CN115786563B - 一种与玉米高温响应性状紧密连锁的分子标记及其扩增引物和应用 - Google Patents
一种与玉米高温响应性状紧密连锁的分子标记及其扩增引物和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种与玉米高温响应性状紧密连锁的分子标记及其扩增引物和应用，属于分子标记技术领域。本发明以田间自然突变体wil2和自交系材料B73杂交，后代自交构建的F2群体为材料，开发得到一种位于2号染色体上的与候选耐高温基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记与玉米高温响应紧密连锁，为筛选耐高温性状玉米或辅助分子育种奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种与玉米高温响应性状紧密连锁的分子标记及其扩增引物和应用。
背景技术
玉米(Zea may L.)是当今世界最重要的粮食、饲料、工业原料和能源作物，在保障世界粮食安全、经济发展及缓解能源危机等方面作用巨大。然而，人类活动的加剧和全球气候的变化，粮食安全正面临高温、干旱、盐胁迫带来的巨大挑战。根据专业评估报告显示，在过去一个多世纪以来，地球表面温度表现出明显的上升趋势。小麦、玉米等农作物受到严重的气候影响，研究发现每十年的气候变化造成玉米单产减少1.2％。温度作为影响作物生长发育关键气候要素，其变化对作物生产将产生深远的影响。这对人类来说是一个警示，农业生产不得不面对高温的挑战。
目前，气温升高对我国大部分玉米带地区的生产造成了严重的负面影响，因此近年来越来越多的研究者开始重视高温对玉米的物质生产能力和生理过程的影响。在高温干旱条件下，为防止叶绿体结构遭到破坏，叶片会发生皱缩，使光合面积减小，大大降低叶片的光合作用能力。玉米在高温天气下物质消耗增加，导致积累下降，持续的高温还会使玉米提前结束生育过程，直接进入成熟期，造成籽粒干瘪，产量和品值下降。因此，研究植物对高温的响应机制及如何减轻高温胁迫对植物造成的损伤具有重要的理论和实践意义。
目前已经报道的参与植物高温响应的基因存在较大差异，目前在公布号为CN109053870B的专利中公开了AtERF49基因在植物响应高温胁迫过程中的应用，公布号为CN111088239A的专利公开了一种玉米高温响应蛋白激酶ZmCDPK7，研究其编码基因及应用，旨在筛选出能够响应高温的CDPK并明确其功能，公布号为CN113583995A的专利公开了一种玉米酪蛋白激酶2CK2α2，其编码基因在高温胁迫响应中的应用，旨在解决当前玉米耐高温基因资源及种质资源匮乏的技术问题。可见，目前关于植物高温响应的基因的报道较为有限，开发与玉米高温响应性状紧密连锁的分子标记对快速鉴定玉米耐高温性状有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与玉米高温响应性状紧密连锁的分子标记及其扩增引物，根据两个玉米自交系材料之间的序列多态性开发了一种Indel标记，可用于高温响应的分子育种。
本发明提供了一种与玉米高温响应性状紧密连锁的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供了一种用于扩增所述分子标记的引物对，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示的反向引物。
本发明提供了一种用于检测具有耐高温性状玉米的试剂盒，包括所述引物对和核酸扩增试剂。
本发明提供了所述分子标记、所述引物对或所述试剂盒在筛选和/或鉴定具有耐高温性状的玉米中的应用。
本发明提供了所述分子标记、所述引物对或所述试剂盒在耐高温玉米辅助选择育种中的应用。
优选的，所述耐高温中高温是指不低于28℃的气温。
本发明提供了一种与玉米高温响应性状紧密连锁的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明基于田间自然突变体wil2和自交系材料B73杂交后代，开发出一种与玉米高温响应紧密连锁的Indel分子标记，在耐高温的玉米材料中含有插入有SEQ ID NO:31所示的DNA片段的分子标记，而高温敏感的玉米材料中扩增产物不含SEQID NO:31所示的DNA片段。经大田种植验证，所述分子标记的扩增结果与耐高温性状一致，因此以所述分子标记鉴定耐高温材料或在玉米高温响应分子育种中具有重要的应用价值。
