CN109880928A - 检测油菜als基因发生snp突变的标记引物、检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开检测油菜ALS基因发生SNP突变的标记引物、检测试剂盒及其应用。本发明的标记引物能直接反映植株的抗性，不存在由于遗传交换而造成的错误鉴定，能对油菜ALS1基因SNP突变位点的C或T碱基进行特异的区分和检测。本发明提供的标记引物只需PCR和荧光检测两个步骤，成本低、通量高、加上特异性高，特别适用于育种群体中不同抗性基因型的分类筛选与鉴定。本发明的分子标记方法彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染、EB对环境的污染和甲醛对人体的危害，具有简便、可靠、快速、特异性强、灵敏度高、环境友好的显著优点。本发明提供的SNP分子标记应用方法准确可靠，操作简便，适用于ALS1抗性突变位点的鉴定及辅助选择育种。

Description

检测油菜ALS基因发生SNP突变的标记引物、检测试剂盒及其 应用

技术领域

本发明涉及作物分子遗传育种技术领域，具体涉及检测油菜ALS基因发生SNP突变的标记引物、检测试剂盒及其应用。

背景技术

杂草是影响油菜生产的重要生物灾害之一。油菜生长因杂草对水、肥、气、热和空间的竞争导致开花和结实率降低，产量损失严重。据统计，杂草危害可使油菜籽产量下降15.8％，严重的减产幅度可达50％以上(官春云.优质油菜生理生态和现代栽培技术.北京：中国农业出版社，2013：127-135)。我国油菜田杂草种类多、数量大、危害重，长江流域冬油菜区杂草危害面积达46.9％，北方春油菜区草害面积高达90％以上，且以双子叶杂草为主。占全国油菜面积90％的冬油菜区，田间草相可分为两大类，稻茬油菜田为禾本科杂草和阔叶杂草混生型，旱茬油菜田以阔叶杂草为主(王汉中.中国油菜生产抗灾减灾技术手册.北京：中国农业科学技术出版社，2009：91-95)。生产上使用稳杀得、盖草能、禾草克等除草剂能有效防除油菜田单子叶杂草，对减轻杂草危害、降低人工除草劳动强度和提高油菜产量起到一定的作用。但对绝大多数阔叶杂草，目前还未开发出安全高效的除草剂，因此我国油菜化除面积非常有限。

乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase，ALS；EC2.2..16)抑制剂类除草剂是目前世界上开发品种最多、应用范围最广的一类除草剂，具有低毒、高效、杀草谱广等优点，深受农户喜爱。该类除草剂主要有磺酰脲类(sulfonylureas，SU)、咪唑啉酮类(imidazolinones，IMI)、三唑嘧啶类(triazolopyrimidines，TP)、嘧啶水杨酸类(pyrimidyl-benzoates，PB)和磺酰氨羧基三唑啉酮类(sulfonlyaminocarbonyl-triazolinones，SCT)。其中SU类除草剂如苯磺隆、噻吩磺隆、烟嘧磺隆等对阔叶杂草具有良好的防除效果，但对双子叶作物油菜具有强烈的生长抑制作用，不能在油菜生产上应用。创制SU类除草剂抗性突变体种质，选育抗性品种可有效解决这一难题。然而对于遗传背景较为复杂的异源四倍体作物油菜，创制具有除草剂抗性的突变体新种质必需依赖大群体高选择压的长期筛选与鉴定，而应用常规育种手段培育抗除草剂油菜品种更是周期长、成本高、工作量大、效率低。

