CN107653337A - 用于检测水稻als基因发生snp突变的kasp标记引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测水稻ALS基因中Ser627Asn和Val643Met同时发生SNP突变的KASP标记引物，针对水稻ALS基因中Ser627Asn和Val643Met同时发生的SNP突变，在以双突变ALS基因表型为标记性状时，该双突变ALS基因序列为全新未见报道的基因序列，能够先初步通过抗除草剂表型锁定所标记材料，再通过基因内部双KASP标记精准确定被标记水稻材料，可快速、高准确率、高通量鉴定水稻抗乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂。KASP标记引物用于分子标记辅助选育具有除草剂抗性的杂交稻品种时，两对KASP标记的结果相互验证，以便更有效率地通过喷施除草剂除掉不育系“打摆子”自交来的种苗。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传技术领域，尤其涉及一种用于检测水稻ALS基因发生SNP突变的KASP标记引物及其应用。
背景技术
随着我国社会、经济的发展，水稻种植大户普遍采用轻简栽培技术，而直播技术因省工节本增效更受青睐，应用面积逐年增加。两系法杂交水稻是我国原始的创新技术，由于配组自由容易选配到强优势，育种程序简化等优点，在我国长江中下游发展迅速，播种面积已超过“三系法”杂交水稻；但两系不育系常因异常低温导致“打摆子”而带来的制种失败或者降低种子纯度的问题时有发生。现有技术中采用培育具有除草剂抗性的杂交稻品种(品系)的方式，既可以通过喷施除草剂除掉不育系“打摆子”自交来的种苗，又可满足水稻现代化生产方式的需求；另外除草剂抗性还可作为一种标记性状，用于区分被标记品系与非标记品系。然而具有除草剂抗性的植物及其起决定性的物质(如蛋白、基因等)依赖长期筛选，并且凭借一些运气才能获得，培育周期长，成本高，效率低，准确率低。
我们前期通过EMS诱变华航31种子，已获得若干抗乙酰乳酸合成酶(AcetolactateSynthase，ALS)抑制剂类除草剂的突变体，通过测序分析，发现有三种类型的ALS基因突变，分别是乙酰乳酸合成酶氨基酸序列中Ala179与Gly628单独突变以及Ser627和Val643同时突变。其中，Ser627和Val643同时突变是在同一基因内部两个仅相差16个氨基酸的位点同时突变，产生了一个全新的ALS蛋白。Ser627和Val643同时突变时，突变型乙酰乳酸合成酶对咪唑啉酮类除草剂不敏感，使得水稻具有除草剂抗性。该抗除草剂的突变体将在新型抗除草剂的杂交稻品种选育上具有重要的应用价值，为此急需开发一种高通量，高准确性的分子标记，用于该材料的后续杂交转育的辅助选择，培育出适应现代化生产方式的优质水稻品系。同时该水稻品系与其相应的分子标记相结合，能够解决现阶段杂交水稻种子纯度鉴定以及种质资源创新过程中的一些问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种快速、高准确率、高通量的用于鉴定水稻抗乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂的KASP标记引物及其应用。该KASP标记引物是针对水稻ALS基因中Ser627Asn和Val643Met同时发生的SNP突变而开发的两对基因内部KASP标记引物。
单核苷酸多态性(SNP)标记技术，属于新一代标记技术。SNP是个体间最常见的遗传变异形式，特别是存在基因内部的SNP，是分子标记辅助选择最理想的标记。竞争性等位基因PCR(kompetitive allele specific PCR,KASP)是一种基于荧光检测SNP的技术。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为提供一种用于检测水稻ALS基因中Ser627Asn发生SNP突变的KASP标记引物，所检测的目标基因型包括水稻ALS基因中第1880位G和A，该标记引物包括引物1、引物2和通用引物3；
