CN107988423A - 水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的SNP分子标记及其应用 - Google Patents

水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的SNP分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种水稻非转基因抗咪唑啉酮类除草剂基因OsALS的SNP分子标记及其应用，检测水稻第2号染色体第18237999bp处SNP变异。本发明选择的SNP位点是独特的，此SNP位点所代表的基因OsALS能够准确地鉴定水稻品种对咪唑啉酮类除草剂的抗性；在不用喷施除草剂的情况下，准确鉴定水稻品种(系)对咪唑啉酮类除草剂的抗性水平，显著提高非转基因抗除草剂水稻品种的培育效率。本发明的检测方法准确可靠，操作简便，水稻OsALS基因的SNP位点的检出，能够预测水稻除草剂抗性，从而更好的服务非转基因水稻品种的选育或改良，在分子辅助育种领域，为抗除草剂水稻品种选育或改良提供了科学依据。

Description

水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的SNP分子标记及其应用。
背景技术
水稻是全球半数以上人口赖以生存的主要粮食作物，对人类生活和粮食安全具有重要意义。我国种植水稻历史悠久，地域广阔，是世界稻米主产国之一。每年种植面积约3500万hm2，约占粮食作物播种面积的29％。在我国所有稻作区的稻田，历来都有大量杂草发生。据统计，全国稻田杂草有200余种，其中发生普遍、为害严重、最常见的杂草约有40种(分布于各稻区为10～20种)。据调查，全国稻田草害在中等以上(2～5级)的面积达1546.7万hm2，其中严重为害(4～5级)面积为380万hm2，分别占水稻种植面积的46.8％和11.5％，损失粮食200多亿kg。农田杂草与作物争夺养料、水分、阳光和空间，妨碍田间通风透光，增加局部气候温度，有些则是病虫中间寄主，促进病虫害发生；寄生性杂草直接从作物体内吸收养分，从而降低作物的产量和品质。此外，有的杂草的种子或花粉含有毒素，能使人畜中毒。近十几年来，杂草稻成为水稻生产中一种新型草害，是杂交水稻的后代或者亲缘关系较远的水稻杂交后代经过自然和人工选择所形成，具有早发芽、早分蘖、早抽穗、早成熟、易落粒、米质差、休眠期弹性大、繁衍速度快以及难以拔除等特点。目前，杂草稻已经成为全球性草害，在一些国家，杂草稻造成水稻减产10-15％。在我国，水稻播种面积中杂草稻实际发生面积约占20％，产量平均损失在10％左右，年损失超过100亿元，被称为水稻杀手。因此，防除杂草稻成为目前水稻生产中亟待解决的问题，对于提高水稻的产量和品质有重要的意义。对稻田杂草和杂草稻的防除主要有手工拔草、农具除草及化学除草等手段。手工拔草和农具除草耗力多、工效低，不能大面积及时防除。因此，利用除草剂防除田间杂草和杂草稻是一条最有效途径。乙酰乳酸合成酶(ALS)是支链氨基酸合成途径中的首要关键酶，以其作为靶标的除草剂分为：磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸类和磺酰胺类。这类除草剂具有高活性、杀草广谱和选择性强等特点，是目前防治稻田杂草、再生稻、杂草稻较理想的除草剂。近年来，科学家们通过多种途径获得了一批非转基因抗除草剂水稻突变体，其中一些抗性表现较好的种质材料，已被成功应用于水稻育种。
系谱选育法是当前最为普遍的水稻育种方法，其通过不同亲本配组杂交，获得F1代杂交种，从F2分离世代开始在各世代进行单株选择，直至选出性状符合要求且稳定一致的品系，按系混合收获，经鉴定比较而育成水稻新品种。该育种方法具有操作简单、目标性强的优点，但由于主要依靠看、嗅、摸等方法模糊把握表型性状的优劣，把握准确性较差，一些重要基因在选育过程中容易丢失。目前，运用传统的系谱法选育抗除草剂水稻品种，只能通过喷施除草剂的办法进行抗性鉴定，抗性表型出现需要15～30天时间。在实践过程中受制于喷施时期、喷施浓度、除草剂药效及环境温度、水体等各种因素影响，其抗性稳定性较差、鉴定风险大，且抗性育种年限长、工作量大、生产成本较高。
分子标记辅助育种可以从遗传基础上跟踪目标性状，选择含有目标基因的单株进行杂交(回交)，不但能准确的进行目标性状方向的育种，而且能减小回交群体的大小，节省成本。SNP(single nucleotide polymorphism)是指在基因组上单个核苷酸的变异，利用目标基因的SNP标记可以在育种过程中进行相关性状的精准选育，也可以将相关的SNP锚定进芯片，在进行全基因组标记选择的同时选择含有此目标基因的个体(单株)。以检测水稻相关基因的SNP来预测其基因的存在己经广泛的应用在水稻育种上。在品种选育或是目标性状的改良过程中，使用基因芯片技术，Taqman技术，分子信标技术和焦磷酸测序法、变相高效液相色谱等手段来测定每一个实验单株，选择含有目标基因的SNP单株再进行实验，可以改变传统育种的盲目性，极大的减小了群体大小，节省成本。