前期，我们应用甲磺酸乙酯(Ethylmethylsulfone，EMS)诱变萌动甘蓝型油菜种子N131(公知公用，见浦惠明等，江苏农业学报，2010，26(6)：1432-1434)，结合多年大规模定向选育成功创制了抗SU类除草剂油菜突变体种质DS3(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.14298)。通过测序分析，发现DS3中有两处ALS基因突变，分别是油菜ALS1氨基酸序列中Pro182Leu和ALS3氨基酸序列中Trp556Leu。发生双基因突变的抗性种质DS3中的乙酰乳酸合酶对SU类除草剂不敏感，使得油菜具有除草剂的显著抗性，抗性浓度达到除草剂杂草防治推荐使用浓度的12倍以上(胡茂龙等，具有除草剂抗性的乙酰乳酸合酶突变蛋白及其应用；中国专利ZL201710568511.7)，使该种质在抗除草剂油菜品种选育中具有重要的应用价值。运用传统的育种方法培育抗除草剂油菜品种是将含双基因突变的DS3与生产上推广的主栽品种进行杂交或回交，然后在每个分离后代中通过喷施除草剂进行抗性鉴定，喷药处理15～30天后，根据抗性表型选择抗性单株。但是在育种实践过程中受制于喷施时期、喷施浓度、除草剂药效及环境温度等各种因素影响，极易导致误选。另外，DS3中含有两个抗性基因位点，通过喷施除草剂筛选抗性单株也会导致某个抗性基因位点的丢失，使材料的抗性效应下降，且抗性育种年限长、工作量大、生产成本较高。现代分子标记辅助选择技术可以从遗传基础上跟踪目标性状，选择含有目的基因的单株，这样可以减小育种群体的大小，节省成本，提高育种效率。标记辅助选择的前提是要获得与目的基因紧密连锁的分子标记，前期我们在专利CN104789682A中已公开了检测DS3中ALS3基因突变位点Trp556Leu的分子标记，为此我们还需要开发一种高通量、高准确性的检测DS3中ALS1基因突变位点Pro182Leu分子标记，用于该材料后续杂交转育的分子标记辅助选择，培育适应机械化生产方式的抗除草剂油菜品种。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了KASP标记引物。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述KASP标记引物在检测油菜ALS基因发生SNP突变方面的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种油菜ALS1基因发生SNP突变的检测试剂盒。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种用于检测油菜ALS1基因第+545位碱基发生SNP突变的方法。

本发明还要解决的技术问题是提供了获得具有磺酰脲类除草剂抗性的分子标记辅助选择方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供了鉴定并增加杂交油菜种子纯度的方法。

单核甘酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)是指在基因组上单个核苷酸变异形成的遗传标记，属于新一代标记技术。SNP是个体间最常见的遗传变异形式，特别是存在基因内部的SNP，是分子标记辅助选择最理想的标记。竞争性等位基因PCR(kompetitive allele specific PCR，KASP)是一种基于荧光检测SNP的技术。KASP技术通过计算机记录并分析PCR过程中产生的荧光信号，实现对突变位点监测。检测结果与表现型一致性高；检测过程无需电泳，彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染和EB对环境的污染和对人体的危害。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：本发明提供了一种检测油菜ALS1基因中Pro182Leu发生SNP突变的KASP标记，该标记是通过对SNP突变的确定，然后以候选SNP位点为中心提取两侧50bp侧翼序列，设计多个引物组，经过多次多态性筛选获得，并在多个分离群体中经多次测试验证，标记KBnALS1_1968545A扩增效最佳，且能准确区分检测材料中ALS1基因位点Pro182Leu的基因型。标记含有三条引物，两条针对关键位点碱基差异设计的特异性引物，一条通用引物。标记信息如表1所示。

表1标记KBnALS1_1968545A详细信息

优选的，两条特异性引物5′端分别连接不同的荧光接头序列。更优选的，荧光接头序列为FAM或HEX。

本发明内容还包括所述KASP标记引物在检测油菜ALS1基因发生SNP突变方面的应用。

本发明内容还包括一种油菜ALS1基因发生SNP突变的检测试剂盒，所述检测试剂盒含有所述的KASP标记引物。

其中，所述检测试剂盒还包括KASP反应混合液。

本发明内容还包括一种用于检测油菜ALS1基因第+545位碱基发生SNP突变的方法，所述检测方法包括以下步骤：

1)提取油菜样品基因组DNA；

2)以油菜基因组DNA为模板，利用所述的KASP标记引物进行KASP反应检测；

3)如果只检测到第+545位碱基对应的碱基C，则判定检测的油菜样品中不含抗磺酰脲类除草剂基因ALS1突变位点；如果只检测到第+545位碱基对应的碱基T，则判定检测的油菜样品中含抗磺酰脲类除草剂基因ALS1突变位点；若检测位点第+545位碱基同时检测到C和T，则判断检测的油菜样品中含杂合的抗磺酰脲类除草剂基因ALS1突变位点。

