B)各种提取DNA(即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如但不限于：酚、氯仿、异戊醇、NaCl等；或
(C)提取DNA的试剂盒。
此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定转基因棉花T304-40成分的使用说明书和/或标准操作程序。
本发明所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测转基因棉花T304-40成分的目的。
本发明的主要优点在于：
(1)首次揭示一种可特异性鉴定转基因棉花T304-40成分的引物，所述的引物特异性良好，对于转基因棉花T304-40能够实现特异性扩增，而对于转基因棉花T304-40成分以外的其它转基因棉花品系或其它转基因作物品系则不能特异性扩增。并且，所述引物具有良好的再现性、结果稳定可靠。
(2)利用所述的引物或含有所述引物的检测试剂盒，可快速、大批量地检测转基因棉花T304-40成分，从待测样品中快速准确地鉴定是否含有转基因棉花T304-40成分，并且所需样品量少，操作简单。
(3)较佳地，本发明应用荧光实时荧光PCR技术，可快速实现农产品、饲料和食品中转基因棉花T304-40成分的准确鉴定。
(4)本发明的方法的推广应用对保障农产品的质量安全，保护消费者知情权和选择权，加强我国相关部门对转基因产品的监管，维护正常的经济秩序等提供了技术支持。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
I、材料与方法
材料
10%(w/w)转基因棉花T304-40标准品(ERM-BF429c)以及非转基因棉籽应用于检测方法的建立。
常见植物材料包括转基因棉花品系GHB119、GK19、281-24-236×3006-210-23、SGK321、MON88913、MON531、MON15985、和MON1445；转基因玉米品系MON98140、NK603、CBH351、Bt11和MON810；转基因大豆品系305423、MON89788、RRS和356043；转基因大米品系TT51-1以及转基因油菜T45品系，用于转基因棉花T304-40品系检测方法的特异性鉴定。
DNA提取
称取100mg样品，使用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)并按其操作步骤提取样品基因组DNA。具体操作程序如下：
(1)用冷冻研磨机将各植物样品在液氮中研磨成均匀的粉末。
(2)称取100mg研磨好的粉末，迅速转移到预先装有700μL65℃预热缓冲液GP1的离心管中，迅速颠倒混匀，将离心管放在65℃恒温震荡孵育器中孵育1个小时。
(3)加入700μL氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5分钟。
(4)将上一步上层水相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。
(5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。(吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心)。
(6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(8)重复步骤7。
(9)将吸附柱CB3放入收集管中，12,000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3开盖置于室温放置5分钟，以晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空60μL洗脱缓冲液TE，室温放置5分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
提取的DNA测定浓度后，置-20℃保存备用。
引物及探针的设计
分析转基因棉花T304-40品系的外源插入序列与基因组DNA邻接区的3’端和5’端旁邻序列，根据3’端和5’端特异性区域设计一系列实时荧光PCR的引物和探针，经过大量试验研究，最终选择到扩增效果、特异性、敏感性俱佳的PCR扩增引物及探针，该优化的引物和探针序列(T304-P1、T304-P2，两端设置报告基团FAM和猝灭基团BHQ1)见表1所示。
表1、转基因棉花T304-40品系检测引物、探针序列
实时荧光PCR反应条件
实时荧光PCR反应体系总体积为25μL，包含2×TaqMan Master Mix12.5μL，上下游引物各240nM，探针120nM，5μL模板DNA，用去离子水补足至25μL。实时荧光PCR反应参数：95℃，10min；45个循环，95℃，15s；60℃，1min。荧光信号在60℃时收集。
II.实施例
实施例1、建立的实时荧光PCR体系的特异性测试
将提取的转基因棉花T304-40样品DNA，与常见植物材料的DNA溶液均分别以真核生物18S rRNA引物、探针(引物18S-FP：TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA(SEQ ID NO:7)；18S-RP：AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT(SEQ ID NO:8)；探针18S-P：FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAA CC-BHQ1(SEQ ID NO:9))和棉花内源基因ACP1特异性引物、探针(引物ACP1-FP：ATGAACCAGGGAAGAAGCACC(SEQ ID NO:10)；ACP1-RP：CCTTATCCACGGTCTCTTGTTTG(SEQ ID NO:11)；探针ACP1-P：FAM-CATTTACGATGCGTCCAATGCCTG-BHQ1(SEQ ID NO:12))进行扩增，确保DNA的有效提取以适用于实时荧光PCR扩增反应。