附图说明
图1为wil2突变体的表型特征，其中A：突变体的田间表型图；B：突变体与野生型的叶片表型图；C：突变体和野生型叶片中的叶绿素含量结果；D：突变体和野生型叶片失水速率结果；E：突变体和野生型气孔形态及数目观察结果；F：气孔数目和气孔密度统计结果；其中，采用t-test用于显著性检验；*、**分别代表0.05、0.01水平上显著，ns代表不显著；
图2为突变位点定位结果，A：突变位点BSR-seq初定位结果；B：基因定位示意图；
图3为标记筛选不同材料的结果，A：筛选不同材料的琼脂糖胶图；其中，胶孔自左至右分别为自交系B73、B73、W22、W22、B104、B104，Marker为2k；B：筛选到的材料的田间表型；
图4为标记鉴定未知材料的结果，A：用此Indel标记引物wiR35-F/R筛选了24粒未知玉米籽粒的琼脂糖胶图，自左至右编号依次为1-24，Marker为2k；B：对未知玉米籽粒筛选的部分大田种植结果。其中左侧为对照组，右侧为实验组。
具体实施方式
本发明提供了一种与玉米高温响应性状紧密连锁的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1(GACCGGCGTATATCTAGTGGTAATTCGCATGAGGCCGAGGGAGAGACGAGAGACAGAAGCGGAGGGAACCGGCCCGGTCATCTTTCCTTGGCAACCAAGGCAGTGAAGGGAACCTCAACCTGCAGCGTGGGCCCAGCTGTCTAAACACTAAGGCCATGTTCCAATCTCGTGAGATAAACTTTAGCAGCTTTTTTTAGCTACTTTTAGCCATTTGTAATCTAAACAAGAGAGCTAATGGTGGTAATTGAAACTAAACTTTAGCACTTCAACTCATATAGCTAAAGTTTAGCAGGAAGCTAAAGTTTATCCCGTGAGATTGAAACGGGGCCTAACTAGTACTGCTCCTAGGCTTCCCTTTTCTCTCCGCGGCGTTCGCGTTGGATTTGGGGTTGCTTCCCCGCTTCTGGATGGCCAGGCCACCGCACGCCGTTGCAATGCTTGTCGGGCGGCGGGGGCTCTGCTAGATTTTTTGACGCGGGCTTACACCCGCGTCGCGCGGCCGCCGCAACGGACCTGGCTCGCCACACGTGGGCGCCAACGAGGGCTGGCTGGCCTGGCTTTGTTTTGTTTATCGTGCTTGTTCTCGG)所示。
在本发明中，所述分子标记的获得来源于田间自然突变体wil2的发现，该突变体遗传背景为W22，将该突变体wil2与自交系材料B73杂交，构建F1群体，F1群体自交构建F2群体。首先利用BSR-seq的方法进行初定位，将初定位区间定位于2号染色体约1.5Mb的区间内，通过两个玉米自交系材料之间的序列多态性开发出Indel标记。并验证Indel标记与玉米高温响应紧密连锁，为鉴定或筛选耐高温玉米或高温响应的分子育种奠定了基础。
本发明提供了一种用于扩增所述分子标记的引物对，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:19(GACCGGCGTATATCTAGTGGTA)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:20(RCCGAGAACAAGCACGATAAACA)所示的反向引物。
在本发明中，所述引物对针对耐高温玉米材料扩增时，得到扩增产物如SEQ IDNO:1所示，而对高温敏感玉米材料扩增时，得到扩增产物如SEQ ID NO:31所示。因此，采用所述引物对可区分或鉴定出耐高温玉米材料。
本发明提供了一种用于检测具有耐高温性状玉米的试剂盒，包括所述引物对和核酸扩增试剂。
在本发明中，所述核酸扩增试剂优选包括PCR扩增试剂。本发明对所述PCR扩增试剂没有特殊限制，采用本领域所熟知的PCR扩增试剂即可。
本发明提供了所述分子标记、所述引物对或所述试剂盒在筛选和/或鉴定具有耐高温性状的玉米中的应用。
在本发明中，所述筛选和/或鉴定具有耐高温性状的玉米的方法，优选包括以下步骤：
