CN105734124B - 基于ssr标记和毛细管电泳的棉花种质遗传鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于棉花的基于SSR标记和毛细管电泳高通量的遗传鉴定方法，一种基于SSR标记和毛细管电泳的棉花种质遗传鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：(1)取若干片幼嫩棉花叶片作为研究材料，进行棉花基因组DNA的提取；(2)引物的筛选与合成；(3)PCR扩增反应；(4)毛细管凝胶电泳检测；(5)遗传多样性的数据统计与分析。本发明省时省力，并且能够实现电泳胶片分析自动化、数据处理计算机化，从而实现高通量、大规模、多批次、高效率的对棉花种质资源材料进行遗传鉴定分析，其结果准确可靠、经济实用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于棉花的基于SSR标记和毛细管电泳高通量的遗传鉴定方法，该方法适用于种质资源的亲缘关系鉴定，品种纯度及真实性鉴定以及分子标记辅助选择育种的应用。
背景技术
棉花属锦葵科（Malvaceae）棉属（Gossypium），共有51个种，由4个栽培种和47个野生种组成。中国是棉花种植面积最大的国家之一，在中国、美国、印度、巴基斯坦和乌兹别克斯坦等五个产棉大国中，中国棉田面积处在前二、三位。目前，我国共有陆地棉种质6100份，海岛棉387份，亚洲棉373份，非洲棉8份，陆地棉半野生种系241份，野生种31份等，共计约7400份。这些种质具有非常丰富的遗传多样性，而种质的遗传多样性是培育优良作物品种的必要条件，是棉花育种和生产发展的物质基础，也是棉属遗传、起源、进化和分类研究的基本材料。因此，研究棉花的遗传多样性，对弄清棉花各种质材料间的亲缘关系遗传组成，对棉花种质资源的评价、利用及创新具有重要的意义，同时对拓展棉花种质基础，发掘利用新的杂种优势群体和杂种优势模式，提高棉花育种水平具有重要作用。
随着分子生物学理论与技术的迅猛发展，DNA分子标记技术已飞速发展并逐渐发展完善，被广泛应用于动植物的遗传研究中。DNA分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。其中SSR （Simplesequence repeat）标记由于具有数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高、以孟德尔方式遗传、呈共显性且扩增结果稳定、成本低、方法简单等特点，被广泛应用于作物遗传图谱的构建、目的基因的定位、指纹图谱的构建等研究中。随着棉花A亚组、D亚组基因组序列测序工作的完成，可定位于棉花遗传图谱的SSR标记密度不断提高，可应用于棉花种质资源遗传分析的高多态性SSR标记不断增多，必将为棉花核心种质的构建，合理选配杂交亲本，培育高产、优质、多抗新品种提供基础，并为棉花分子设计育种提供重要理论依据。
当前基于SSR分子标记的棉花遗传分析技术已逐渐成熟，基因组DNA的提取、PCR扩增分析和扩增产物的分离与鉴定是其中三个重要环节，而PCR扩增产物的分离与鉴定技术目前最常用的方法是非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法，该方法需要经过电泳、固定、银染、显色、冲洗等步骤，其技术难度较大，实验程序复杂，且在银染过程中要接触到硝酸银等有毒药品，对实验人员安全有一定危害。该方法理论上虽然可以达到1～2bp的分离率，但实际操作中难以实现，且不能准确读出片段大小，只能人为粗略估计，对长度小于50bp的扩增片段也无法分析，难以对大规模种质资源材料的DNA数据进行有效分析。因此，要开展大规模、高通量的棉花种质资源遗传分析，需要建立准确、便捷、高效且能直接检测出扩增片段大小的高通量检测方法。
毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）又称高效毛细管电泳（highperformance capillary electrophoresis，HPCE）是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。它可以满足生命科学各领域大分子、小分子分离分析的要求。与传统聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法相比，具有其操作简单、重复性好和易清洗、样品用量少、分析速度快等优点。现有技术中，用于棉花优异基因挖掘、突变检测及棉花分子设计育种中，还没有实现基于SSR分子标记与毛细管电泳的遗传鉴定方法，来达到省时省力，并且能够实现电泳胶片分析自动化、数据处理计算机化，从而实现高通量、大规模、多批次、高效率的对棉花种质资源材料进行遗传鉴定分析。
发明内容
本发明的目的在于解决当前大数据下棉花遗传鉴定及分析方法困难的问题，提供一种能实现高通量、大规模、多批次、高效率的对棉花种质资源材料进行遗传鉴定分析，其结果准确可靠、经济实用的基于SSR标记和毛细管电泳的棉花种质遗传鉴定方法，