实验结果如图1所示。结果表明，当采用18SrRNA引物、探针扩增所有样品DNA时均有显著的荧光信号增幅(A)；当使用棉花内源基因ACP1引物和探针扩增所有样品DNA时，只有以棉花样品的DNA为模板时出现扩增曲线，以其它转基因玉米、大豆、大米、油菜DNA样品为模板时均无扩增曲线(B)，表明所有样品DNA均得到有效提取可以用于接下来的实验研究。
根据转基因棉花T304-40品系的3’端和5’端旁邻序列，本发明人分别筛选了一套引物和探针组合。为了鉴定建立的转基因棉花T304-40实时荧光PCR检测体系的特异性，以棉花和其它常见植物材料DNA为模板，分别采用两套引物和探针进行实时荧光PCR扩增测试。
实验结果如图2A-B所示。结果表明，在两套引物和探针组合的扩增中，均只有当采用转基因棉花T304-40品系DNA为模板的扩增中出现显著的荧光信号增幅，表明设计的两套引物和探针组合均特异于转基因棉花T304-40的检测分析。
实施例2、制备标准曲线
本实施例中，以T304-40-FP2/RP2/P2引物和探针组合为例。
将转基因棉花T304-40DNA溶液测定浓度后，使用0.1×TE缓冲液进行梯度稀释至六个浓度：50ng/μL，10ng/μL，2ng/μL，1ng/μL，0.4ng/μL，0.2ng/μL，用于标准曲线的制备。以DNA溶液浓度(拷贝数)的对数为横坐标，对应的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。
标准曲线、直线方程及扩增效率如图3所示。从图3的结果可知，构建的转基因棉花T304-40品系标准曲线的扩增效率为90.14%；线性相关系数为0.9972，具有很高的扩增效率和线性关系。
对转基因棉花T304-40实时荧光PCR方法的重复性和重演性结果分析见表2。从表2的结果可以看出，建立的实时荧光PCR检测方法的重复性标准偏差(SDr)介于0.02至0.14之间，相对标准偏差(RSDr)在0.06%到0.43%之间，小于25%；重演性标准偏差(SDR)值在0.21以下，相对标准偏差(RSDR)在0.04%到0.63%之间，小于35%，均在可接受范围内，表明建立的检测方法可重复性好，稳定性好。
表2、建立的转基因棉花T304-40品系实时荧光PCR检测方法的重复性和重演性分析
实施例3、灵敏度测试
本实施例中，以T304-40-FP2/RP2/P2引物和探针组合为例。
为了对建立的转基因棉花T304-40品系实时荧光定量PCR检测体系灵敏度进行测试，将转基因棉花T304-40品系DNA溶液梯度稀释至100、50、20、10拷贝/μL，每个浓度设置5个平行，重复4次，共20次反应。检测下限(LOD)的确定需满足≥95%置信区间。
测试结果如表3所示。结果表明，在分别以模板量为5拷贝、10拷贝的20次扩增中分别只有13次、18次出现了明显的扩增信号增幅，不满足检测下限应大于或等于95%的置信区间要求；而在以模板量为25拷贝的20次扩增中均出现了显著的扩增曲线图，平均Ct值为34.31，标准偏差(SD)值为1.44，相对标准偏差(RSD)是4.19%，表明建立的转基因棉花T304-40实时荧光定量PCR检测方法的检测下限(LOD)为25拷贝基因组DNA，其高的灵敏度可满足对转基因棉花T304-40成分检测分析的需求。
表3转基因棉花T304-40品系实时荧光PCR检测方法灵敏度测试结果
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (6)
1.一种鉴定转基因棉花T304-40成分的方法，其特征在于，所述方法包括：
以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物以及SEQ ID NO:3所示的荧光探针进行实时荧光PCR检测；和
以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物以及SEQ ID NO:6所示的荧光探针进行实时荧光PCR检测；
若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含转基因棉花T304-40成分。
2.一种鉴定转基因棉花T304-40成分的试剂盒，其特征在于，其中包括：
SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物，SEQ ID NO:3所示的荧光探针；和
SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物，SEQ ID NO:6所示的荧光探针。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：含有转基因棉花T304-40成分的DNA的检测阳性对照物质。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：DNA提取试剂，PCR缓冲液，DNA聚合酶。
5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：说明鉴定转基因棉花T304-40成分的方法的使用说明书。
6.权利要求2所述的试剂盒的用途，用于从待测样品中鉴定转基因棉花T304-40成分。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |