CN110846432A - 共显性荧光分子标记及抗褐飞虱基因Bph3检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因检测技术领域，公开了一种共显性荧光分子标记及抗褐飞虱基因Bph3检测方法，共显性荧光分子标记由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。3条引物同时加入到PCR反应体系进行扩增，有褐飞虱抗性水稻亲本品种等位基因Bph3序列可以根据SNP差异与正向引物Allele‑A匹配而扩增获得FAM荧光信号值；而无褐飞虱抗性水稻品种等位基因Bph3序列与正向引物Allele‑G匹配而扩增获得HEX荧光信号值。本发明不需要电泳检测，而直接用荧光扫描仪获取基因扩增数据，经过软件分析，获得水稻Bph3的基因型数据。因此，解决目前使用的方法因存在耗时间，使用有毒物质的缺点。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及一种共显性荧光分子标记及抗褐飞虱基因Bph3检测方法。
背景技术
目前，最接近的现有技术：水稻作为重要的粮食作物之一，哺育了全球近50％的人口。随着水稻基因组测序和精细遗传图谱的完成，对水稻的功能基因研究已成为水稻科研人员的重要研究内容。功能基因分子标记的开发和利用在水稻分子育种上发挥了重要的作用，对农业经济的发展有重要的推动作用。我国作为一个人口大国，水稻的安全生产与我国粮食安全问题密切相关。褐飞虱是影响我国水稻生产的重要害虫之一，严重威胁到我国的粮食安全。农民长期使用化学农药防治褐飞虱，导致环境污染及褐飞虱的抗药性增加。大量的研究与实践表明，通过导入抗褐飞虱基因提高水稻对褐飞虱的抗性是防治褐飞虱最经济、有效和环保的途径。
现有技术是利用4条引物的分子标记检测抗褐飞虱基因Bph3，根据Bph3等位基因的2个SNP位点设计引物，PCR产物经过琼脂糖电泳和核酸染料染色后区分等位基因型。因需要琼脂糖电泳分析而耗时间；因使用有毒的核酸染料而对人类健康有危害。
综上所述，现有技术存在的问题是：现有技术利用4条引物的分子标记检测抗褐飞虱基因Bph3需要琼脂糖电泳分析，耗时较长，使用有毒的核酸染料。
解决上述技术问题的难度：绝大部分科研人员都依赖常规的电泳分析方法检测PCR扩增产物，且必须用到有毒的核酸染料，使用荧光分析的方法尚少。
解决上述技术问题的意义：Bph3位于水稻第4号染色体短臂上，由3个基因构成的一个抗性基因簇，其供体亲本来源于对褐飞虱有广谱、持久抗性的水稻品种RH和BP60，而感虫品种的等位基因与抗虫品种的等位基因Bph3存在一个碱基差异(见图2)，因此开发Bph3等位基因的特异性荧光分子标记，并利用分子标记辅助选择技术将Bph3抗性基因导入到其它栽培稻品种中，对抗褐飞虱水稻品种的育种提供了重要的基因资源。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种共显性荧光分子标记及抗褐飞虱基因Bph3检测方法。
本发明是这样实现的，一种共显性荧光分子标记，所述共显性荧光分子标记由SEQID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述共显性荧光分子标记的抗褐飞虱基因Bph3检测方法，所述共显性荧光分子标记的抗褐飞虱基因Bph3检测方法包括以下步骤：
第一步，提取水稻植株的基因组DNA；
第二步，将引物Allele-A、Allele-G和Common Reverse同时加入到PCR反应体系中，并对所述的水稻植株中的Bph3基因进行扩增；
第三步，将PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行检测，读取荧光强度信号值，将荧光信号值文件通过SNP decoder工具，结合标记信息，自动进行基因分型，获得基因型结果；
第四步，根据荧光信号值进行分析，如果扫描仅获得FAM荧光信号，则为含等位A碱基Bph3等位基因；如果扫描仅获得HEX荧光信号，则为含等位G碱基Bph3等位基因，如果扫描同时获得FAM和HEX两种荧光信号，则为含杂合等位A/G碱基Bph3等位基因。
进一步，所述PCR反应程序为：95℃，5min；10个循环95℃，20sec，65℃，1min；32个循环95℃，20sec，57℃，1min；10个循环95℃，20sec，65℃，-0.8℃每循环。
进一步，所述PCR反应体系为10μL：5μL 2×PARMS mastermix，0.15μL10mMAllele-A标记引物，0.15μL 10mM Allele-G标记引物，0.4μL 10mM Common Reverse通用反向引物，1μL模板DNA，3.3μL ddH2O。
本发明的另一目的在于提供一种所述共显性荧光分子标记在水稻抗褐飞虱基因Bph3检测中的应用，仅含有碱基A的Bph3等位基因的水稻DNA模板经扩增后，荧光扫描获得FAM荧光信号；仅含有碱基G的Bph3等位基因水稻DNA模板经扩增后，荧光扫描获得HEX荧光信号；含有杂合碱基A/G的Bph3等位基因水稻DNA模板经扩增后，荧光扫描获得FAM和HEX两种荧光信号。
进一步，3条引物Allele-A、Allele-G和Common Reverse同时加入到PCR反应体系进行扩增，有褐飞虱抗性水稻亲本品种等位基因Bph3序列可以根据SNP差异与正向引物Allele-A匹配而扩增获得FAM荧光信号值；而无褐飞虱抗性水稻品种等位基因Bph3序列与正向引物Allele-G匹配而扩增获得HEX荧光信号值。
本发明的另一目的在于提供一种所述共显性荧光分子标记在功能基因分子标记开发中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述共显性荧光分子标记在水稻分子育种中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述共显性荧光分子标记在防治褐飞虱中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述共显性荧光分子标记在水稻对褐飞虱抗性中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明根据抗性品种BP60与感虫品种的Bph3等位基因一个碱基差异，开发了能跟踪抗褐飞虱基因的共显性荧光分子标记MM3T(由三条引物构成Allele-A：Allele-G：Common Reverse：)，通过PCR扩增，不需要DNA电泳检测，直接用荧光扫描仪获取扩增的荧光数据，经过软件分析而获得水稻Bph3的基因型数据，用于分子标记辅助选择Bph3等位基因，可以有效对水稻中抗褐飞虱基因Bph3进行基因分型，并筛选包含抗性基因Bph3的植株应用到培育具有抗褐飞虱的水稻新品种上。
本发明不需要电泳检测，而直接用荧光扫描仪获取扩增数据，经过软件分析，获得水稻Bph3的基因型数据。因此，解决目前使用的方法因存在耗时间，使用有毒物质的缺点。
附图说明
图1是本发明实施例提供的共显性荧光分子标记的抗褐飞虱基因Bph3检测方法流程图。
图2是本发明实施例提供的抗褐飞虱基因Bph3等位分析结果示意图。
图3是本发明实施例提供的抗褐飞虱基因Bph3的扩增示意图；
图中：#1，FAM荧光通用引物；#2，HEX荧光通用引物；Allele-A，特异扩增引物(标记引物)；Allele-G，特异扩增引物(标记引物)；Common Reverse，通用反向引物(标记引物)。
图4是本发明实施例提供的检测的31个水稻亲本品种Bph3荧光分子标记的基因分型结果图。
图5是本发明实施例提供的检测的水稻品种褐飞虱抗性表型验证结果图；
图中：检测到FAM荧光信号的(椭圆形中的点)为包含A碱基的Bph3等位基因抗褐飞虱的品种BP60，检测到HEX荧光信号的(圆形中的点)为包含G碱基Bph3等位基因感褐飞虱的品种。
图6是本发明实施例提供的检测的52个水稻BC2F2杂交后代荧光分子标记的基因分型结果图；
图中：仅检测到FAM荧光信号的(椭圆形中的点)为包含A碱基的Bph3等位基因BC2F2后代，仅检测到HEX荧光信号的(圆形中的点)为包含G碱基Bph3等位基因BC2F2后代，同时检测到FAM和HEX荧光信号的(正方形中的点)为包含杂合A/G碱基Bph3等位基因BC2F2后代。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种共显性荧光分子标记及抗褐飞虱基因Bph3检测方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的共显性荧光分子标记MM3T由三条引物构成：
SEQ ID NO：1，Allele-A引物：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATACTGACCAAGATCCATCGATAGTAASEQ ID NO：2，Allele-G引物：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATACTGACCAAGATCCATCGATAGTAGSEQ ID NO：3，CommonReverse引物：CACACCTGTAACCTGGGGATTC。
本发明用于PCR扩增引物设计如图3所示，仅含有碱基A的Bph3等位基因的水稻DNA模板经扩增后，荧光扫描获得FAM荧光信号；仅含有碱基G的Bph3等位基因水稻DNA模板经扩增后，荧光扫描获得HEX荧光信号；含有杂合碱基A/G的Bph3等位基因水稻DNA模板经扩增后，荧光扫描获得FAM和HEX两种荧光信号。
本发明采用此技术方案，3条引物同时加入到PCR反应体系进行扩增，有褐飞虱抗性水稻亲本品种等位基因Bph3序列可以根据SNP差异与正向引物Allele-A匹配而扩增获得FAM荧光信号值；而无褐飞虱抗性水稻品种等位基因Bph3序列与正向引物Allele-G匹配而扩增获得HEX荧光信号值。