本发明公开了一种基于SSR标记和毛细管电泳的棉花种质遗传鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：
(1) 取若干片幼嫩棉花叶片作为研究材料，进行棉花基因组DNA的提取；
(2)引物的筛选与合成:
在已公布的棉花遗传图谱中选取多态性较好的SSR引物，对研究材料全基因组进行遗传多样分析，且引物合成无需加荧光染料，普通合成即可；
(3)PCR扩增反应：
(4)毛细管凝胶电泳检测:
①调整Fragment Analyzer-XL960 SSR/Tilling系统：安装毛细管，其它参数按照系统默认值；
②试剂区与样品区准备：选用ZAG105试剂系列，将Gel、ddwater、conditioningsolution溶液分别注入对应的试剂瓶中，其中gel：dye体积比=20:1；将inlet buffer、storage solution、markers溶液分别注入深孔板和具有96孔的pcr板，放置于机身对应的“B”“S”“M”位置，“W”放入空盒，“1～9”分别放入扩增产物pcr板；
③参数设定：输入试剂区内不同试剂瓶内溶液的体积，程序将自动运行并提示试剂用量是否足够；设置peak height（RUF）参数，markers最小峰值RFU为100，样品最小峰值RFU为50；
④样品分析：运行电泳程序，并输入待测样品及SSR标记信息；无限制机器人手臂将执行毛细管管路冲洗，充胶，buffer、markers、扩增样品、DNA Ladder溶液吸入；电泳开始运行时，同时每个样品的实时动态RFU峰值图；
⑤数据分析：ZAG DNA Analyzer执行电泳后将所有数据自动保存到ProSize2.0软件中，数据以行、列或单独的样品的组合显示在数字胶视图中；根据胶视图中DNA Ladder以及单个样品不同位点片段大小，参照RFU峰值图上的bp值，输入多态性位点的大小，系统执行自动读取0、1数据，分辨率可以达到2bp；0、1数据自动保存并以Excel或PDF的报告形式输出；
(5)遗传多样性的数据统计与分析:
①打开ProSize2.0软件，在File中选定待分析的文件夹，此时同时出现数字胶、峰值图和峰值浓度列表；在参数设置中选择Flag模块，按要求在Tag、Value、Range中输入引物名称、差异位点的片段大小值以及允许波动范围：1～2bp，系统自动读取多态性差异位点以及等位基因差异，在峰值浓度列表右侧显示读取结果（1,0）列表，同时自动保存并可随时导出；
②所获得的0、1数据用NTSYSpc 2.10软件进行聚类分析，选用相似性SM系数，以SHAN Clustering进行UPGMA（unweighted pair group method arithmetic averages）遗传聚类分析。
所述的基于SSR标记和毛细管电泳的棉花种质遗传鉴定方法中，所述的运行电泳程序，marker和样品的进样电压及时间参数分别为5kv、5sec，分离电压、时间参数设置为6kv、55min。
所述的96孔的pcr板在扩增前只能在1～95孔中加入扩增反应体系，最后1孔不加任何试剂。
所述样品具体为：1～95孔中为10μl PCR扩增产物与1×14μl TE缓冲液的混合液；最后1孔为24μl DNA Ladder。
所述的步骤(1)中，针对选取的若干片幼嫩棉花叶片分别进行棉花基因组DNA的提取的具体做法为：
取幼嫩棉花叶片放入1.5 ml的离心管中，加入0.6 ml提取缓冲液，电钻磨碎；10000 rpm（Eppendorf）离心15 min,温度为4℃，弃上清；于沉淀中加入0.6 ml 65℃预热的裂解缓冲液，并用牙签搅拌混匀，65℃水浴30 min；加入0.6 ml的氯仿∶异戊醇,体积比为24：1，翻转50次以上，10000 rpm离心15 min,温度为15℃；将上清转入另一新的1.5 ml的离心管中，加0.6体积预冷的异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，静置10 min后10000 rpm，离心10min,温度为室温,弃上清；于沉淀中加入0.5 ml 70 %的乙醇洗涤，10000 rpm离心5 min。倒掉上清液，弃上清；加100μl 灭菌TE缓冲液,pH值为 8.0,溶解DNA,时间至少30 min,温度为室温，即得DNA 溶液。
所述的步骤(3)中，针对PCR扩增反应具体所使用的10 μl反应体系包含：10×buffer 1.0μl，25 mM MgCl2 1.0μl，2 mM dNTPs 1.0μl，10μM正向引物与反向引物各1.0μl，0.5单位的Taq DNA聚合酶0.2μl，模板DNA 20 ng，加ddH2O至10μl；反应程序为：95℃预变性2 min；94℃变性40 s、57℃退火45 s、72℃延伸60 s，共30个循环；72℃延伸7 min。
本发明所述SSR引物为不含荧光标记的常规SSR引物，适用范围广。
设置peak height（RUF）参数，markers最小峰值RFU为100，样品最小峰值RFU为50，数字胶对比度适中，差异位点带型清晰，杂带弱带干扰较小。
