CN112063742A - 用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物及应用，由其组成的试剂盒及试剂盒的应用 - Google Patents

用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物及应用，由其组成的试剂盒及试剂盒的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112063742A
CN112063742A CN202010967845.3A CN202010967845A CN112063742A CN 112063742 A CN112063742 A CN 112063742A CN 202010967845 A CN202010967845 A CN 202010967845A CN 112063742 A CN112063742 A CN 112063742A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
kasp
seq
dna sequence
sequence shown
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010967845.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112063742B (zh
Inventor
段美娟
孙志忠
袁定阳
丁佳
余东
盛夏冰
谭炎宁
孙学武
袁贵龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hunan Agricultural University
Hunan Hybrid Rice Research Center
Original Assignee
Hunan Agricultural University
Hunan Hybrid Rice Research Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hunan Agricultural University, Hunan Hybrid Rice Research Center filed Critical Hunan Agricultural University
Priority to CN202010967845.3A priority Critical patent/CN112063742B/zh
Publication of CN112063742A publication Critical patent/CN112063742A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112063742B publication Critical patent/CN112063742B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物及应用，由其组成的试剂盒及试剂盒的应用，KASP标记引物包括K2标记引物和K4标记引物；K2标记引物包括K2A‑F、K2A‑R、K2G‑F K2G‑R；K4标记引物包括K4C‑F、K4C‑R、K4G‑F、K4G‑R。试剂盒包括KASP标记引物和KASP反应混合液。本发明的KASP标记引物，能够快速精准高通量的完成回交转育后代的基因分型，并有效区分抗虫基因的杂合型，可应用于抗虫回交转育群体的基因型鉴定。