水稻OsALS基因是已被成功克隆的非转基因抗除草剂基因，其在水稻抗除草剂育种上具有重要价值。通过化学诱变和抗性筛选，获得抗咪唑啉酮类除草剂水稻突变体，将其与主栽水稻品种杂交，借助SNP分子标记跟踪检测，可以快速、准确选育出不同背景的抗除草剂水稻新品种(系)。水稻OsALS基因SNP分子标记的设计和应用在实验室完成，避免了各种因素影响，3～4天即可准确鉴定出基因型。将该技术应用于水稻抗除草剂育种，仅需小样本群体即可快速准确地筛选出抗性植株，缩短育种年限、降低育种工作量和生产成本。该技术具有快速简便、准确性高、工作量小、生产成本低等优点，适用于水稻抗除草剂育种、品种鉴定、基因型检测等方面，极具推广和应用价值。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的SNP分子标记及其应用。
本发明是这样实现的，一种水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的SNP分子标记，所述水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的SNP分子标记检测水稻第2号染色体第18237999bp处SNP变异，多态性为G/A。
本发明的另一目的在于提供一种所述水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的SNP分子标记使用的引物，所述引物的序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
本发明的另一目的在于提供一种所述的水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的SNP分子标记或所述引物在水稻育种中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述的水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的SNP分子标记或所述引物在鉴定抗咪唑啉酮类除草剂水稻品种中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述的水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的SNP分子标记或所述引物在鉴定抗咪唑啉酮类除草剂水稻基因型中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种包含引物的辅助鉴定水稻抗除草剂基因0sALS的试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种所述试剂盒在水稻种质资源改良中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述试剂盒在水稻育种中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述试剂盒在检测抗咪唑啉酮类除草剂水稻品种或鉴定抗咪唑啉酮类除草剂水稻基因型中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述的水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的SNP分子标记或所述引物的检测抗咪唑啉酮类除草剂水稻的方法，所述检测抗咪唑啉酮类除草剂水稻的方法包括以下步骤:
(1)提取待测水稻基因组DNA，以其为模板，利用本发明的上述引物组合进行KASP反应检测；PCR扩增反应使用的扩增体系以5μl计为：2.5μl模板DNA，后加入2×KASPMasterMix 2.5μl、Assaymix 0.07μl；PCR扩增反应的条件为：PCR扩增在水浴热循环仪中完成，Touchdown PCR反应条件为:94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，61℃-55℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，55℃退火并延伸60秒，26个循环；反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形；