与现有技术相比，本发明的优点：
（1）本发明为一种用于棉花种质资源的遗传鉴定方法，该方法应用SSR分子标记与毛细管电泳技术相结合，对PCR扩增产物进行检测，利用SSR标记的高多态性和操作简便性及毛细管凝胶电泳技术的高通量和高分辨率特性，从基因水平上鉴定出不同来源的棉花种质的遗传关系，使得分析结果更加准确可靠。从而用于棉花种质资源的遗传多样性分析、品种指纹图谱的构建与品种保护等。具体方法包括提取不同棉花种质材料的基因组DNA，经PCR扩增后，用毛细管电泳检测扩增结果，根据DNA条带大小的不同建立不同棉花种质的带型图谱，通过UPGMA法进行聚类分析，建立树状聚类图进行遗传关系分析。该方法不受棉花生长环境和季节的影响，分辨率高、结果准确可靠、操作简单，且自动化程度高、特别适用于大规模数据的整合与分析，这是传统的检测方法所不能比拟的。
（2）利用发明所提供的方法结合计算机软件可完成对数据的自动化处理，有利于大规模、多批次的数据分析。且该分析技术的PCR产物可直接上样，无需进行预处理，可以检测出长度小于50bp的DNA片段，分辨率更高（分辨率高达2bp）；精确度更高（片段长度分析误差≤5%），从而精确给出扩增片段的大小，减少了人为误差，使检测结果更加准确。
（3）本发明建立了SSR分子标记与毛细管电泳技术相结合的棉花种质资源遗传鉴定方法，该方法结合了SSR标记和毛细管电泳检测两种技术的优点，相对于传统的凝胶分析更加简便高效，且本发明所用的SSR标记无需荧光标记，进一步减少了实验成本。SSR标记和毛细管电泳技术利用与计算机软件完成对数据的自动化处理，无需传统的凝胶配制、银染、显色、冲洗等步骤，不仅避免了实验人员与有害实验药品的接触，而且极大地减少了工作量，操作简便，实现了高通量、自动化技术的结合。同时毛细管凝胶电泳能够准确识别扩增产物片段的大小，减少了人为误差，使得实验结果更加准确，有效解决了当前大数据下对种质资源的遗传分析。
该方法与现有技术的传统方法相比，省时省力，并且能够实现电泳胶片分析自动化、数据处理计算机化，从而实现高通量、大规模、多批次、高效率的对棉花种质资源材料进行遗传鉴定分析，其结果准确可靠、经济实用；并且能够为优异基因挖掘、突变检测及棉花分子设计育种提供理论参考。
附图说明
图1为供试材料的毛细管电泳检测结果，图中可以直观的看到95份品种资源的扩增图谱，各材料间表现差异明显。
图2为不同扩增片段（等位变异）之间的差异波形图，图中可直观的分辨出2bp的差异片段。
图3为95份棉花种质资源材料的遗传聚类图，通过聚类结果，可以看到95份材料样品，表现出了明显的差异性。
具体实施方式
参照附图1、图2、图3，选取95种棉花品种资源作为实验材料。一种基于SSR标记和毛细管电泳的棉花种质遗传鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：
1. 棉花基因组DNA提取,针对上述95份棉花品种资料的实验材料,分别进行DNA的提取:
（1）取1片幼嫩棉花叶片放入1.5 ml的离心管中，加入0.6 ml提取缓冲液为500 mL配方如下：0.35M Glucose:34.68g、0.1M Tris.HCl:50 mL、5mM Na.EDTA:5 mL、2% PVP:100mL、1%β-Me:5 mL、dd Water:340 mL，电钻磨碎；
（2）10,000 rpm（Eppendorf）离心15 min（4℃），弃上清；于沉淀中加入0.6 ml 65℃预热的裂解缓冲液（500 mL配方如下：1.4M NaCl:40.908g、0.1M Tris.HCl:50mL、20mMNa.EDTA:20mL、2%CTAB:100mL、2% PVP:100mL、1%β-Me:5mL、dd Water:225mL），并用牙签搅拌混匀，65℃水浴30 min；
（3）加入0.6 ml的氯仿∶异戊醇,体积比为24：1，翻转50次以上，10,000 rpm离心15min（15℃）；
（4）将上清转入另一新的1.5 ml的离心管中，加0.6体积预冷的异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，静置10 min后10,000 rpm，离心10 min（室温）弃上清；
（5）于沉淀中加入0.5 ml 70 %的乙醇洗涤，10,000 rpm离心5 min；倒掉上清液，弃上清；
（6）加100 ul 灭菌TE缓冲液（pH 8.0）溶解DNA（室温，30 min以上），即得DNA 溶液。长期保存则置于-20℃保存备用。
2、引物的筛选与合成:
在已公布的棉花遗传图谱中选取多态性较好的SSR引物，对研究材料全基因组进行遗传多样分析，且引物合成无需加荧光染料，普通合成即可；
筛选出多态性较好的分布与棉花26条染色体的20对（40个）SSR引物对研究材料全基因组进行遗传多样分析。所述20对（40个）SSR引物序列如下表所示：
3、PCR扩增反应：