提取待测玉米样本的基因组DNA；
将所述基因组DNA为模板，用上述方案中引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
对所述PCR扩增产物检测，根据检测结果判断样本是否为耐高温性状。
在本发明中，所述对所述PCR扩增产物检测的方法优选包括电泳分析和测序。当根据电泳分析结果进行判断时，获得587bp条带的样本为耐高温玉米材料，而获得405bp条带的样本为高温敏感玉米材料。当根据测序结果判断，得到扩增产物如SEQ ID NO:1所示，说明样本为耐高温玉米材料；而得到扩增产物如SEQ ID NO:31所示时，说明样本为高温敏感玉米材料。
在本发明中，所述PCR扩增的反应条件优选为16μL：2×PCR Mix8μL、DNA模板1μL、正向引物(10μM)1μL、反向引物(10μM)1μL、ddH2O5μL。所述PCR扩增的反应程序为预变性95℃5min；变性95℃30sec28～35个循环；退火56℃30sec，延伸72℃30sec～1min；72℃5～10min。单株基因型检测采用琼脂糖凝胶电泳。
本发明提供了所述分子标记、所述引物对或所述试剂盒在耐高温玉米辅助选择育种中的应用。
在本发明中，所述应用中，利用上述筛选和/或鉴定具有耐高温性状的玉米的方法得到具有耐高温性状的玉米，以此作为育种材料进行育种或利用上述筛选和/或鉴定具有耐高温性状的玉米的方法来筛选中间材料，以筛选得到的耐高温玉米材料进行后续育种中。
在本发明中，所述耐高温中高温优选是指不低于28℃的气温，更优选为30～37℃。
下面结合实施例对本发明提供的一种与玉米高温响应性状紧密连锁的分子标记及其扩增引物和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
wil2突变体的分离和形态检测
1)从田间发现一株自然突变体wil2，其背景为自交系W22，田间表现为当气温超过28℃后，叶片萎蔫变黄，随着温度升高，症状加重(图1中A、B)。
2)对突变体和野生型同时分别测定叶片中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量。叶绿素含量的测定方法：植株生长至5-6叶期，突变体萎蔫叶片在水分充足，温度较低条件下恢复，取最上一片展开叶进行叶片色素含量测定，每个材料挑选10个独立单株叶片，每个叶片重复测3次。用剪刀将叶片剪成3mm左右宽的小块，准确称取100mg，并放入装有10ml95％乙醇提取液的离心管中，置于黑暗条件下直接浸提12h。用移液枪吸取1ml叶绿体色素提取液于比色皿内，以95％乙醇水溶液为空白对照，用UV-1700Pharmaspec型紫外可见分光光度计(Shimadzu，Japan)在波长470nm、649nm665nm下测定吸光值。最后将实验测量结果利用公式I计算得到野生型和突变体的叶片中各色素的含量。
色素含量(mg/g.FW)＝(叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数)/样品鲜重 公式I
计算结果如下：叶绿素a(Chl.a,mg/g.FW)，叶绿素b(Chl.b,mg/g.FW)和类胡萝卜素(Car.,mg/g.FW)浓度：Chl.a＝13.95A665-6.88A649；Chl.b＝24.96A649-7.32A665；CX-C＝(1000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245，其中Ca、Cb和CX-C分别代表叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素浓度。
叶片叶绿素表型结果见图1中C，结果表明：突变体叶色变黄、穗位以上叶片比穗位以下叶片萎蔫更严重且色素含量明显减少。
3)叶片失水速率测定方法：在3叶1心时期分别取下野生型和突变体不同植株的最上一片展开叶称量鲜重，实验设置10个生物学重复。将叶片放在干净的实验台面上，在室温环境下每隔1h称重一次，共称重13次。按照公式II计算叶片失水速率。
叶片失水速率＝(WS-Wt)/WS。WS:起始叶片鲜重；Wt：处理t小时后叶片鲜重 公式II
与野生型材料相比，突变体wil2叶片失水速率加快(图1中D)。