其中，所述KASP反应检测包括PCR扩增和荧光检测，所述PCR扩增条件为：94℃15min；94℃20sec，61-55℃1min，每个循环退火温度降低0.6℃，共10个循环；94℃20sec，55℃1min，共26个循环。

本发明内容还包括获得具有磺酰脲类除草剂抗性的分子标记辅助选择方法，所述方法包括：采用所述的KASP标记引物进行基因型检测，将含有抗性基因杂合型单株与轮回亲本回交，这样通过多次回交，在最后一代的自交群体中通过基因型检测，选择含抗性基因纯合型单株就可以培育出抗除草剂油菜。

本发明内容还包括鉴定并增加杂交油菜种子纯度的方法，所述方法为采用所述步骤1)～3)得到的分型结果统计杂交油菜种子的纯度，若杂合型的油菜杂交种种子数量占比未达到85％，需要通过田间喷施除草剂去杂；若杂合型的油菜杂交种种子数量占比达到85％及以上，不需要通过田间喷施除草剂去杂。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有下列优点和效果：

1、本发明提供的KASP分子标记是功能型基因分子标记。在育种实践工作中，与目的基因紧密连锁的分子标记在应用过程中有可能受到遗传背景的限制。本发明所涉及的SNP分子标记是基于油菜功能基因ALS1突变位点设计的功能性标记，能直接反映植株的抗性，不存在由于遗传交换而造成的错误鉴定。因此该标记可在很大程度上避免遗传背景的不同对检测结果的影响。

2.本发明提供的分子标记能对油菜ALS1基因SNP突变位点的C或T碱基进行特异的区分和检测。

3.本发明提供的分子标记在实际应用中，低成本、高通量。目前，检测SNP的方法有测序法、DNA芯片、质谱检测法等，而这些方法大多成本高，速度慢。本发明提供的分子标记只需PCR和荧光检测两个步骤，成本低、通量高、加上特异性高，特别适用于育种群体中不同抗性基因型的分类筛选与鉴定，本发明开发的KASP分子标记KBnALS1_1968545A及检测方法可以有效区分出ALS1基因抗性突变位点(C/T)的基因型，对群体内单株抗除草剂基因型选择效率为100％。

4.本发明提供的分子标记方法彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染、EB对环境的污染和甲醛对人体的危害，具有简便、可靠、快速、特异性强、灵敏度高、环境友好的显著优点。本发明提供的SNP分子标记应用方法准确可靠，操作简便，适用于ALS1抗性突变位点的鉴定及辅助选择育种。

5、本发明提供的方法可以有效鉴定并增加油菜杂交种纯度，通过苗期喷施除草剂去杂，相对于对照纯度分别提高12％和17％。

附图说明

图1示例性地显示了标记KBnALS1_1968545A在DS3、N340、N341及其F₁和F₂群体中的检测效果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常用分子生物学、组织培养技术和农学手册所记载的常规方法。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明中使用的LGC SNPline基因分型平台与其配套试剂耗材均购于英国LGC公司。