10 μl反应体系包含：10×buffer 1.0 μl，25 mM MgCl2 1.0 μl，2 mM dNTPs 1.0μl，10 μl正向引物与反向引物各1.0 μl，0.5单位的Taq DNA聚合酶0.2 μl，模板DNA 20ng，加ddH2O至10μl。
反应程序为：95℃预变性2 min；94℃变性40 s、57℃（或55℃）退火45 s、72℃延伸60 s，共30个循环；72℃延伸7 min。
4、毛细管凝胶电泳检测：
①调整Fragment Analyzer-XL960 SSR/Tilling系统：安装毛细管，并将自带插头与系统连接取电，其它参数按照系统默认值。
②试剂区与样品区准备：选用ZAG105试剂系列，将Gel（gel：dye=20:1）、ddwater、conditioning solution溶液分别注入对应的试剂瓶中；将inlet buffer、storagesolution、markers溶液分别注入深孔板和具有96孔的pcr板，放置于机身对应的“B”“S”“M”位置，“W”放入空盒，“1～9”分别放入扩增产物pcr板。
③参数设定：输入试剂区内不同试剂瓶内溶液的体积，程序将自动运行并提示试剂用量是否足够，当样品DNA浓度与markers浓度相差较大，可调节peak height（RUF），设置peak height（RUF）参数，markers最小峰值RFU为100，样品最小峰值RFU为50；
④样品分析：选择电泳程序，并输入待测样品及SSR标记信息。无限制机器人手臂将执行毛细管管路冲洗，充胶，buffer、markers、扩增样品、DNA Ladder等溶液吸入。电泳开始运行时，配以每个样品的实时动态RFU峰值图；
⑤数据分析：ZAG DNA Analyzer执行电泳后将所有数据自动保存到ProSize2.0软件中，数据以行、列或单独的样品的组合显示在数字胶视图中；根据胶视图中DNA Ladder以及单个样品不同位点片段大小，参照RFU峰值图上的bp值，输入多态性位点的大小，系统执行自动读取0、1数据，分辨率可以达到2bp；0、1数据自动保存并以Excel或PDF的报告形式输出；
5、遗传多样性的数据统计与分析：
①打开ProSize2.0软件，在File中选定待分析的文件夹，此时同时出现数字胶、峰值图和峰值浓度列表；在参数设置中选择Flag模块，按要求在Tag、Value、Range中输入引物名称、差异位点的片段大小值以及允许波动范围：1～2bp，系统自动读取多态性差异位点以及等位基因差异，在峰值浓度列表右侧显示读取结果（1,0）列表，同时自动保存并可随时导出。
每对SSR引物检测到1个位点，视每条多态性带为1个等位基因；将观测到的每条带视为一个性状，有带时赋值为“1”，无带时赋值为“0”，建立0/1数据库。
②所获得的0、1数据用NTSYSpc 2.10软件进行聚类分析，选用相似性SM系数，以SHAN Clustering进行UPGMA（unweighted pair group method arithmetic averages）遗传聚类分析。
6、 结果分析
图1为部分材料毛细管电泳检测结果，由图中可以看出，应用毛细管电泳技术能区分出相差1 bp的多态性片段，使检测的等位变异更为丰富，且根据不同的研究提供图像波形（图1）和波形（图2）两种分析模式，结果准确直观，并能准确读出片段大小，这是常规的电泳检测方法所无法比拟的，由此说明，具有较高分辨能力的毛细管电泳技术尤为适用于棉花品种遗传亲缘关系的分析。图3为20对SSR引物对95份棉花材料的UPGMA聚类分析结果，由图中可以看出各95份材料被聚为两大类，三小类。其中蓝色图线的一类大部分为适合新疆种植的新陆早系列品种，具有较高的亲缘关系。可以看出系谱来源相近的品种由于具有较近的亲缘关系而被聚在一起，说明SSR标记与毛细管电泳技术相结合可用于棉花品种的遗传鉴定。
基因序列表
<110> 新疆农垦科学院
<120>基于SSR标记和毛细管电泳的棉花种质遗传鉴定方法
<160> 40
<210> 1
<211> 20
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ATCTTTCAAA CAACGGCAGC 20
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<212> DNA
<213>人工序列
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<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 17
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<210> 18
<211> 23
<212> DNA
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<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