4)气孔形态数目观察：取突变体与野生型的叶片材料，按照扫描电子显微镜(SeElectronMicroscope,SEM)材料处理方法，对固定好的样品进行脱水、干燥和哧处理。处理后用扫描电子显微镜成像并拍摄照片。本次实验材料处理和成像华中农业大学电镜平台中心完成。
与野生型材料相比，突变体wil2气孔数目和密度没有显著差异(图1中E-G)。
实施例2
突变体wil2和已知参考基因组的自交系B73进行杂交，获得F1，通过观察，F1的表型都和B73一致，没有表现出wil2的表型，表明该突变为一个隐性突变；将F1自交，获得F2分离群体，共包含148株野生型植株和41株突变体植株，通过卡方检验发现野生型与突变体的分离比符合3:1(χ2c＝0.8566<χ20.05,1＝3.84)，表明该突变体是受单个核隐性基因控制的(表1)。
表1 wil2遗传分析
实施例3
wil2基因的精细定位
突变基因定位所用的群体为突变体wil2与B73杂交获得的F2分离群体。当表型出现后，从F2群体中分别选择30株野生型单株和30株；突变型单株，分别构建突变和野生型两个混合样品池并抽提RNA，进行转录组测序；测序的数据通过贝叶斯统计分析的方法，将突变基因初步定位在玉米第二染色体上约1.5Mb的区间内(图2中A)。
通过一个含有1000个单株的群体对BSR-Seq的结果进行验证并进行精细定位。在第二染色体BSR-seq初定位区间内共开发了14对多态性标记，为验证标记的可靠性，分别用14对标记对B73与W22自交系的DNA进行PCR扩增，若标记在两种不同的背景材料中扩增出的条带可以直观的通过琼脂糖电泳分别出来，则认为该标记可用。其中PCR扩增的反应条件优选为16μL：2×PCR Mix8μL、DNA模板1μL、正向引物(10μM)1μL、反向引物(10μM)1μL、ddH2O5μL。所述PCR扩增的反应程序为预变性95℃5min；变性95℃30sec28～35个循环；退火56℃30sec，延伸72℃30sec～1min；72℃5～10min。单株基因型检测采用琼脂糖凝胶电泳。
通过统计不同标记扩增F2分离群体中的交换率，结合植株高温萎蔫的表型，将突变位点定位在第二染色体标记BW1与1787-1间约823kb区间内，该区间内共含有21个候选基因(图2中B)。
为了更进一步精细化定位突变位点，将位于823kb区间内的多态性标记扩增实施例2中F2分离群体，同样根据扩增条带结果结合植株耐高温表型，其中wiR35-F/R对应的分子标记能够紧密连锁耐高温性状。
表1本发明开发的14对多态性分子标记扩增引物
实施例4
Indel分子标记的应用
为进一步验证实施例3筛选的分子标记的作用，用引物wiR35-F/R筛选了B73、W22以及B104三种背景的玉米自交系材料，扩增方法同实施例3记载。通过切取籽粒部分胚乳的方式，利用碱煮法提取DNA，用这对扩增Indel标记引物wiR35-F/R进行PCR扩增反应，将筛选后的籽粒于大田中种植，标记筛选到的籽粒设置为实验组，标记未筛选到的籽粒设置为对照组，观察表型与检测结果是否一致。大田位于武汉市华中农业大学校内基地，田间温度为26℃～32℃左右。种植3组重复，每组重复为2行，行长为3m，行间距为60cm，株距为30cm，每行均匀种植12个单株，实施正常的田间管理。当植株生长到七叶一心期时考察是否出现叶片萎蔫表型，以及是否与鉴定结果相匹配。
碱煮法提取玉米籽粒DNA：切取玉米籽粒胚乳部分放于PCR板中，加入0.1M的NaOH40微升，盖橡皮盖，PCR仪中碱煮。PCR程序为：100℃10min；20℃1min；Lid105℃。煮好后取出，离心。加入与NaOH等体积的Tris-HCl(pH＝2)，离心混匀后即可作为PCR扩增的DNA模板。
其中，不同背景的材料扩增结果见图3中A，其中自交系W22、B104扩增所述Indel分子标记，扩增片段如下：