实施例1：检测油菜ALS1基因Pro182Leu位点发生突变的SNP分子标记的设计

DS3是前期我们通过两轮EMS诱变和多年定向选育创制获得，具有对磺酰脲类除草剂高度抗性的油菜新种质，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为CGMCCNo.14298)。该种质在抗除草剂油菜品种选育中具有重要的应用价值，已经被全国20多家油菜育种单位引进应用，用于抗除草剂油菜品种选育。通过基因克隆和功能验证发现DS3中有两处ALS基因突变，分别是油菜ALS1氨基酸序列中Pro182Leu和ALS3氨基酸序列中Trp556Leu。育种家在利用该抗性种质进行抗除草剂品种选育的过程中，聚合DS3中的两个突变位点才能获得高抗除草剂材料。开发与目的基因紧密连锁的分子标记，建立抗性基因分子标记辅助选择系统，不仅能有效选择含有目的基因的单株，而且可以减小育种群体，节省成本，提高育种效率。检测ALS3基因突变位点Trp556Leu的分子标记已在专利CN104789682A中公开，我们还需要开发一种高通量、高准确性的检测ALS1基因突变位点Pro182Leu分子标记。

首先，为了明确DS3中的ALS1基因抗性突变位点Pro182Leu在抗性材料中的唯一性，我们设计扩增油菜ALS1基因的引物对：BnALS1-1F：5′-TCATCTCTCTCTCCTCTAACC-3′和BnALS1-1R：5′-GATCACCAGCTTCATCTCTC-3′，选取了10个敏感型油菜品种(品系)，其中N131(公知公用，浦惠明等，江苏农业学报，2010，26(6)：1432-1434)为DS3的原始野生型材料，N221、N340和N341(公知公用，浦惠明等，中国油料学报，2011，33(1)：15-19)和3075R(浦惠明等，2002，江苏农业科学，4∶33-34)为本单位选育的甘蓝型油菜MICMS双低恢复系，常规油菜品种宁油16号为江苏省审定品种(苏审油200404)、宁油18号为上海市审定品种[沪农品审油菜(2006)第002号]、宁油20号[GPD油菜(2018)320173]、宁油22号[GPD油菜(2018)320205]和宁油26号[GPD油菜(2018)320221]为江苏省登记油菜品种(表2)。采用CTAB法提取叶片基因组DNA(Murray M G，et al.，Nucleic Acids Research，1980，8(19)：4321-4326)，PCR克隆10个材料的BnALS1基因。按东洋纺(上海)生物科技有限公司高保真性DNA聚合酶KOD-Plus试剂盒说明书配制50μL PCR反应体系。在MJ Research PTC-200型PCR仪上进行扩增，反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2.5min，共35个循环。产物经平末端加A后，在1.2％(V/W)琼脂糖凝胶电泳分离后，用北京天根生化科技有限公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209)纯化回收，送于南京金斯瑞生物有限公司测序。测序结果表明，10个敏感型油菜品种(品系)的BnALS1的第+545处核苷酸为C，而抗性材料DS3中BnALS1突变为T，C/T突变产生了Pro182Leu的变异，明确了DS3中的BnALS1基因抗性突变位点Pro182Leu在抗性材料中的唯一性，与抗性的紧密关联性(表2)。

表2抗性突变位点的鉴定

表注：R代表22.5g a.i.ha^-1苯磺隆除草剂处理后油菜植株生长良好，无药害表现；s代表除草剂处理后油菜植株生长受到严重抑制，药害表现明显，最终植株死亡(以下同)。

其次，基于BnALS1基因抗性突变位点(C/T)可以开发分子标记检测抗性基因，但由于在甘蓝型油菜基因组内共存在三个具有功能的ALS基因，它们的核酸序列具有高度同源性，特别是BnALS1和BnALS3在核酸水平的同源性达98％，使得在基因编码区内很难开发出引物特异扩增BnALS1和BnALS3的基因片段。为此必须要找到这两个基因在DS3与其它敏感型材料间的序列差异，通过BnALS1和BnALS3的序列差异设计引物特异扩增BnALSl基因序列片段，排除BnALS3基因序列对检测抗性基因的干扰。因此，我们设计了扩增油菜BnALS3基因的引物对：BnALS3-1F：5′-CTCTCTCTCTCTCATCTAACCAT-3′和BnALS3-1R：5′-CTCTCAGTACTTAGTGCGACC-3′。按上述方法扩增10个敏感型油菜品种(品系)的BnALS3基因、回收测序，获得BnALS3基因详细序列结果。