所述引物1包括第一荧光标签序列、最后一个特定碱基1和位于所述碱基1上游可实现PCR反应的若干碱基，所述最后一个特定碱基1为水稻ALS基因中第1880位A；
所述引物2包括第二荧光标签序列、最后一个特定碱基2和位于所述碱基2上游可实现PCR反应的若干碱基，所述最后一个特定碱基2为水稻ALS基因中第1880位G。
优选的，所述引物1包括SEQ ID No：1所示包含第一荧光标签序列的核苷酸序列，所述引物2包括SEQ ID No：2所示包含所述第二荧光标签序列的核苷酸序列，所述引物3包括SEQ ID No：3所示的核苷酸序列。
基于一个总的技术构思，本发明还提供一种用于检测水稻ALS基因中Val643Met发生SNP突变的KASP标记引物，所检测的目标基因型包括水稻ALS基因中第1927位G和A，该标记引物包括引物4、引物5和通用引物6；
所述引物4包括第一荧光标签序列、最后一个特定碱基3和位于所述碱基3上游可实现PCR反应的若干碱基，所述最后一个特定碱基3为水稻ALS基因中第1927位A；
所述引物5包括第二荧光标签序列、最后一个特定碱基4和位于所述碱基4上游可实现PCR反应的若干碱基，所述最后一个特定碱基4为水稻ALS基因中第1927位G。
优选的，所述引物4包括SEQ ID No：4所示包含第一荧光标签序列的核苷酸序列，所述引物5包括SEQ ID No：5所示包含第二荧光标签序列的核苷酸序列，所述引物6包括SEQID No：6所示的核苷酸序列。
基于一个总的技术构思，本发明还提供一种用于检测水稻ALS基因中Ser627Asn和Val643Met同时发生SNP突变的KASP标记引物，所检测的目标基因型包括水稻ALS基因中第1880位G和A，以及第1927位G和A，该标记引物包括上述的用于检测水稻ALS基因中Ser627Asn发生SNP突变的KASP标记引物和上述的用于检测水稻ALS基因中Val643Met发生SNP突变的KASP标记引物。
上述的KASP标记引物，优选的，所述第一荧光标签序列为FAM荧光标签序列，所述FAM荧光标签序列为SEQ ID No：1或SEQ ID No：4所示第1-21位；所述第二荧光标签序列为HEX荧光标签序列，所述HEX荧光标签序列为SEQ ID No：2或SEQ ID No：5所示第1-21位。
优选的，所述可实现PCR反应的若干碱基数量不低于10个。
本发明的KASP标记引物，在以双突变ALS基因表型为标记性状时，该双突变ALS基因序列为全新未见报道的基因序列，能够先初步通过抗除草剂表型锁定所标记材料，再通过基因内部双KASP标记精准确定被标记水稻材料，可快速、高准确率、高通量鉴定水稻抗乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂。
基于一个总的技术构思，本发明还提供一种KASP标记引物在对水稻ALS基因中Ser627Asn和Val643Met同时发生SNP突变时进行鉴定分型中的应用，包括如下步骤：
(1)提取待测水稻的样本DNA作为模板，配制包含有所述KASP标记引物的特异KASPAssay mix；
(2)将由所述步骤(1)提取的DNA模板加入到PCR微孔反应板中，再加入特异KASPAssay mix和通用KASPMaster mix，进行PCR扩增；
(3)将所述步骤(2)后得到的PCR扩增产物进行荧光信号扫描，分析，得到PCR扩增产物的散点图和荧光值，统计基因分型情况，若只检测到所述第一荧光信号则表明该样本为纯合双突变ALS基因，若同时检测到第一荧光信号和第二荧光信号则表明该样本为ALS基因突变型与野生型的杂合子，若只检测到第一荧光信号则表明该样本为纯合野生型。若所述PCR扩增产物出现在散点图的原点附近则表明该样本在DNA提取或者KASP反应过程中出现了问题。