GACCGGCGTATATCTAGTGGTAATTCGCATGAGGCCGAGGGAGAGACGAGAGACAGAAGCGGAGGGAACCGGCCCGGTCATCTTTCCTTGGCAACCAAGGCAGTGAAGGGAACCTCAACCTGCAGCGTGGGCCCAGCTGTCTAAACACTAAGGCCATGTTCCAATCTCGTGAGATAAACTTTAGCAGCTTTTTTTAGCTACTTTTAGCCATTTGTAATCTAAACAAGAGAGCTAATGGTGGTAATTGAAACTAAACTTTAGCACTTCAACTCATATAGCTAAAGTTTAGCAGGAAGCTAAAGTTTATCCCGTGAGATTGAAACGGGGCCTAACTAGTACTGCTCCTAGGCTTCCCTTTTCTCTCCGCGGCGTTCGCGTTGGATTTGGGGTTGCTTCCCCGCTTCTGGATGGCCAGGCCACCGCACGCCGTTGCAATGCTTGTCGGGCGGCGGGGGCTCTGCTAGATTTTTTGACGCGGGCTTACACCCGCGTCGCGCGGCCGCCGCAACGGACCTGGCTCGCCACACGTGGGCGCCAACGAGGGCTGGCTGGCCTGGCTTTGTTTTGTTTATCGTGCTTGTTCTCGG(SEQ ID NO:1)。
自交系B73、B73、W22、B104的扩增结果不含所述Indel分子标记，具体扩增片段如下：
GACCGGCGTATATCTAGTGGTAATTCGCATGAGGCCGAGGGAGAGACGAGAGACAGAAGCGGAGGGAACCGGACCGGTCATCTTTCCTTGGCAACCAAGGCAGTGAAGGGAACCTCAACCTGCAGCGTGGGCCCAGCTGTCTAAACACTAACTAGTACTGCTCCTAGGCTTCCCTTTTCTCTCCGCGGCGTTCGCGTTGGATTTGGGGTTGCTTCCCCGCTTCTGGATGGCCAGGCCACCGCACGCCGTTGCAATGCTTGTCGGGCGGCGGCGGCTCTGCTAGATTTTTTGACGCGGGCTACACCCGCGTCGCGCGGCCGCCGCAACGGACCTGGCTCGCCACACGTGGGCGCCAACGAGGGCTGGCTGGCCTGGCTTTGTTTTGTTTATCGTGCTTGTTCTCGG(SEQ ID NO:2)。
大田种植中，自交系B73、B73、W22、B104材料出现叶片萎蔫干枯、植株矮小，而自交系W22、B104材料生长势良好、表现出明显的耐高温的表型(图3中B)，进一步验证该标记能够鉴定耐高温材料，在玉米高温响应分子育种中具有应用价值。
实施例5
为了支持采用Indel标记引物wiR35-F/R能够准确筛选耐高温响应玉米材料，选用来自各种不同背景下未知的24粒玉米籽粒为样品，切取部分胚乳，碱煮法提取籽粒DNA，用Indel标记引物wiR35-F/R进行PCR扩增(图4中A)，后将24颗籽粒播种于大田中，标记筛选到的籽粒设置为实验组(图4中B左)，标记未筛选到的籽粒设置为对照组(图4中B右)，于七叶一心期观察表型，考察该分子标记检测的准确性。大田检测结果如图4中B所示，可以证明该Indel标记引物wiR35-F/R能够较为准确筛选耐高温响应玉米材料。检测结果匹配度可以达到80％以上。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种与玉米高温响应性状紧密连锁的分子标记、用于扩增所述分子标记的引物对或检测具有耐高温性状玉米的试剂盒在筛选和/或鉴定具有耐高温性状的玉米中的应用，所述分子标记为核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的Indel分子标记；
所述引物对由核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO:20所示的反向引物组成；
所述试剂盒包括所述引物对和核酸扩增试剂。
2.一种与玉米高温响应性状紧密连锁的分子标记、用于扩增所述分子标记的引物对或检测具有耐高温性状玉米的试剂盒在耐高温玉米辅助选择育种中的应用，所述分子标记为核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的Indel分子标记；
所述引物对由核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO:20所示的反向引物组成；
所述试剂盒包括所述引物对和核酸扩增试剂。
3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述耐高温中高温是指不低于28℃的气温。
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