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<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
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CCACCACTGT CACTCTCAAA 20
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<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
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<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
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TGTCCTGGGA CTTCAAGATT 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 22
TTCATTTCCA AGGAAAGCTG 20
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 23
CACCCCTAAA GTAACAAACA AA 22
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 24
ATCTTCCTCA GCACTCCAAG 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 25
CCGCCTAAGA CTAATTGGAA 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 26
CAAATTGTAA GTGGCTGAGA 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 27
CATGCAAATC CATGCTAGAG 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 28
GGTTTCTTTG GTGGTGAAAC 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 29
ACCAACAATG GTGACCTCTT 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 30
CCCTCCATAA CCAAAAGTTG 20
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 31
CAACAGCAAC AACCACAA 18
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 32
CTGCCTCGAG GACAAATAGT 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 33
CATGAAGCTT TTCCCACTTT 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 34
CAGCTTATCC ACCCCTAATG 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 35
TCTTCGGTCT TCTCCTCCTA 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 36
TCGACTTCAT AGGCTTGACA 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 37
TGTCCCCATG ATTCTTCTTT 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 38
TATTTTCAGC ACCAAGAGCA 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 39
CAGGCTTCAT CTTTTTGGAC 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 40
CATTGGATCC TAGTGGGAAG 20
<110> 新疆农垦科学院
<120>基于SSR标记和毛细管电泳的棉花种质遗传鉴定方法
<160> 40
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 1
ATCTTTCAAA CAACGGCAGC 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 2
CGATTCCGGA CTCTTGATGT 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 3