上述应用进行鉴定的时候，每个反应孔采用双色荧光(特别优选是FAM荧光和HEX荧光)检测样本某一位点可能的两种基因型，通过借助KASP技术应用于本发明特定的水稻基因型突变鉴定过程中，具有高通量、低成本、简单快捷以及低错误率等优点，在作物分子标记辅助育种中也具有重要的作用。本发明用KASP标记引物对水稻ALS基因突变型Ser627Asn和Val643Met进行分型，两对KASP标记的结果，相互验证，以避免实验过程中的误差，达到更高的分型效率和准确率。
基于一个总的技术构思，本发明还提供一种KASP标记引物在选育抗除草剂水稻品系的应用，包括如下步骤：
a.提取待测水稻的样本DNA作为模板，配制包含有所述KASP标记引物的特异KASPAssay mix；
b.将由所述步骤a提取的DNA模板加入到PCR微孔反应板中，再加入特异KASPAssaymix和通用KASP Master mix，进行PCR扩增；
c.将所述步骤b后得到的PCR扩增产物进行荧光信号扫描，分析，得到PCR扩增产物的散点图和荧光值，统计基因分型情况，若只检测到第一荧光信号则表明该样本为纯合双突变ALS基因，若同时检测到第一荧光信号和第二荧光信号则表明该样本为ALS基因突变型与野生型的杂合子，若只检测到第二荧光信号则表明该样本为纯合野生型，若所述PCR扩增产物出现在散点图的原点附近则表明该样本在DNA提取或者KASP反应过程中出现了问题；
d.从所述步骤c得到的分型结果中选择含有纯合双突变ALS基因的水稻单株，根据育种的需要进行回交或者自交，得到所述的抗除草剂水稻品系。
基于一个总的技术构思，本发明还提供一种KASP标记引物在提高杂交水稻种子纯度的应用，包括如下步骤：
A.提取待测水稻的样本DNA作为模板，配制包含有所述KASP标记引物的特异KASPAssay mix；
B.将由所述步骤A提取的DNA模板加入到PCR微孔反应板中，再加入特异KASPAssaymix和通用KASP Master mix，进行PCR扩增；
C.将所述步骤B后得到的PCR扩增产物进行荧光信号扫描，分析，得到PCR扩增产物的散点图和荧光值，统计基因分型情况，若只检测到第一荧光信号则表明该样本为纯合双突变ALS基因，若同时检测到第一荧光信号和第二荧光信号则表明该样本为ALS基因突变型与野生型的杂合子，若只检测到第二荧光信号则表明该样本为纯合野生型，若所述PCR扩增产物出现在散点图的原点附近则表明该样本在DNA提取或者KASP反应过程中出现了问题；
D.根据所述步骤C得到的分型结果统计杂交水稻种子的纯度，若杂合子的水稻杂交种种子数量占比未达到设定标准，则通过田间喷施除草剂除杂；若杂合子的水稻杂交种种子数量占比达到设定标准，则纯度达标。
两系不育系常因异常低温导致“打摆子”而带来的制种失败或者降低种子纯度问题时有发生。通常将除草剂抗性转育到两系恢复系材料中，在杂交种苗期通过喷施除草剂去除田间杂草的同时去除不育系自交后代。而提供一种新的策略，可先通过高通量的分型方法，对一批次杂交水稻种子进行纯度鉴定，对种子纯度达到水稻杂交种国家质量标准GB4404.1-2008要求的，就不需要通过除草剂除杂。结果分析时，统计最后杂合状态的杂交种种子是否到达国标要求的96％。若未达到，再通过田间喷施除草剂除去假杂种。
用于分子标记辅助选育具有除草剂抗性的杂交稻品种(品系)时，两对KASP标记的结果，相互验证，以避免实验过程中的误差，达到更高的准确率，以便更有效率地通过喷施除草剂除掉不育系“打摆子”自交来的种苗，满足水稻现代化生产方式的需求。
基于一个总的技术构思，本发明还提供一种KASP标记引物在水稻诱变育种的应用，包括如下步骤：
1)提取待测水稻的样本DNA作为模板，配制包含有所述KASP标记引物的特异KASPAssay mix；
2)将由所述步骤1)提取的DNA模板加入到PCR微孔反应板中，再加入特异KASPAssay mix和通用KASP Master mix，进行PCR扩增；