如图1所示，本发明实施例提供的共显性荧光分子标记的抗褐飞虱基因Bph3检测方法包括以下步骤：
S101：提取水稻植株的基因组DNA；
S102：PCR扩增：将3条引物Allele-A、Allele-G和Common Reverse同时加入到PCR反应体系中，并对所述的水稻植株中的Bph3基因进行扩增；所述PCR反应程序为：95℃，5min；然后10个循环95℃，20sec，65℃(-0.8℃每循环)，1min；然后32个循环95℃，20sec，57℃，1min；
S103：将PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)工具，结合标记信息，自动进行基因分型，获得基因型结果；
S104：根据荧光信号值进行分析，如果扫描仅获得FAM荧光信号，则为含等位A碱基Bph3等位基因；如果扫描仅获得HEX荧光信号，则为含等位G碱基Bph3等位基因，如果扫描同时获得FAM和HEX两种荧光信号，则为含杂合等位A/G碱基Bph3等位基因。
在本发明的优选实施例中，PCR反应体系为10μL：5μL 2×PARMS master mix(包含2条通用荧光引物)，0.15μL 10mMAllele-A标记引物，0.15μL 10mM Allele-G标记引物，0.4μL 10mM Common Reverse通用反向引物，1μL模板DNA，3.3μL ddH2O。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
实施例1：
本发明利用荧光分子标记MM3T检测31个水稻亲本品种的Bph3等位基因包括：PCR反应体系为10ul：5μL 2×PARMS mastermix(包含2条通用荧光引物)，0.15μL 10mMAllele-A标记引物，0.15μL 10mMAllele-G标记引物，0.4μL 10mM Common Reverse通用反向引物，1μL模板DNA，3.3μL ddH2O。PCR反应程序：95℃，5min；然后10个循环95℃，20sec，65℃(-0.8℃每循环)，1min；然后32个循环95℃，20sec，57℃，1min。扩增产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)工具，结合标记信息，自动进行基因分型，获得基因型结果，如图4所示。蓝色数据点代表包含等位A碱基Bph3等位基因的抗褐飞虱品种BP60，绿色数据点代表包含等位G碱基Bph3等位基因的30个感褐飞虱品种(包含用于等位分析的9个品种)。用于等位分析的水稻亲本品种的褐飞虱鉴定表型如图5所示，包含等位A碱基的Bph3等位基因的品种BP60抗褐飞虱，其它包含等位G碱基Bph3等位基因的品种感褐飞虱。
实施例2：
本发明利用分子标记MM3T检测52个BC2F2杂交后代Bph3等位基因包括以下步骤：将抗褐飞虱品种BP60与感褐飞虱品种桂7571杂交获得F1代，再以桂7571为母本杂交获得BC1F1，用标记MM3T选择含褐飞虱抗性等位基因Bph3存在的单株为父本连续回交到BC2F1，然后自交获得BC2F2代，抽取52个单株进行荧光分子标记MM3T检测。PCR反应体系为10ul：5μL 2×PARMS master mix(包含2条通用荧光引物)，0.15μL 10mMAllele-A标记引物，0.15μL10mM Allele-G标记引物，0.4μL 10mM Common Reverse通用反向引物，1μL模板DNA，3.3μLddH2O。PCR反应程序：95℃，5min；然后10个循环95℃，20sec，65℃(-0.8℃每循环)，1min；然后32个循环95℃，20sec，57℃，1min。扩增产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)工具，结合标记信息，自动进行基因分型，获得基因型结果，如图6所示。蓝色数据点代表包含等位A碱基Bph3等位基因，绿色数据点代表包含等位G碱基Bph3等位基因，红色数据点代表包含杂合等位A/G碱基Bph3等位基因，且符合遗传学的F2代的1:2:1分离规律。
下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。
1、实验步骤：水稻抗褐飞虱基因Bph3的荧光分子标记采用以下步骤进行：
(1)提取水稻植株的基因组DNA；
(2)PCR扩增：将所述的3条引物Allele-A、Allele-G和Common Reverse同时加入到PCR反应体系中，并对所述的水稻植株中的Bph3基因进行扩增；所述PCR反应程序为：95℃，5min；然后10个循环95℃，20sec，65℃(-0.8℃每循环)，1min；然后32个循环95℃，20sec，57℃，1min；
(3)将PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)工具，结合标记信息，自动进行基因分型，获得基因型结果；