最后，根据BnALS3测序结果以及与BnALS1基因序列比对，基于BnALS1基因抗性突变位点突变信息特点，设计两组KASP引物，每组引物由三条引物组成，其中两条特异引物3′末端为等位变异碱基C/T，且在5′端分别连接英国LGC(Laboratory of the GovernmentChemist)公司KASP反应试剂特定的FAM和HEX荧光接头序列。通用引物的序列选择要保证扩增片段在60-120bp(表3)。所有引物委托英国LGC公司合成。

表3设计用于检测抗性突变位点的KASP分子标记引物序列

实施例2：KASP分子标记检测油菜ALS1基因Pro182Leu抗性突变位点体系的建立

利用上述设计的两组KASP引物，选取含有抗性突变位点的DS3及其后代衍生株系和不含抗性突变位点的N131和其它油菜品种(品系)，以及它们杂交获得的F₁代共30个油菜材料，在LGCSNPline基因分型平台上进行KASP反应验证。具体操作步骤如下：

1、油菜基因组DNA的提取：

取适量待测油菜品种(品系)叶片组织，采用CTAB法提取全基因组DNA(Murray MG，et al.，Nucleic Acids Research，1980，8(19)：4321-4326)。用琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别检测所提取DNA的质量，发现提取的基因组DNA均达到相关的质量要求，即琼脂糖电泳显示DNA条带单一，说明没有明显降解弥散；Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间，说明DNA样品没有蛋白污染；A260/230介于2.0-2.2之间，说明DNA样品盐离子浓度低；270nm没有明显的光吸收，说明DNA样品没有酚污染；稀释DNA浓度为20ng/μL备用。

2、以步骤1提取的DNA为模板，采用实施例1开发的用于检测DS3中ALS1突变基因的KASP标记两组引物进行扩增PCR和荧光检测，得到扩增产物。

PCR扩增检测体系的配置：

在微孔反应板中加入2.5μL提取的DNA样品为模板，后加入KASP反应混合液，反应体系如下。

模板DNA 2.5μL

2×KASP Master mix 2.5μL

KASP Assay mix 0.07μL

PCR反应条件为：94℃15min；94℃20sec，61-55℃1min，每个循环退火温度降低0.6℃，共10个循环；94℃20sec，57℃1min，共26个循环。若扩增效果不理想可加循环recycling，每次3个循环，最多可三次。

反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况。

3、ALS1等位基因分型

ALS1等位基因分型结果发现，标记KBnALS1_1968545A能够精准检测抗性突变位点且扩增效果良好，将分型结果与PCR产物测序结果以及与田间油菜材料的苗期抗除草剂性状鉴定的结果比较，也发现该标记KBnALS1_1968545A分型结果与测序结果、抗除草剂性状鉴定的表型结果一致(表4)。

表4 KASP标记KBnALS1_1968545A初筛分型结果

表注：R代表用SU类除草剂苯磺隆22.5g a.i.ha^-1处理后油菜植株生长良好，无药害表现；S代表除草剂处理后油菜植株生长受到严重抑制，最终植株死亡。

通过前述的两组引物对进行了扩增检测实验，另外一组分子标记为KBnALS1_1968545B的引物组合不能有效区分出C/T基因型，没有多态性，至此，我们获得了检测油菜ALS1基因Pro182Leu抗性突变位点的KASP分子标记引物和检测体系，具体引物如下：

分子标记为KBnALS1_1968545A，其多态性位点碱基为C或T。该标记组合包括两条特异性引物及一条通用引物，其中，特异性引物分别为CAGTACCGATCATCCGGCGAG(Primer_Allele X：SEQ ID NO.1)、CAGTACCGATCATCCGGCGAA(Primer_Allele Y：SEQ ID NO.2)，通用引物为TGACAGTGTTCCTCTTGTCGCCATT(Primer_Common：SEQ ID NO.3)。