3)将所述步骤2)后得到的PCR扩增产物进行荧光信号扫描，分析，得到PCR扩增产物的散点图和荧光值，统计基因分型情况，若只检测到第一荧光信号则表明该样本为纯合双突变ALS基因，若同时检测到第一荧光信号和第二荧光信号则表明该样本为ALS基因突变型与野生型的杂合子，若只检测到第二荧光信号则表明该样本为纯合野生型，若所述PCR扩增产物出现在散点图的原点附近则表明该样本在DNA提取或者KASP反应过程中出现了问题；
4)从所述步骤3)得到的分型结果中选择含有纯合双突变ALS基因的水稻种子进行诱变，产生诱变第一代和诱变第二代，在所述诱变第二代中选择表型上相对野生型有区别的变异单株，取其叶片DNA作为模板再次进行PCR扩增和基因分型统计，以确认突变体是否为本次诱变过程中产生的真突变。
上述的应用，优选的，所述诱变为物理诱变或化学诱变。
上述的各项应用过程中，优选的，所述PCR扩增及进行荧光信号扫描的具体操作依次包括：第一步预变性94℃15min；第二步变性、复性、延伸，94℃20s、从61℃-55℃60s，共10个循环，每个循环下降0.6℃；第三步变性、复性、延伸，94℃20s、55℃60s，共26个循环；第四步，37℃1min扫描荧光分析数据。
除草剂抗性作为一种标记性状，用于区分被标记品系与非标记品系，在杂交水稻种子纯度鉴定以及种子诱变种质资源创新上都具有重要意义。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的KASP标记引物，针对水稻ALS基因中Ser627Asn和Val643Met同时发生的SNP突变，在以双突变ALS基因表型为标记性状时，该双突变ALS基因序列为全新未见报道的基因序列，能够先初步通过抗除草剂表型锁定所标记材料，再通过基因内部双KASP标记精准确定被标记水稻材料，可快速、高准确率、高通量鉴定水稻抗乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂。
2、本发明的KASP标记引物，用于分子标记辅助选育具有除草剂抗性的杂交稻品种(品系)时，两对KASP标记的结果，相互验证，以避免实验过程中的误差，达到更高的准确率，以便更有效率地通过喷施除草剂除掉不育系“打摆子”自交来的种苗，满足水稻现代化生产方式的需求；另外除草剂抗性还可作为一种标记性状，用于区分被标记品系与非标记品系，在杂交水稻种子纯度鉴定以及种子诱变种质资源创新上都具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例中FAM荧光值的散点图。
图2是实施例中HEX荧光值的散点图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例：
一种本发明针对水稻ALS基因中双SNP突变(造成氨基酸序列Ser627Asn和Val643Met的改变)的KASP引物，如表1所示。
表1：本发明的KASP引物
上述标记K-ALS627和K-ALS643中，PrimerX分别连接FAM荧光标签序列(下划线部分为FAM荧光标签序列)，PrimerY分别连接HEX荧光标签序列(下划线部分为HEX荧光标签序列)，PrimerC为通用引物。
所述引物1包括SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，所述引物2包括SEQ ID No：2所示的核苷酸序列，所述引物3包括SEQ ID No：3所示的核苷酸序列；所述引物4包括SEQ ID No：4所示的核苷酸序列，所述引物5包括SEQ ID No：5所示的核苷酸序列，所述引物6包括SEQID No：6所示的核苷酸序列。所述荧光标签序列还可以采用其他本领域通用的荧光标签序列。
本发明的KASP标记引物，针对水稻ALS基因中Ser627Asn和Val643Met同时发生的SNP突变，在以双突变ALS基因表型为标记性状时，该双突变ALS基因序列为全新未见报道的基因序列，能够先初步通过抗除草剂表型锁定所标记材料，再通过基因内部双KASP标记精准确定被标记水稻材料，可快速、高准确率、高通量鉴定水稻抗乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂。