(4)根据荧光信号值进行分析，如果扫描获得FAM荧光信号，则为含等位A碱基Bph3等位基因；如果扫描获得HEX荧光信号，则为含等位G碱基Bph3等位基因，如果同时扫描获得FAM和HEX荧光信号，则为含杂合等位A/G碱基Bph3等位基因，如图3和图5所示。
2、实验目的：标记辅助提高恢复系桂7571的褐飞虱抗性。
实施方案：水稻恢复系桂7571是在广西晚稻主载的亲本之一，感褐飞虱；而BP60有明显的褐飞虱抗性。将抗褐飞虱品种BP60与感褐飞虱品种桂7571杂交获得F1代，再与以桂7571为母本杂交获得BC1F1，用标记MM3T选择含褐飞虱抗性等位基因Bph3存在的单株为父本连续回交到BC2F1，然后自交获得BC2F2代，最后选择到农艺性状与桂7571一致，且有褐飞虱抗性的水稻株系。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院
<120> 共显性荧光分子标记及抗褐飞虱基因Bph3检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tatactgacc aagatccatc gatagtaa 48
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tatactgacc aagatccatc gatagtag 48
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cacacctgta acctggggat tc 22
Claims (10)
1.一种共显性荧光分子标记，其特征在于，所述共显性荧光分子标记由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
2.一种利用权利要求1所述共显性荧光分子标记的抗褐飞虱基因Bph3检测方法，其特征在于，所述共显性荧光分子标记的抗褐飞虱基因Bph3检测方法包括以下步骤：
第一步，提取水稻植株的基因组DNA；
第二步，将引物Allele-A、Allele-G和Common Reverse同时加入到PCR反应体系中，并对所述的水稻植株中的Bph3基因进行扩增；
第三步，将PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行检测，读取荧光强度信号值，将荧光信号值文件通过SNP decoder工具，结合标记信息，自动进行基因分型，获得基因型结果；
第四步，根据荧光信号值进行分析，如果扫描仅获得FAM荧光信号，则为含等位A碱基Bph3等位基因；如果扫描仅获得HEX荧光信号，则为含等位G碱基Bph3等位基因，如果扫描同时获得FAM和HEX两种荧光信号，则为含杂合等位A/G碱基Bph3等位基因。
3.如权利要求2所述的共显性荧光分子标记的抗褐飞虱基因Bph3检测方法，其特征在于，所述PCR反应程序为：95℃，5min；10个循环95℃，20sec，65℃，1min；32个循环95℃，20sec，57℃，1min；10个循环95℃，20sec，65℃，-0.8℃每循环。
4.如权利要求2所述的共显性荧光分子标记的抗褐飞虱基因Bph3检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系为10μL：5μL 2×PARMS mastermix，0.15μL 10mMAllele-A标记引物，0.15μL 10mMAllele-G标记引物，0.4μL 10mM Common Reverse通用反向引物，1μL模板DNA，3.3μL ddH2O。
5.一种如权利要求1所述共显性荧光分子标记在水稻抗褐飞虱基因Bph3检测中的应用，其特征在于，仅含有碱基A的Bph3等位基因的水稻DNA模板经扩增后，荧光扫描获得FAM荧光信号；仅含有碱基G的Bph3等位基因水稻DNA模板经扩增后，荧光扫描获得HEX荧光信号；含有杂合碱基A/G的Bph3等位基因水稻DNA模板经扩增后，荧光扫描获得FAM和HEX两种荧光信号。
6.如权利要求5所述的共显性荧光分子标记在水稻抗褐飞虱基因Bph3检测中的应用，其特征在于，3条引物Allele-A、Allele-G和Common Reverse同时加入到PCR反应体系进行扩增，有褐飞虱抗性水稻亲本品种等位基因Bph3序列可以根据SNP差异与正向引物Allele-A匹配而扩增获得FAM荧光信号值；而无褐飞虱抗性水稻品种等位基因Bph3序列与正向引物Allele-G匹配而扩增获得HEX荧光信号值。
7.一种如权利要求1所述共显性荧光分子标记在功能基因分子标记开发中的应用。
8.一种如权利要求1所述共显性荧光分子标记在水稻分子育种中的应用。
9.一种如权利要求1所述共显性荧光分子标记在防治褐飞虱中的应用。
10.一种如权利要求1所述共显性荧光分子标记在水稻对褐飞虱抗性中的应用。
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