至此我们获得了检测试剂盒，该检测试剂盒包括该KASP分子标记引物，还包括检测体系。所述的KASP分子标记引物包括两条特异引物，其中特异引物

Primer_Allele X：5’-CAGTACCGATCATCCGGCGAG-3’，如序列SEQ ID NO.1所示；另一特异引物，

Primer_Allele Y：5’-CAGTACCGATCATCCGGCGAA-3’，如序列SEQ ID NO.2所示；通用引物，

Primer_Common：5’-TGACAGTGTTCCTCTTGTCGCCATT-3’，如序列SEQ ID NO.3所示。

将上述引物按2∶2∶5配制成如下表终浓度的KASP Assay mix

表5检测试剂盒中引物配比

引物名称	KASP Assay mix中引物终浓度(μM)
		Primer_Allele X	12
Primer_Allele Y	12
		Primer_Common	30

所述的KASP反应检测体系：

5μL体系：

2×KASP Master mix 2.5μL

KASP Assay mix 0.07μL

或

10μL体系：

2×KASP Master mix 5μL

KASP Assay mix 0.14μL

在微孔反应板中加入5-10ng待检测DNA样品，随后加入上述KASP反应混合液，建立5或10μL的KASP反应体系进行PCR反应。

本发明通过以上检测试剂盒(KASP分子标记引物、KASP反应检测体系)，结果如果只检测到引物Primer_Allele X对应的碱基C，则判定检测的油菜样品中不含抗SU类除草剂基因ALS1突变位点；如果只检测到引物Primer_Allele Y对应的碱基T，则判定检测的油菜样品中含抗SU类除草剂基因ALS1突变位点；若检测位点同时检测到C和T，则判断检测的油菜样品中含杂合的抗SU类除草剂基因ALS1突变位点。

实施例3：分离群体中验证分子标记KBnALS1_1968545A的检测效果

为验证KASP分子标记KBnALS1_1968545A在F₂群体中对DS3的BnALS1基因抗性突变位点(C/T)基因型的检测效果，我们以MICMS双低恢复系N340和N341(浦惠明等，中国油料学报，2011，33(1)：15-19)为母本，抗性种质DS3为父本在油菜开花期配置2个杂交组合(N340×DS3和N341×DS3)，F₁套袋自交获得F₂群体，用分子标记KBnALS1_1968545A对F₂群体单株的BnALS1基因抗性突变位点(C/T)基因型进行检测。DNA提取、PCR反应、KASP检测等具体步骤同实施例2(采用实施例2检测试剂盒)。基因分型结果表明，在F₂群体中呈现3种基因型的植株(图1)，即引物Primer_Allele X对应的碱基C，该类油菜单株中不含抗SU类除草剂基因ALS1突变位点，该位点为纯合型C/C；引物Primer_Allele Y对应的碱基T，该类油菜单株中含抗SU类除草剂基因ALS1突变位点，该位点为纯合型T/T；检测位点同时检测到C和T，该类油菜单株中含抗SU类除草剂基因ALS1突变位点，该位点为杂合型C/T。F₂(N340×DS3)群体共分析210个单株，具有纯合型C/C的单株40个，具有纯合型T/T的单株59个，而具有杂合型C/T的单株111个，3种基因型符合1∶2∶1(χ²＝0.092，P＝0.995)。F₂(N341×DS3)群体共分析59个单株，具有纯合型C/C的单株15个，具有纯合型T/T的单株15个，而具有杂合型C/T的单株29个，3种基因型符合1∶2∶1(χ²＝0.001，P＝0.999)。两个群体均符合一对基因遗传分离规律，标记检测结果也与苗期喷施除草剂鉴定表型结果一致。由此表明，使用本发明开发的KASP分子标记KBnALS1_1968545A及检测方法可以有效区分出ALS1基因抗性突变位点(C/T)的基因型，对群体内单株抗除草剂基因型选择效率为100％。