本实施例的KASP标记引物在对水稻ALS基因中Ser627Asn和Val643Met同时发生SNP突变时进行鉴定分型中的应用，包括如下步骤：
(1)采用CTAB法，从水稻叶片中提取DNA样本：取适量水稻叶片0.4g装入2ml离心管中，加入钢珠用液氮速冻后，放入高通量组织研磨器(宁波新芝Scientz-48)破碎组织，再加入65℃预热的2×CTAB溶液650ml，置于65℃水浴锅中恒温45min，每10min上下颠倒混匀一次，冷却至室温后置于通风橱并加入650ul氯仿:异戊醇(24:1)的溶液彻底混匀，然后用12000rmp离心10min，吸取上清约500ul转入新的1.5ml离心管中，加入等体积(500ul)异丙醇溶液混匀并于-20℃沉淀2h，用12000rmp离心10min后弃上清，再加入1ml 70％乙醇溶液后清洗沉淀，12000rmp离心5min后去上清，加入200ul ddH2O过夜溶解，得到提取的DNA模板；配制包含有所述引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6在内的特异KASPAssay mix；
(2)采用本实施例的KASP标记引物对上述提取得到的DNA进行基因分型：基因分型实验在Roche LightCycler480(实时荧光定量PCR系统)中运行，在96孔PCR微孔反应板中加入10ul反应体系，所述反应体系包括：所述步骤(1)提取得到的DNA模板1ul(20-30ng/ul)、KASPAssay mix(LGC公司，KBS-2100-100-OLI)0.14ul、KASP Master mix(LGC公司，KBS-1016-016)5ul，再加水补齐10ul终体系，进行PCR扩增；
(3)PCR运行程序以及荧光扫描：第一步预变性94℃15min；第二步变性、复性、延伸，94℃20s、从61℃-55℃(每个循环下降0.6℃)60s，共10个循环；第三步变性、复性、延伸，94℃20s、55℃60s，共26个循环；第四步，37℃1min扫描荧光分析数据，通过RocheLightCycler480仪器对PCR扩增产物进行荧光信号扫描，并且将扫描到的荧光信号进行分析，分析得到的结果转化为基因分型的散点图和荧光值；分析得到每一个PCR扩增产物的散点图和FAM/HEX荧光值，仪器对这些荧光值处理生成了图1、图2散点图以及散点图每一点对应96孔板中样品产物荧光图，散点图中每一点代表相对应一个样品的荧光值，纵坐标表示HEX荧光值(533nm-580nm)，横坐标表示FAM荧光值(465nm-510nm)。
如图1、2所示，绿色散点是在96孔板中仅检测到HEX荧光的样品，表明这些样品中ALS蛋白中第627位氨基酸为野生型Ser、第643位氨基酸为野生型Val；红色散点是在96孔板中既检测到FAM荧光又检测到HEX荧光的样品，表明这些样品中ALS蛋白第627、643位氨基酸均为杂合状态；蓝色散点是在96孔板中仅检测到FAM荧光，表明这些样品中ALS蛋白第627位氨基酸为突变型Asn、第643位氨基酸为突变型Met；灰色的散点为本次实验的阴性对照，在图2中出现了一个因为人为因素造成的实验误差。
通过对图1、图2对比表明K-ALS627、K-ALS643两对KASP标记，完全能对ALS基因内部双突变SNP位点(Ser627Asn和Val643Met)进行精准地高通量分型，且两对标记的分型结果能够相互印证、相互补充，最大程度确保分子标记辅助选择以及其他以该突变基因为标记性状实验的准确性。
本实施例的KASP标记引物在选育抗除草剂水稻品系的应用，包括如下步骤：将上述鉴定分型应用步骤(3)后得到的分型结果中选择含有纯合双突变ALS基因的水稻单株，根据育种的需要进行回交或者自交，得到所述的抗除草剂水稻品系。