(2)检测扩增产物片段的第23bp处的碱基种类，若碱基种类为A，则待测水稻为抗除草剂水稻，若碱基种类为G，则判定待测水稻不是抗除草剂水稻。
本发明利用SNP分子标记进行基因型检测，可以快速、准确地鉴定水稻对咪唑啉酮类除草剂的抗性水平，减少了播种、喷施除草剂、抗性调查等辛苦操作，显著提高非转基因抗除草剂水稻品种的培育效率，同时避免了由于田间操作失误及水体污染等导致其他育种材料致死的风险。本发明选择的SNP位点是独特的，此SNP位点所代表的OsALS基因能够准确地鉴定水稻咪唑啉酮类除草剂抗性。本发明的检测方法准确可靠，操作简便，水稻OsALS基因的SNP位点的检出，能够预测水稻除草剂抗性，从而更好的服务非转基因水稻品种的选育或是改良，在分子辅助育种领域，为抗除草剂水稻品种选育或改良提供了科学依据。本发明减少了农事操作，缩短了鉴定时间，提高检测准确性等。
附图说明
图1是本发明实施例提供的检测抗咪唑啉酮类除草剂水稻的方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的SNP分子标记检测水稻第2号染色体第18237999bp处SNP变异(多态性为G/A)。
本发明实施例提供水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的SNP分子标记的扩增产物序列包括：
(1)两条特异性引物：
SEQ ID NO：1，引物X:5'-CATGTGCTGCCTATGATCCCAAG-3'。
SEQ ID NO：2，引物Y:5'-CATGTGCTGCCTATGATCCCAAA-3'。
(2)一条通用引物：
SEQ ID NO：3，引物C:5'-CACCATCCAGGATCATGTCCTTGAA-3'。
如图1所示，本发明实施例提供的检测抗咪唑啉酮类除草剂水稻的方法，包括以下步骤：
S101：提取待测水稻基因组DNA，以其为模板，利用本发明的上述引物组合进行KASP反应检测；
S102：检测扩增产物片段的第23bp处的碱基种类，若碱基种类为A，则待测水稻为抗除草剂水稻，若碱基种类为G，则判定待测水稻不是抗除草剂水稻。
步骤S101中PCR扩增反应使用的扩增体系以5μl计为：2.5μl模板DNA，后加入2×KASP MasterMix 2.5μl、Assay mix 0.07μl。
步骤S101中PCR扩增反应的条件为：PCR扩增在水浴热循环仪中完成，TouchdownPCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，61℃-55℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，55℃退火并延伸60秒，26个循环。反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
实施例1水稻抗咪唑啉酮类除草剂基因OsALS的SNP分子标记的开发
将水稻OsALS基因定位在第2染色体上物理位置:18236120-18238054区间内，以其中18237999处SNP位点为中心向两侧各扩大了50bp，利用BatchPrimer3对其进行引物设计。针对该标记，以SNP位点具有差异的水稻种质材料T2和水稻品种淮稻5号以及其他18个常规粳稻品种进行KASP反应验证。检测PCR扩增片段，获得SNP分子标记KASP反应测试在LGCSNPline基因分型平台上进行。具体操作步骤如下：
1、提取待测样品的基因组DNA(浓度约15-25ng/μl)；
2、扩增含SNP位点的核苷酸片段
在微孔反应板中加入2.5μl DNA样品，后加入KASP反应混合液，反应体系见表1。PCR扩增在水浴热循环仪中完成，Touchdown PCR反应条件为:94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，61℃-55℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，55℃退火并延伸60秒，26个循环。
表1 KASP检测的反应体系
3、PCR产物荧光显色
PCR反应完成后，利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。该SNP位点位于PCR扩增片段的23bp处，此处碱基多态性为A或G。根据结果分析若该位点碱基类型为A，则该待测品种(系)为抗咪唑啉酮类除草剂水稻，若碱基类型为G，则判定待测品种(系)不抗咪唑啉酮类除草剂。
4、试验材料与标记分型结果表2。
对20个待测水稻品种的分型结果显示，在23bp处的SNP位点，T2的碱基类型为A，表明其为抗咪唑啉酮类除草剂水稻品种；其余19个品种的碱基类型均为G，表明这些推广水稻品种均不抗咪唑啉酮类除草剂。
表2试验材料与分型结果
试验材料 分型结果 试验材料 分型结果