实施例4：分子标记KBnALS1_1968545A辅助选择抗除草剂MICMS恢复系

选育抗除草剂杂交油菜可以解决当前油菜田双子叶杂草的化学除草难题，节本省工，而且抗除草剂性状还能作为标记性状在杂交油菜制种中加以利用，前提是必须将抗除草剂性状导入到MICMS恢复系。利用本发明的分子标记KBnALS1_1968545A通过标记辅助选择技术可以快速选育抗磺酰脲类除草剂的MICMS恢复系。我们对两个F₁(N340×DS3和N341×DS3)单株自交获得的F₂群体中的植株进行抗性基因型检测，将含有纯合型(T/T)的可育单株套袋自交，就可获得抗SU类除草剂基因BnALS1突变基因纯合型的F₃种子。同时淘汰杂合型(C/T)以及纯合(C/C)除草剂敏感型单株，减小了育种的工作量，免去了后续在每个分离后代中都需要喷施除草剂进行鉴定的大量田间试验工作。另外，由于F₁的母本N340和N341为带有不育细胞质的恢复系，自交后代中选择可育的单株套袋自交，就可选育出抗磺酰脲类除草剂的MICMS恢复系。目前已从这两个2后代群体中选择到生长势强、成熟期适中的抗性株系100多个。

本实施例给出了采用本发明的分子标记KBnALS1_1968545A在F₂代群体选择纯合抗性恢复系的过程。当然，育种家还可以通过多代回交、标记辅助选择、最后一代自交的方法，即通过轮回选择将抗性基因转育到普通油菜中。基本选育过程是以抗磺酰脲类除草剂油菜DS3为父本，普通油菜为母本杂交获得F₁，然后以普通油菜为轮回亲本，在每次回交前，采用本发明的分子标记KBnALS1_1968545A进行基因型检测，将含有杂合型(C/T)的抗性基因杂合型单株与轮回亲本回交。这样通过多次回交，在最后一代的自交群体中通过基因型检测，选择含纯合型(T/T)的抗性基因单株就可以培育出抗除草剂油菜。

实施例5：分子标记KBnALS1_1968545A在鉴定油菜杂交种纯度中的应用

利用杂种优势可大幅度提高油菜产量。杂种优势利用成功与否取决于两个重要条件，一是显著的杂种优势，二是合适的遗传交配系统及高效安全的杂种制种技术。目前我国杂交油菜应用的遗传交配系统主要有细胞质雄性不育系统、细胞核雄性不育系统和化学诱导的雄性不育系统等。细胞质雄性不育系统因不育系对低温敏感，早期会产生微量花粉，影响杂种纯度。细胞核雄性不育系统因不育系繁殖或制种过程中必须拔除可育株，增加了杂种生产的难度和成本，而且人工去除技术要求高，难免有遗漏，也会影响杂交种纯度。化学诱导的雄性不育是利用杀配子剂或化学杂交剂(CHA)处理正常自交系的花蕾诱导产生的一种雄性不育，近年来受到油菜育种家的高度关注，已经成为油菜杂种优势利用的一条重要途径。在化学杀雄制种过程中，如果母本杀雄不够彻底，造成自交结实，也会影响杂交种纯度。因此杂种纯度是制约杂交油菜增产潜力的重要因素。

