CN103290130B

CN103290130B - 转基因产品中Cry2Ae基因的检测方法及其试剂盒

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Publication number: CN103290130B
Application number: CN201310234479.0A
Authority: CN
Inventors: 李想; 汪秀秀; 潘良文; 刘月明; 高琴; 吕蓉; 杨捷琳
Original assignee: Shanghai Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of PRC
Current assignee: Shanghai Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of PRC
Priority date: 2013-06-13
Filing date: 2013-06-13
Publication date: 2015-02-04
Anticipated expiration: 2033-06-13
Also published as: CN103290130A

Abstract

本发明涉及转基因产品中Cry2Ae基因的检测方法及其试剂盒。本发明首次揭示一种可特异性鉴定转基因产品中Cry2Ae基因的引物及探针，所述引物及探针对于含有Cry2Ae基因的样品可发生特异性扩增，而对没有Cry2Ae基因的样品不发生特异性扩增。因而，所述引物可良好地应用于鉴定转基因产品中Cry2Ae基因，并且具有良好的再现性、灵敏度。

Description

转基因产品中Cry2Ae基因的检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学和核酸检测技术领域。更具体地，本发明涉及转基因产品中Cry2Ae基因的检测方法及其试剂盒。

背景技术

几乎一个世纪以来，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)因其对昆虫害虫的特异性毒性而被人们用来控制植物的昆虫害虫。Bt是目前世界上应用最广泛、最成功的微生物杀虫剂，也是公认的无公害生物农药。

苏云金芽孢杆菌在处于休眠或者抵抗外界恶劣环境时就会产生由一种或多种蛋白质组成的伴孢晶体又称为δ-内毒素或杀虫晶体蛋白(Bt蛋白)，具有特异性的杀虫能力。

近年来同时也产生了很多表达Bt蛋白的转基因作物，如Bt水稻、Bt玉米、Bt棉花、Bt大豆等。转Bt基因作物的种植不仅给人们带来了巨大的经济效益而且更重要的是减少了杀虫剂的喷洒、节约了劳动力，更好的维护了环境。

根据δ-内毒素或杀虫晶体蛋白的氨基酸序列和杀虫谱的不同，将具有溶血细胞作用的27kDa晶体蛋白基因被命名为Cyt基因，其它只具有杀虫活性的命名为Cry基因。Cry基因可划分不同的亚类，见表1。截至2012年Cry基因已有673种。杀虫晶体蛋白基因Cry1Ab是具有杀鳞翅目昆虫活性的CryⅠ组基因中的一种，它存在于转基因玉米Bt10、Bt11、转基因Bt大米Bt汕忧63、TT51-1等中，目前已有Cry1Ab基因的相关文献报道。其它Cry蛋白基因如Cry1Ac、Cry2Ab等也已经有相关的研究。

表1、Cry蛋白基因分类

然而，插入到转基因植物中的外源Cry2Ae基因目前还未有相应的检测方法。为加强中国的转基因生物安全检测监管，亟需对外源基因Cry2Ae建立相关的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供转基因产品中Cry2Ae基因的检测方法及其试剂盒。

在本发明的第一方面，提供一种鉴定转基因产品中Cry2Ae基因的方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含Cry2Ae基因成分；

所述的引物选自：

(a)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对；

(b)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示的引物对；

(c)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物对；或

(d)SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的引物对。

在一个优选例中，所述的转基因产品是转基因棉花；较佳地为GHB119品系。

在另一优选例中，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物以及SEQID NO:3所示的荧光探针进行实时荧光PCR检测；或

以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示的引物以及SEQ ID NO:3所示的荧光探针进行实时荧光PCR检测；或

以SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物对以及SEQ ID NO:7所示的荧光探针进行实时荧光PCR检测；或

以SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的引物对以及SEQ ID NO:7所示的荧光探针进行实时荧光PCR检测。

在另一优选例中，所述的探针还设置有LNA修饰位点。

在另一优选例中，所述的SEQ ID NO:3中，第9位碱基C进行LNA修饰。

在另一优选例中，所述的SEQ ID NO:7中，第10位碱基A和第11位碱基C进行LNA修饰。

在本发明的另一方面，提供用于鉴定转基因产品中Cry2Ae基因的引物，所述的引物选自：

(a)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对；

(b)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示的引物对；

(c)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物对；或

(d)SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的引物对。

在本发明的另一方面，提供用于鉴定转基因棉花的荧光探针，所述的探针序列如SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:7所示。

在一个优选例中，所述的探针还设置有LNA修饰位点。

在本发明的另一方面，提供所述的引物和所述的荧光探针的用途，用于鉴定转基因产品中Cry2Ae基因。

在本发明的另一方面，提供一种鉴定转基因产品中Cry2Ae基因的试剂盒，其中包括：

SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物，SEQ ID NO:3所示的荧光探针；和/或

SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示的引物，SEQ ID NO:3所示的荧光探针；和/或

SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物，SEQ ID NO:7所示的荧光探针；和/或

SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的引物，SEQ ID NO:7所示的荧光探针。

在一个优选例中，所述试剂盒中还包括：含有Cry2Ae基因的检测阳性对照品。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：DNA提取试剂，PCR缓冲液，DNA聚合酶，和/或说明鉴定转基因产品中Cry2Ae基因的方法的使用说明书。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、18SrRNA(A)和ACP1(B)实时荧光PCR扩增结果。

图2、Cry2Ae基因检测方法的特异性实验。A、应用Cry2E-FP/RP1/P引物和探针。B、应用Cry2e-FP/RP2/P引物和探针。C、应用Cry2E-2FP1/2RP1/P1引物和探针。D、应用Cry2E-2FP2/2RP2/P1引物和探针。

图3、Cry2Ae基因检测方法的标准曲线(A)以及直线方程(B)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究和试验，根据转基因植物(作物)中插入的外源Cry2Ae基因片段，筛选到多套引物和探针组合，建立了Cry2Ae基因的特异性检测方法。实验结果表明，建立的Cry2Ae基因检测方法特异性高、灵敏度高以及重复性好。多套引物探针的组合应用可进一步提高准确性、特异性和灵敏度。

目前开发有效的鉴定各种转基因产品的方法的难点在于在有限的基因序列上，研发检测灵敏、反应高效的特异性检测体系，并实现与其它同源蛋白进行区分、鉴别和检测。为此，本发明人经过深入的研究和大量的筛选，设计了合适的检测引物和探针，并基于此开发了实时荧光PCR检测Cry2Ae基因的方法。

本发明人通过对引物的筛选，获得一类可特异性鉴定Cry2Ae基因的引物，其对于Cry2Ae基因的DNA发生特异性扩增，而对没有Cry2Ae基因的DNA不发生特异性扩增。

因此，本发明提供一种引物，所述的引物具SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或所述的引物具SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；或所述的引物具SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；或所述的引物具SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

本发明的这些引物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。

为了配合引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的扩增产物的检测，本发明还提供一种探针，所述的探针具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；较佳地，所述的探针是荧光探针，从而便于实时荧光检测。

为了配合引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4的扩增产物的检测，本发明还提供一种探针，所述的探针具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；较佳地，所述的探针是荧光探针，从而便于实时荧光检测。

为了配合引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的扩增产物的检测，本发明还提供一种探针，所述的探针具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；较佳地，所述的探针是荧光探针，从而便于实时荧光检测。

为了配合引物SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的扩增产物的检测，本发明还提供一种探针，所述的探针具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；较佳地，所述的探针是荧光探针，从而便于实时荧光检测。

不同的Cry蛋白之间同源性很高，如Cry2Ab1蛋白与Cry2Af蛋白氨基酸序列同源性达到95%，Cry2Ae蛋白与Cry2Aa1蛋白质两者的氨基酸序列有91%的同源性。所以为提高Cry2Ae基因检测的特异性(DNA模板链与探针的识别能力)，本发明人在设计Cry2Ae基因检测探针时进行了锁核苷酸(Locked NucleicAcid，LNA)修饰。锁核酸(LNA)是一种新型的双环状寡核苷酸衍生物，结构中β-D呋喃核糖的2’O，4’C位通过缩水作用形成环形的氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，呋喃糖的结构锁定在C3’内型的N构型，形成了刚性的缩合结构。LNA作为一种新的反义核酸，具有与DNA/RNA强大的杂交亲和力、反义活性、抗核酸酶能力、水溶性好及体内无毒性等优点。

利用本发明的引物及探针，只需进行常规的PCR反应和/或琼脂糖凝胶电泳，并通过判断相应的PCR产物的有无，就可以准确、快速地判断待测样品是否含有Cry2Ae基因，而且所需的样品量很少。

基于本发明所提供的适用于鉴定Cry2Ae基因的特异性引物及探针，本发明还提供了一种鉴定Cry2Ae基因的方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物，或SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示的引物，或SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物，或SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含Cry2Ae基因。

聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明的方法可采用常规的PCR技术进行。

作为本发明的优选方式，利用所述引物，采用实时荧光PCR方法来进行Cry2Ae基因的鉴定。TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan探针和荧光探针。荧光探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有荧光修饰基团。

获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。

本发明还涉及一种用于鉴定Cry2Ae基因的试剂盒，所述试剂盒中含有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物，和/或含有SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:4所示的引物，和/或含有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物，和/或含有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的引物。