CACCATTGTG GCAACTGAGT 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 4
GGAAAAGGGA AAGCCATTGT 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 5
GCAGAACTGC CACTTGTTTG 20
<210>6
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 6
AGAAAATGGG TTGTGCTTGG 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 7
CATGTAGGAA CGAGCATAGT G 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 8
AACACATACC AGTCCCAGTC G 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 9
CGAGGGATAG AGAGGACGAA 20
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 10
GTTTGATTAT TATGCTTGTA AAGTTACC 28
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 11
TCGGTAAAGA TGGGTG 16
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 12
ATTGGTGCTG GTTGAG 16
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 13
CCAGATTAGA ACCTATGAAA C 21
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 14
TAGCCCATTT CTTACCAC 18
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 15
TTAGGGTTTA GTTGAATGG 19
<210> 16
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 16
ATGAACACAC GCACG 15
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 17
GAAACTGGGA GTGAAAGAAC AAGT 24
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 18
TGGATGTTAG CTTTGGTTTA CCC 23
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 19
CCACCACTGT CACTCTCAAA 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 20
CCTGAACGAT GGCTAGAACT 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 21
TGTCCTGGGA CTTCAAGATT 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 22
TTCATTTCCA AGGAAAGCTG 20
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 23
CACCCCTAAA GTAACAAACA AA 22
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 24
ATCTTCCTCA GCACTCCAAG 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 25
CCGCCTAAGA CTAATTGGAA 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 26
CAAATTGTAA GTGGCTGAGA 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 27
CATGCAAATC CATGCTAGAG 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 28
GGTTTCTTTG GTGGTGAAAC 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 29