两系不育系常因异常低温导致“打摆子”而带来的制种失败或者降低种子纯度问题时有发生。通常将除草剂抗性转育到两系恢复系材料中，在杂交种苗期通过喷施除草剂去除田间杂草的同时去除不育系自交后代。而提供一种新的策略，可先通过高通量的分型方法，对一批次杂交水稻种子进行纯度鉴定，对种子纯度达到水稻杂交种国家质量标准GB4404.1-2008要求的，就不需要通过除草剂除杂。根据上述步骤c中得到的分型结果统计杂交水稻种子的纯度，若杂合子的水稻杂交种种子数量占比未达到96％，就需要通过田间喷施除草剂除杂；若杂合子的水稻杂交种种子数量占比达到96％，就不需要通过田间喷施除草剂除杂。
本实施例的KASP标记引物在水稻诱变育种的应用，用KASP标记检测亲本材料ALS基因内部双位点SNP，确保诱变前种子的纯度，以及诱变后突变体材料的真假，具体包括如下步骤：
1)以含有ALS基因双位点突变的遗传稳定水稻品系进行诱变育种，首先在该品系群体中按单株编号取叶片，分别提取DNA作为模板；
2)向所述步骤A提取的DNA模板中加入特异的KASPAssay mix和通用的KASPMaster mix加入到含有DNA样本的PCR微孔反应板中，进行PCR扩增；
3)将所述步骤B后得到的PCR扩增产物进行荧光信号扫描，结果分析时，得到PCR扩增产物的散点图和荧光值，统计基因分型情况，只收取两对KASP标记分型结果都处于FAM荧光处的样品种子，作为待诱变的种子(散点图中都位于FAM荧光处的样品为含有纯合ALS基因双位点突变的待诱变单株；散点图中都位于FAM与HEX中间的样品为ALS基因突变型与野生型的杂合体，说明该样品为上一代串粉的F1后代；散点图都位于HEX处的样品，ALS基因为野生型，说明该样品为田间杂株)；
4)经诱变处理产生的诱变第一代，以M1表示，M1代不进行选择，在M2代进行选择，选择表型上相对野生型有变化的变异单株，编号取叶片，提取DNA后再次进行PCR扩增进和荧光信号扫描，结果分析时，得到PCR扩增产物的散点图和荧光值，统计基因分型情况，选择含有纯合双突变ALS基因的水稻单株(散点图同时显示FAM处的样品为来自本次诱变过程中产生的突变体；两对标记分型后的散点图同时显示位于FAM与HEX中间处的样品，为诱变材料在M1代串粉的杂种F1；两对标记分型后的散点图同时显示处于HEX处的样品，为田间的杂株)，确认突变体为本次诱变过程中产生的真突变之后，由于其遗传背景基本上与诱变之前的原始材料一致，所以只需与原始材料进行回交，然后通过Mutmap(简单快速高效的混池测序基因定位方法)等测序的方法，进行快速精准的基因定位。
在此之前，杂交稻种子的纯度，主要通过田间小区种植以及DNA指纹图谱技术进行鉴定。前者，受环境的影响较大，且鉴定时间长；后者，则需要开发较多的SSR标记，且每一个样品都需要所有开发的标记鉴定，工作量较大。对于诱变育种中鉴定突变体真假，也只能通过DNA指纹图谱技术以及田间的表型鉴定，同样存在上述缺点。更为严重的是，由于存在水稻遗传背景相近的缘故，通过上述两种传统方法，很可能得到的不准确的结果。
而本发明的KASP标记引物，针对水稻ALS基因中Ser627Asn和Val643Met同时发生的SNP突变，在以双突变ALS基因表型为标记性状时，该双突变ALS基因序列为全新未见报道的基因序列，能够先初步通过抗除草剂表型锁定所标记材料，再通过基因内部双KASP标记精准确定被标记水稻材料，可快速、高准确率、高通量鉴定水稻抗乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂。另外，KASP标记引物用于分子标记辅助选育具有除草剂抗性的杂交稻品种(品系)时，两对KASP标记的结果，相互验证，以避免实验过程中的误差，达到更高的准确率，以便更有效率地通过喷施除草剂除掉不育系“打摆子”自交来的种苗，满足水稻现代化生产方式的需求；另外除草剂抗性还可作为一种标记性状，用于区分被标记品系与非标记品系，在杂交水稻种子纯度鉴定以及种子诱变种质资源创新上都具有重要意义。
序列表
<110> 湖南杂交水稻研究中心
<120> 用于检测水稻ALS基因发生SNP突变的KASP标记引物及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tcatgtgctg cctatgatcc caaa 44