前期试验表明，我们将除草剂抗性性状转育到恢复系材料中，通过在杂交种苗期喷施除草剂去除田间杂草的同时去除不育系自交株可增加杂种F₁纯度。本发明提供了一种新的策略，可先通过本发明的高通量的分子标记KBnALS1_1968545A分型方法，对杂交油菜种子提前进行纯度鉴定，对种子纯度达到油菜杂交种国家质量标准GB4407.2-2008要求的，就不需要通过苗期喷施除草剂去杂。根据上述实施例1步骤3中得到的分型结果统计杂交油菜种子的纯度，若杂合型的油菜杂交种种子数量占比未达到85％，就需要通过田间喷施除草剂去杂；若杂合型的油菜杂交种种子数量占比达到85％，可以不需要通过田间喷施除草剂去杂。我们将抗性基因转育到MICMS恢复系中，在3种不同授粉条件下与不育系杂交，制得F₁杂种，通过利用本发明的分子标记KBnALS1_1968545A对种子进行纯度鉴定，发现网罩隔离授粉和自然授粉条件下的F₁杂种纯度均达不到85％的国标要求，然后我们通过苗期喷施除草剂去杂，相对于对照纯度分别提高12％和17％(表6)。在此之前，杂交油菜种子的纯度，主要通过田间小区种植以及DNA指纹图谱技术进行鉴定。前者，受环境的影响较大，且鉴定时间长；后者，则需要开发较多的分子标记，且每一个样品都需要所有开发的标记鉴定，工作量较大。

表6标记KBnALS1_1968545A鉴定种子纯度及喷施除草剂对F₁杂种纯度的提高

以上所述仅为本发明的较佳实施例而己，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 检测油菜ALS基因发生SNP突变的标记引物、检测试剂盒及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagtaccgat catccggcga g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagtaccgat catccggcga a 21

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgacagtgtt cctcttgtcg ccatt 25

Claims (10)

1.KASP标记引物，其特征在于，所述KASP标记引物包括两条特异性引物和一条通用引物，所述两条特异性引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述通用引物如SEQ IDNO.3所示。

2.根据权利要求1所述的KASP标记引物，其特征在于，所述两条特异性引物5' 端分别连接不同的荧光接头序列。

3.权利要求1或2所述KASP标记引物在检测油菜ALS基因发生SNP突变方面的应用。

4.一种油菜ALS1基因发生SNP突变的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒含有权利要求1或2所述的KASP标记引物。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括KASP反应混合液。

6.一种用于检测油菜ALS1基因第+545位碱基发生SNP突变的方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

1）提取油菜样品基因组DNA；

2）以油菜基因组DNA为模板，利用权利要求1或2所述的KASP标记引物进行KASP反应检测；

3）如果只检测到第+545位碱基对应的碱基C，则判定检测的油菜样品中不含抗磺酰脲类除草剂基因ALS1突变位点；如果只检测到第+545位碱基对应的碱基T，则判定检测的油菜样品中含抗磺酰脲类除草剂基因ALS1突变位点；若检测位点第+545位碱基同时检测到C和T，则判断检测的油菜样品中含杂合的抗磺酰脲类除草剂基因ALS1突变位点。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3）KASP反应检测包括PCR扩增和荧光检测，所述PCR扩增条件为: 94℃15min；94℃ 20sec，61-55℃ 1min，每个循环退火温度降低0.6℃，共10个循环；94℃ 20sec，55℃ 1min，共26个循环。

8.获得具有磺酰脲类除草剂抗性的分子标记辅助选择方法，其特征在于，所述方法包括：采用权利要求1或2所述的KASP标记引物进行基因型检测，将含有磺酰脲类除草剂抗性基因杂合型单株与轮回亲本回交，并通过多次回交，在最后一代的自交群体中通过基因型检测，选择含磺酰脲类除草剂抗性基因纯合型单株即培育出抗磺酰脲类除草剂油菜。

9.鉴定并增加杂交油菜种子纯度的方法，其特征在于，所述方法为采用权利要求6所述步骤1）~3）得到的分型结果统计杂交油菜种子的纯度，若杂合型的油菜杂交种种子数量占比未达到85%，需要通过田间喷施除草剂去杂；若杂合型的油菜杂交种种子数量占比达到85%及以上，不需要通过田间喷施除草剂去杂。

10.根据权利要求9所述的鉴定并增加杂交油菜种子纯度的方法，其特征在于，所鉴定并增加杂交油菜种子纯度的方法是通过对网罩隔离授粉或自然授粉条件的F₁杂种纯度进行鉴定，然后通过在苗期喷施除草剂去杂增加种子纯度。