ACCAACAATG GTGACCTCTT 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 30
CCCTCCATAA CCAAAAGTTG 20
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 31
CAACAGCAAC AACCACAA 18
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 32
CTGCCTCGAG GACAAATAGT 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 33
CATGAAGCTT TTCCCACTTT 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 34
CAGCTTATCC ACCCCTAATG 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 35
TCTTCGGTCT TCTCCTCCTA 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 36
TCGACTTCAT AGGCTTGACA 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 37
TGTCCCCATG ATTCTTCTTT 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 38
TATTTTCAGC ACCAAGAGCA 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 39
CAGGCTTCAT CTTTTTGGAC 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 40
CATTGGATCC TAGTGGGAAG 20
Claims (7)
1.一种基于SSR标记和毛细管电泳的棉花种质遗传鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：
(1) 取若干片幼嫩棉花叶片作为研究材料，进行棉花基因组DNA的提取；
(2)引物的筛选与合成；
在已公布的棉花遗传图谱中选取多态性较好的SSR引物，该SSR引物序列为序列表中SEQ ID NO：1- SEQ ID NO：40所示序列，对研究材料全基因组进行遗传多样分析，且引物合成无需加荧光染料，普通合成即可；
(3)PCR扩增反应；
(4)毛细管凝胶电泳检测:
①调整Fragment Analyzer-XL960 SSR/Tilling系统：安装毛细管，其它参数按照系统默认值；
②试剂区与样品区准备：选用ZAG105试剂系列，将Gel、ddwater、conditioningsolution溶液分别注入对应的试剂瓶中，其中gel：dye体积比=20:1；将inlet buffer、storage solution、markers溶液分别注入深孔板和具有96孔的pcr板，放置于机身对应的“B”“S”“M”位置，“W”放入空盒，“1～9”分别放入扩增产物pcr板；
③参数设定：输入试剂区内不同试剂瓶内溶液的体积，程序将自动运行并提示试剂用量是否足够；设置peak height参数，markers最小峰值RFU为100，样品最小峰值RFU为50；
④样品分析：运行电泳程序，并输入待测样品及SSR标记信息；无限制机器人手臂将执行毛细管管路冲洗，充胶，inlet buffer、markers、扩增样品、DNA Ladder溶液吸入；电泳开始运行时，同时每个样品的实时动态RFU峰值图；所述的运行电泳程序，marker和样品的进样电压及时间参数分别为5kv、5sec，分离电压、时间参数设置为6kv、55min；
⑤数据分析：ZAG DNA Analyzer执行电泳后将所有数据自动保存到ProSize2.0软件中，数据以行、列或单独的样品的组合显示在数字胶视图中；根据胶视图中DNA Ladder以及单个样品不同位点片段大小，参照RFU峰值图上的bp值，输入多态性位点的大小，系统执行自动读取0、1数据，分辨率达到2bp；0、1数据自动保存并以Excel或PDF的报告形式输出；
(5)遗传多样性的数据统计与分析:
①打开ProSize2.0软件，在File中选定待分析的文件夹，此时同时出现数字胶、峰值图和峰值浓度列表；在参数设置中选择Flag模块，按要求在Tag、Value、Range中输入引物名称、差异位点的片段大小值以及允许波动范围：1～2bp，系统自动读取多态性差异位点以及等位基因差异，在峰值浓度列表右侧显示读取结果0、1数据列表，同时自动保存并可随时导出；
②所获得的0、1数据用NTSYSpc 2.10软件进行聚类分析，选用相似性SM系数，以SHANClustering进行UPGMA遗传聚类分析。
2.如权利要求1所述的基于SSR标记和毛细管电泳的棉花种质遗传鉴定方法，其特征在于所述的96孔的pcr板在扩增前只能在1～95孔中加入扩增反应体系，最后1孔不加任何试剂。