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tcatgtgctg cctatgatcc caag 44
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccatccag gatcatgtcc ttgaa 25
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc tggatggtga tggcaggact a 41
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat tggatggtga tggcaggact g 41
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtgctttgc caacatacag attatagat 29
Claims (10)
1.一种用于检测水稻ALS基因中Ser627Asn发生SNP突变的KASP标记引物，其特征在于，所检测的目标基因型包括水稻ALS基因中第1880位G和A，该标记引物包括引物1、引物2和通用引物3；
所述引物1包括第一荧光标签序列、最后一个特定碱基1和位于所述碱基1上游可实现PCR反应的若干碱基，所述最后一个特定碱基1为水稻ALS基因中第1880位A；
所述引物2包括第二荧光标签序列、最后一个特定碱基2和位于所述碱基2上游可实现PCR反应的若干碱基，所述最后一个特定碱基2为水稻ALS基因中第1880位G。
2.一种用于检测水稻ALS基因中Val643Met发生SNP突变的KASP标记引物，其特征在于，所检测的目标基因型包括水稻ALS基因中第1927位G和A，该标记引物包括引物4、引物5和通用引物6；
所述引物4包括第一荧光标签序列、最后一个特定碱基3和位于所述碱基3上游可实现PCR反应的若干碱基，所述最后一个特定碱基3为水稻ALS基因中第1927位A；
所述引物5包括第二荧光标签序列、最后一个特定碱基4和位于所述碱基4上游可实现PCR反应的若干碱基，所述最后一个特定碱基4为水稻ALS基因中第1927位G。
3.一种用于检测水稻ALS基因中Ser627Asn和Val643Met同时发生SNP突变的KASP标记引物，其特征在于，所检测的目标基因型包括水稻ALS基因中第1880位G和A，以及第1927位G和A，该标记引物包括权利要求1所述的用于检测水稻ALS基因中Ser627Asn发生SNP突变的KASP标记引物和权利要求2所述的用于检测水稻ALS基因中Val643Met发生SNP突变的KASP标记引物。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的KASP标记引物，其特征在于，所述第一荧光标签序列为FAM荧光标签序列，所述FAM荧光标签序列为SEQ ID No：1或SEQ ID No：4所示第1-21位；所述第二荧光标签序列为HEX荧光标签序列，所述HEX荧光标签序列为SEQ ID No：2或SEQ ID No：5所示第1-21位。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的KASP标记引物，其特征在于，所述可实现PCR反应的若干碱基数量不低于10个。
6.一种如权利要求3-5中任一项所述的KASP标记引物在对水稻ALS基因中Ser627Asn和Val643Met同时发生SNP突变时进行鉴定分型中的应用，包括如下步骤：
(1)提取待测水稻的样本DNA作为模板，配制包含有所述KASP标记引物的特异KASPAssay mix；
(2)将由所述步骤(1)提取的DNA模板加入到PCR微孔反应板中，再加入特异KASP Assaymix和通用KASP Master mix，进行PCR扩增；