T2 A 连粳7号 G
淮稻5号 G 武运粳24号 G
淮稻9号 G 武香粳14号 G
淮稻14号 G 武运粳30号 G
淮糯12号 G 秀水134 G
淮香粳15号 G 南粳46 G
隆粳968 G 常农粳5号 G
淮稻18号 G 武运粳27 G
淮稻20号 G 临稻16号 G
淮119 G 圣稻19号 G
实施例2水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的SNP分子标记的应用
1、选择包含抗、感除草剂对照种质T2和淮119，以及143个回交群体植株和40个F2代分离群体植株为待测样品，提取待测水稻品种的基因组DNA。
2、针对实施例1中的SNP位点，以待测样品基因组DNA为模板，扩增出SNP所在的核苷酸片段。该SNP位点位于PCR扩增片段的23bp处，此处碱基多态性为A或G。
3、KASP反应体系、PCR反应条件及荧光扫描方法均同实施例1。根据分型结果，若扩增的PCR产物第23bp碱基类型为A，则待测材料为抗咪唑啉酮类除草剂水稻；若碱基类型为G，则判定待测材料不抗除草剂。
4、分型结果
对139个回交群体植株的Kasp分型结果显示，83个株系SNP碱基类型为杂合类型A/G，56个株系为纯合型G，未检测到纯合型A。
对40个F2代分离群体植株的Kasp分型结果显示，17个株系SNP碱基类型为纯合型A，21个株系为杂合类型A/G，2个株系为纯合型G。
本发明中使用的LGC SNPline基因分型平台与其配套试剂耗材均购于英国LGC公司。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的SNP分子标记，其特征在于，所述水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的SNP分子标记检测水稻第2号染色体第18237999bp处SNP变异，多态性为G/A。
2.一种如权利要求1所述水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的SNP分子标记使用的引物，其特征在于，所述引物的序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
3.一种如权利要求1所述的水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的SNP分子标记或权利要求2所述引物在水稻育种中的应用。
4.一种如权利要求1所述的水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的SNP分子标记或权利要求2所述引物在鉴定抗咪唑啉酮类除草剂水稻品种中的应用。
5.一种如权利要求1所述的水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的SNP分子标记或权利要求2所述引物在鉴定抗咪唑啉酮类除草剂水稻基因型中的应用。
6.一种包含权利要求2所述引物的辅助鉴定水稻抗除草剂基因OsALS的试剂盒。
7.一种如权利要求6所述试剂盒在水稻种质资源改良中的应用。
8.一种如权利要求6所述试剂盒在水稻育种中的应用。
9.一种如权利要求6所述试剂盒在检测抗咪唑啉酮类除草剂水稻品种或鉴定抗咪唑啉酮类除草剂水稻基因型中的应用。
10.一种如权利要求1所述的水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的SNP分子标记或权利要求2所述引物的检测抗咪唑啉酮类除草剂水稻的方法，其特征在于，所述检测抗咪唑啉酮类除草剂水稻的方法包括以下步骤:
(1)提取待测水稻基因组DNA，以其为模板，利用本发明的上述引物组合进行KASP反应检测；PCR扩增反应使用的扩增体系以5μl计为：2.5μl模板DNA，后加入2×KASP Master Mix2.5μl、Assay mix 0.07μl；PCR扩增反应的条件为：PCR扩增在水浴热循环仪中完成，Touchdown PCR反应条件为:94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，61℃-55℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，55℃退火并延伸60秒，26个循环；反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形；
(2)检测扩增产物片段的第23bp处的碱基种类，若碱基种类为A，则待测水稻为抗除草剂水稻，若碱基种类为G，则判定待测水稻不是抗除草剂水稻。
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