更佳地，所述的试剂盒中还含有SEQ ID NO:3所示的探针，和/或含有SEQID NO:7所示的探针。

此外，所述的试剂盒还可含有其它鉴定Cry2Ae基因的试剂，如(但不限于)：

(A)各种PCR反应用试剂，例如但不限于：Taq酶，PCR缓冲液，dNTP，DNA聚合酶等；或

(B)各种提取DNA(即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如但不限于：酚、氯仿、异戊醇、NaCl等；或

(C)提取DNA的试剂盒。

此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定Cry2Ae基因的使用说明书和/或标准操作程序。

本发明所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测Cry2Ae基因的目的。

本发明的主要优点在于：

(1)首次从诸多引物中找到可特异性鉴定Cry2Ae基因的引物，所述的引物特异性良好，对于Cry2Ae基因能够实现特异性扩增，而对于Cry2Ae基因以外的其它相似的Cry基因或其它转基因成分则不能特异性扩增。并且，所述引物具有良好的再现性、结果稳定可靠。

(2)利用所述的引物或含有所述引物的检测试剂盒，可快速、大批量地检测Cry2Ae基因，从待测样品中快速准确地筛查是否含有Cry2Ae基因，并且所需样品量少，操作简单。

(3)较佳地，本发明应用实时荧光PCR技术，可快速实现农产品、饲料和食品中Cry2Ae基因成分的准确鉴定。

(4)考虑到不同的Cry蛋白之间同源性很高导致的Cry2Ae基因鉴定的难点，本发明人在探针上设置LNA修饰，进一步提高了灵敏度和特异性。

(5)本发明的方法的推广应用对保障农产品、饲料和食品的质量安全，保护消费者知情权和选择权，保障转基因产品标识制度的顺利实施，维护正常的经济秩序等提供了技术支持。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

I、材料与方法

材料

10%(w/w)转基因棉花GHB119品系标准品(ERM-BF428c)应用于检测方法的建立。

常见植物材料包括转基因棉花品系T304-40、GK19、281-24-236×3006-210-23、SGK321、MON88913、MON531、MON15985和MON1445；转基因玉米品系MON98140、NK603、Bt11、CBH351和MON810；转基因大豆品系RRS、305423、MON89788和356043；转基因大米品系TT51-1以及转基因油菜T45品系用于建立的Cry2Ae基因检测方法的特异性测试。

DNA提取

称取100mg样品，使用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)并按其操作步骤提取样品基因组DNA。具体操作程序如下：

(1)用冷冻研磨机将植物样品在液氮中研磨成均匀的粉末。

(2)称取100mg研磨好的粉末，迅速转移到预先装有700μL65℃预热缓冲液GP1的离心管中，迅速颠倒混匀，将离心管放在65℃恒温震荡孵育器中孵育1个小时。

(3)加入700μL氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5分钟。

(4)将上一步上层水相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。

(5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。(吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心)

(6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(8)重复步骤7。

(9)将吸附柱CB3放入收集管中，12,000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3开盖置于室温放置5分钟，以晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空100μL洗脱缓冲液TE，室温放置5分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

提取的DNA使用微量分光光度计测定浓度后，置-20℃保存备用。

引物及探针的设计

分析Cry2Ae基因序列及相关Cry蛋白基因序列，设计一系列实时荧光PCR的引物和探针，经过大量试验研究，最终选择到扩增效果、特异性、敏感性俱佳的PCR扩增引物及探针，见表2(其中两端设置报告基团FAM和猝灭基团BHQ1的为探针)。为了提高探针特异性，本发明人经过研究，在探针的一些碱基位点进行了LNA修饰，在表中以“＋”表示。

表2、CRY2e基因检测引物、探针序列

注：A+、C+表示对A、C碱基进行了锁核苷酸修饰。

实时荧光PCR反应条件

实时荧光PCR反应体系总体积为25μL，包含2×TaqMan Master Mix12.5μL，上下游引物各240nM，探针120nM，5μL模板DNA，用去离子水补足至25μL。实时荧光PCR反应参数：95℃，10min；45个循环，95℃，15s；60℃，1min。荧光信号在60℃时收集。

II、实施例

实施例1、实时荧光PCR特异性实验

将提取的转基因棉花GHB119品系样品DNA，与常见植物样品DNA溶液均分别以18SrRNA引物、探针(引物18S-FP：TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA(SEQ ID NO:10)；18S-RP：AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT(SEQ ID NO:11)；探针18S-P：FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-BHQ1(SEQ ID NO:12))和棉花内源基因ACP1特异性引物、探针(引物ACP1-FP：ATGAACCAGGGAAGAAGCACC(SEQ ID NO:13)；ACP1-RP：CCTTATCCACGGTCTCTTGTTTG(SEQ ID NO:14)；探针ACP1-P：FAM-CATTTACGATGCGTCCAATGCCTG-BHQ1(SEQ ID NO:15))进行扩增，确保DNA的有效提取以适用于实时荧光PCR扩增反应。