(3)将所述步骤(2)后得到的PCR扩增产物进行荧光信号扫描，分析，得到PCR扩增产物的散点图和荧光值，统计基因分型情况，若只检测到所述第一荧光信号则表明该样本为纯合双突变ALS基因，若同时检测到第一荧光信号和第二荧光信号则表明该样本为ALS基因突变型与野生型的杂合子，若只检测到第一荧光信号则表明该样本为纯合野生型。
7.一种如权利要求3-5中任一项所述的KASP标记引物在选育抗除草剂水稻品系的应用，其特征在于，包括如下步骤：
a.提取待测水稻的样本DNA作为模板，配制包含有所述KASP标记引物的特异KASPAssay mix；
b.将由所述步骤a提取的DNA模板加入到PCR微孔反应板中，再加入特异KASP Assaymix和通用KASP Master mix，进行PCR扩增；
c.将所述步骤b后得到的PCR扩增产物进行荧光信号扫描，分析，得到PCR扩增产物的散点图和荧光值，统计基因分型情况，若只检测到第一荧光信号则表明该样本为纯合双突变ALS基因，若同时检测到第一荧光信号和第二荧光信号则表明该样本为ALS基因突变型与野生型的杂合子，若只检测到第二荧光信号则表明该样本为纯合野生型；
d.从所述步骤c得到的分型结果中选择含有纯合双突变ALS基因的水稻单株，根据育种的需要进行回交或者自交，得到所述的抗除草剂水稻品系。
8.一种如权利要求3-5中任一项所述的KASP标记引物在提高杂交水稻种子纯度的应用，其特征在于，包括如下步骤：
A.提取待测水稻的样本DNA作为模板，配制包含有所述KASP标记引物的特异KASPAssay mix；
B.将由所述步骤A提取的DNA模板加入到PCR微孔反应板中，再加入特异KASP Assaymix和通用KASP Master mix，进行PCR扩增；
C.将所述步骤B后得到的PCR扩增产物进行荧光信号扫描，分析，得到PCR扩增产物的散点图和荧光值，统计基因分型情况，若只检测到第一荧光信号则表明该样本为纯合双突变ALS基因，若同时检测到第一荧光信号和第二荧光信号则表明该样本为ALS基因突变型与野生型的杂合子，若只检测到第二荧光信号则表明该样本为纯合野生型；
D.根据所述步骤C得到的分型结果统计杂交水稻种子的纯度，若杂合子的水稻杂交种种子数量占比未达到设定标准，则通过田间喷施除草剂除杂；若杂合子的水稻杂交种种子数量占比达到设定标准，则纯度达标。
9.一种如权利要求3-5中任一项所述的KASP标记引物在水稻诱变育种的应用，其特征在于，包括如下步骤：
1)提取待测水稻的样本DNA作为模板，配制包含有所述KASP标记引物的特异KASPAssay mix；
2)将由所述步骤1)提取的DNA模板加入到PCR微孔反应板中，再加入特异KASP Assaymix和通用KASP Master mix，进行PCR扩增；
3)将所述步骤2)后得到的PCR扩增产物进行荧光信号扫描，分析，得到PCR扩增产物的散点图和荧光值，统计基因分型情况，若只检测到第一荧光信号则表明该样本为纯合双突变ALS基因，若同时检测到第一荧光信号和第二荧光信号则表明该样本为ALS基因突变型与野生型的杂合子，若只检测到第二荧光信号则表明该样本为纯合野生型；
4)从所述步骤3)得到的分型结果中选择含有纯合双突变ALS基因的水稻种子进行诱变，产生诱变第一代和诱变第二代，在所述诱变第二代中选择表型上相对野生型有区别的变异单株，取其叶片DNA作为模板再次进行PCR扩增和基因分型统计，以确认突变体是否为本次诱变过程中产生的真突变；所述诱变为物理诱变或化学诱变。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增及进行荧光信号扫描的具体操作依次包括：第一步预变性94℃15min；第二步变性、复性、延伸，94℃20s、从61℃-55℃60s，共10个循环，每个循环下降0.6℃；第三步变性、复性、延伸，94℃20s、55℃60s，共26个循环；第四步，37℃1min扫描荧光分析数据。
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