3.如权利要求1所述的基于SSR标记和毛细管电泳的棉花种质遗传鉴定方法，其特征在于所述样品为：1～95孔中为10μl PCR扩增产物与1×14μl TE缓冲液的混合液；最后1孔为24μl DNA Ladder。
4.如权利要求1或2所述的基于SSR标记和毛细管电泳的棉花种质遗传鉴定方法，其特征在于所述的步骤(1)中，针对选取的若干片幼嫩棉花叶片分别进行棉花基因组DNA的提取的具体做法为：
取幼嫩棉花叶片放入1.5 ml的离心管中，加入0.6 ml提取缓冲液，所述提取缓冲液,500 mL配方如下：0.35M Glucose:34.68g、0.1M Tris.HCl:50 mL、5mM Na.EDTA:5 mL、2%PVP:100 mL、1%β-Me:5 mL、dd Water:340 mL，电钻磨碎；10000 rpm离心15 min,温度为4℃，弃上清；于沉淀中加入0.6 ml 65℃预热的裂解缓冲液，所述裂解缓冲液, 500 mL配方如下：1.4M NaCl:40.908g、0.1M Tris.HCl:50mL、20mM Na.EDTA:20mL、2%CTAB:100mL、2%PVP:100mL、1%β-Me:5mL、dd Water:225mL,并用牙签搅拌混匀，65℃水浴30 min；加入0.6ml的氯仿∶异戊醇,体积比为24：1，翻转50次以上，10000 rpm离心15 min,温度为15℃；将上清转入另一新的1.5 ml的离心管中，加0.6体积预冷的异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，静置10min后10000 rpm，离心10 min,温度为室温,弃上清；于沉淀中加入0.5 ml 70 %的乙醇洗涤，10000 rpm离心5 min；倒掉上清液，弃上清；加100μl 灭菌TE缓冲液,pH值为 8.0,溶解DNA,时间至少30 min,温度为室温，即得DNA 溶液。
5.如权利要求3所述的基于SSR标记和毛细管电泳的棉花种质遗传鉴定方法，其特征在于所述的步骤(1)中，针对选取的若干片幼嫩棉花叶片分别进行棉花基因组DNA的提取的具体做法为：
取幼嫩棉花叶片放入1.5 ml的离心管中，加入0.6 ml提取缓冲液，所述提取缓冲液,500 mL配方如下：0.35M Glucose:34.68g、0.1M Tris.HCl:50 mL、5mM Na.EDTA:5 mL、2%PVP:100 mL、1%β-Me:5 mL、dd Water:340 mL，电钻磨碎；10000 rpm离心15 min,温度为4℃，弃上清；于沉淀中加入0.6 ml 65℃预热的裂解缓冲液，所述裂解缓冲液, 500 mL配方如下：1.4M NaCl:40.908g、0.1M Tris.HCl:50mL、20mM Na.EDTA:20mL、2%CTAB:100mL、2%PVP:100mL、1%β-Me:5mL、dd Water:225mL,并用牙签搅拌混匀，65℃水浴30 min；加入0.6ml的氯仿∶异戊醇,体积比为24：1，翻转50次以上，10000 rpm离心15 min,温度为15℃；将上清转入另一新的1.5 ml的离心管中，加0.6体积预冷的异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，静置10min后10000 rpm，离心10 min,温度为室温,弃上清；于沉淀中加入0.5 ml 70 %的乙醇洗涤，10000 rpm离心5 min；倒掉上清液，弃上清；加100μl 灭菌TE缓冲液,pH值为 8.0,溶解DNA,时间至少30 min,温度为室温，即得DNA 溶液。
6.如权利要求1或2所述的基于SSR标记和毛细管电泳的棉花种质遗传鉴定方法，其特征在于所述的步骤(3)中，针对PCR扩增反应具体所使用的10 μl反应体系包含：10×buffer1.0μl，25 mM MgCl2 1.0μl，2 mM dNTPs 1.0μl，10μM正向引物与反向引物各1.0μl，0.5单位的Taq DNA聚合酶0.2μl，模板DNA 20 ng，加ddH2O至10μl；反应程序为：95℃预变性2min；94℃变性40 s、57℃退火45 s、72℃延伸60 s，共30个循环；72℃延伸7 min。
7.如权利要求5所述的基于SSR标记和毛细管电泳的棉花种质遗传鉴定方法，其特征在于所述的步骤(3)中，针对PCR扩增反应具体所使用的10 μl反应体系包含：10×buffer 1.0μl，25 mM MgCl2 1.0μl，2 mM dNTPs 1.0μl，10μM正向引物与反向引物各1.0μl，0.5单位的Taq DNA聚合酶0.2μl，模板DNA 20 ng，加ddH2O至10μl；反应程序为：95℃预变性2 min；94℃变性40 s、57℃退火45 s、72℃延伸60 s，共30个循环；72℃延伸7 min。
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