实验结果如图1所示。结果表明，当采用18SrRNA引物探针扩增所有样品DNA时均有显著的荧光信号增幅；当使用棉花内源基因ACP1引物和探针扩增所有样品DNA时，只有以棉花样品的DNA为模板时出现扩增曲线，其它非棉花品系为模板时均无扩增曲线，表明所有样品DNA均得到有效提取可以用于接下来的实验研究。

本发明人根据Cry2Ae基因特异性序列，共选择到4套引物和探针组合。为了鉴定建立的Cry2Ae基因检测体系的特异性，以常见转基因作物品系样品DNA为模板，分别采用四套引物和探针进行实时荧光PCR扩增测试。

实验结果如图2所示。结果表明，在四套引物和探针组合的扩增中，均只有当采用转基因棉花GHB119品系(含有Cry2Ae基因)DNA为模板的扩增中出现显著的荧光增幅，表明设计的4套引物和探针组合均特异于Cry2Ae基因的检测分析。

实施例2、制备标准曲线

本实施例中，以CRY2E-2FP2/CRY2E-2RP2/CRY2E-P1引物和探针组合为例。

利用转基因棉花GHB119(10%的标准品)样品为模板来制备标准曲线。首先测定转基因棉花GHB119DNA溶液浓度，然后使用0.1×TE缓冲液进行梯度稀释至六个浓度：50ng/μL，10ng/μL，2ng/μL，1ng/μL，0.4ng/μL，0.2ng/μL，用于标准曲线的制备。以DNA溶液浓度(拷贝数/μL)的对数为横坐标，对应的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。

标准曲线、直线方程及扩增效率如图3所示。从图3的结果知，构建的标准曲线扩增效率为90.07%；线性相关系数R²为0.9979，具有很高的扩增效率和线性关系。

另外Cry2Ae基因实时荧光PCR方法的重复性和重演性结果分析见表3所示。从表3的结果可以看出，Cry2Ae基因实时荧光PCR检测方法的重复性标准偏差(SD^r)介于0.01与0.05之间，相对标准偏差(RSD^r)在0.04%到0.19%之间，小于25%；重演性标准偏差(SD^R)在0.02到0.11之间，相对标准偏差(RSD^R)在0.08%到0.35%之间。这些结果说明建立的Cry2Ae基因标准曲线可重复性好，稳定性好。

表3、建立的Cry2Ae基因实时荧光PCR检测方法的重复性和重演性分析

实施例3、灵敏度测试

为了对建立的Cry2Ae基因实时荧光PCR检测体系灵敏度进行测试，将转基因棉花GHB119DNA溶液稀释至100、50、20、10拷贝/μL，每个浓度设置5个平行，重复4次，共20次反应。检测下限(LOD)的确定需满足≥95%置信区间要求。

测试结果如表4所示。结果表明，在以模板量为5拷贝的20次扩增中只有18次出现了明显的扩增信号增幅，不满足检测下限应大于或等于95%的置信区间的要求，而在以模板量为10拷贝的20次扩增中均出现了显著的扩增曲线图，平均Ct值为34.70，标准偏差(SD)值为0.94，相对标准偏差(RSD)是2.71%，这些结果说明建立的Cry2Ae基因实时荧光PCR检测方法的检测下限(LOD)为10拷贝基因组DNA，其高的灵敏度可以满足日常检测需求。

表4、建立的Cry2Ae基因实时荧光PCR检测方法灵敏度实验结果

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种鉴定转基因产品中Cry2Ae基因的方法，其特征在于，所述方法包括：

以待测样品的DNA为模板，以引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含Cry2Ae基因成分；包括：

以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物以及SEQ ID NO:3所示的荧光探针进行实时荧光PCR检测；或

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的探针还设置有LNA修饰位点。

3.用于鉴定转基因产品中Cry2Ae基因的引物，其特征在于，所述的引物选自：

(a)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对；

(b)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示的引物对；

(c)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物对；或

(d)SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的引物对。

4.用于鉴定转基因棉花的荧光探针，其特征在于，所述的探针序列如SEQID NO:3和/或SEQ ID NO:7所示。

5.如权利要求4所述的荧光探针，其特征在于，所述的探针还设置有LNA修饰位点。

6.权利要求3所述的引物或权利要求4所述的荧光探针或权利要求5所述的荧光探针的用途，用于鉴定转基因产品中Cry2Ae基因。

7.一种鉴定转基因产品中Cry2Ae基因的试剂盒，其特征在于，其中包括：

SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的引物，SEQ ID NO:7所示的荧光探针。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：含有Cry2Ae基因的检测阳性对照品。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：DNA提取试剂，PCR缓冲液，DNA聚合酶，和/或说明鉴定转基因产品中Cry2Ae基因的方法的使用说明书。