Description

用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物及应用，由其组成的试 剂盒及试剂盒的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，尤其涉及一种用于鉴定水稻抗螟虫基因Cry1Ab的KASP标记引物及其应用。
背景技术
螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)作为水稻主要病虫害之一，严重制约着水稻产量。目前，防治螟虫害的主要方式为喷施化学杀虫剂，由此造成的环境污染和食品安全问题日趋严重，同时带来巨大的经济损失。由于在水稻中尚未发现相关抗虫种质资源，无法借助常规育种手段培育抗虫水稻新品种，因此通过转基因技术将外源抗虫基因转入水稻就成为目前唯一、有效的方法。常用于改良水稻抗虫性的外源基因主要有从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)中分离出来的杀虫晶体蛋白(insecticidal crystalprotein，ICP)基因与营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal protein，VIP))基因，从植物中分离出来的蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitor，PI)基因与外源凝集素(lectin)基因。ICP本身不具有生物活性，又称为原毒素(protoxin)。原毒素被靶标昆虫取食后，在昆虫中肠的碱性环境中被降解为有毒的活性肽，并与昆虫中肠道上皮纹缘膜细胞上的特异受体相结合，引起细胞膜穿孔，破坏细胞渗透平衡，最终导致昆虫停止取食而死亡。编码杀虫晶体蛋白ICP的cry基因以其特异性作用于靶标害虫、对人畜安全等优点成为世界上研究最深入、应用最广泛的抗虫基因。国内外第1代转基因植物所用的Bt抗虫基因主要是cry1A类基因，这其中又以cry1Ab、cry1Ac抗虫基因的利用最为广泛。
目前针对抗虫BT基因的检测方法主要有常规PCR和金标试纸条检测法。试纸条法是基于免疫层析原理快速检测材料中是否含BT产物BT-Cry1Ab/Ac蛋白，操作简单、灵敏度高、检测速度快，已在抗虫转BT基因玉米、棉花和水稻等作物中广泛运用。PCR法是针对目标抗虫基因序列设计引物，在不同材料中进行扩增，依据扩增条带的有无进行转基因结果的判断。
在小规模群体检测中，金标试纸条检测法具有操作简单、灵敏度高、检测速度快等特点；常规PCR检测法具有简便易操作的特点，但需经过跑胶鉴定结果，且容易出现PCR产物带假阳性的概率事件上，效果不如金标试纸条法优势明显。但上述两种方法面对高通量大规模群体检测时，就显得力不从心，不仅耗时费力，尤为重要的一点是无法区分转基因回交转育子代中的杂合和纯合基因型单株，这为分子标记选育纯合抗虫株系增加了难度。
随着测序技术和分子生物学的快速发展，第三代标记单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)分子标记，以变异分布广泛，检测快速等优点在基因分型、分子育种等领域大范围应用。现阶段，用于SNP检测的方法主要有凝胶电泳、荧光定量PCR、基因芯片和竞争性等位基因PCR(Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)等。其中KASP基因分型方法是通过计算PCR过程中产生的荧光信号，实现对变异位点的检测，检测结果与表现型一致，检测过程无需电泳，减少了实验操作过程对环境的污染和人体的伤害。KASP基因分型方法具有成本低、通量高、实验操作安全和基因型数据采集准确的优势。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种用于鉴定水稻抗螟虫基因Cry1Ab的KASP标记引物及其应用，本发明的用于鉴定水稻抗螟虫基因Cry1Ab的KASP标记引物，能够快速精准高通量的完成回交转育后代的基因分型，并有效区分抗虫基因的杂合型，为快速精准选育抗虫水稻新品种提供了有利工具。具有成本低、通量高、实验操作安全和基因型数据采集准确的优势。
为了实现上述目的，本发明提供了一种用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物，包括K2标记引物和K4标记引物；
所述K2标记引物包括用于检测转基因位点A的上游引物K2A-F、用于检测转基因位点A的下游引物K2A-R、用于检测非转基因位点G的上游引物K2G-F、用于检测非转基因位点G的下游引物K2G-R，
所述上游引物K2A-F具有SEQ ID NO.1所示的DNA序列，
所述下游引物K2A-R具有SEQ ID NO.2所示的DNA序列，
所述上游引物K2G-F具有SEQ ID NO.3所示的DNA序列，
所述下游引物K2G-R具有SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
所述K4标记引物包括用于检测转基因位点C的上游引物K4C-F、用于检测转基因位点C的下游引物K4C-R、用于检测非转基因位点G的上游引物K4G-F、用于检测非转基因位点G的下游引物K4G-R，
所述上游引物K4C-F具有SEQ ID NO.5所示的DNA序列，
所述下游引物K4C-R具有SEQ ID NO.6所示的DNA序列，
所述上游引物K4G-F具有SEQ ID NO.7所示的DNA序列，
所述下游引物K4G-R具有SEQ ID NO.8所示的DNA序列。
上述的用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物，进一步的，所述K2A-F和所述K4C-F的5’端连接荧光标签序列；所述K2G-F和所述K4G-F的5’端连接另一荧光标签序列。
上述的用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物，进一步的，所述荧光标签序列为FAM或HEX。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物在抗虫回交转育群体的基因型鉴定中的应用。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种试剂盒，包括所述的用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物和KASP反应混合液。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的试剂盒在抗虫回交转育群体的基因型鉴定中的应用。
上述的应用，进一步的，所述应用的方法为：
S1、将待测样品的DNA与试剂盒中的试剂置于微孔反应板中混合获得KASP反应体系；
S2、将所述KASP反应体系进行Touchdown PCR反应获得反应产物；
S3、根据反应产物中的分子标记，进行基因分型。
上述的应用，进一步的，所述S2中所述Touchdown PCR反应具体为：
S2-1、94℃预变性15分钟；
S2-2、94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒；
S2-3、将所述S2-2中变性、退火步骤重复10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；
S2-4、94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒；
S2-5、将所述S2-4中变性、退火步骤重复26个循环获得反应产物。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物，K2和K4能够快速精准高通量的完成回交转育后代的基因分型，并有效区分抗虫基因的杂合型，为快速精准选育抗虫水稻新品种提供了有利工具。
(2)本发明提供了一种用于鉴定Cry1Ab基因的检测试剂盒，检测快速、方便、准确性高，特异性好。
(3)本发明提供了一种用于鉴定Cry1Ab基因的检测试剂盒在抗虫回交转育群体的基因型鉴定中的应用，水稻螟虫抗性改良具有重要的实际生产价值，自然水稻品种中没有抗源存在，只能通过转基因或者转基因供体回交转育来改良品种抗虫性。本发明中涉及的Cry1Ab抗虫基因KASP标记K2和K4能够很好的区分回交转育群体中的杂合和纯合基因型单株，基因型鉴定不需要经过琼脂糖或者丙烯酰胺等跑胶程序，有效降低了实验给人体带来的危害。并且能够在群体较大的基础上精准、快速的获得单株基因型，为后续田间移栽、杂交实验争取了宝贵时间，同时为自交分离大群体的基因型验证提供了有力工具，有益于加快抗虫水稻新品种的回交转育过程。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例3中BT基因试纸条检测效果图。
图2为本发明实施例3中侧翼标记K2检测抗虫回交群体分型效果图。
图3为本发明实施例3中侧翼标记K4检测抗虫回交群体分型效果图。
具体实施方式
以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1：
一种用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物，包括K2标记引物和K4标记引物；
本发明提供的KASP分子标记主要针对由中国科学院遗传与发育生物学研究所和福建省农业科学院生物技术研究所合作培育的转cry1Ab基因抗虫水稻强优恢复系明恢86(mfb-MH86)及转育材料R900(非转基因水稻恢复系)进行差异检测。依据转基因载体插入的位置特性与R900的序列比对，在插入片段两侧分别设计KASP标记K2和K4，它们都位于水稻第5染色体上。
其中左侧标记K2用于检测18336554bp(日本晴参考基因组物理位置)处A(转基因)→G(非转基因)的单碱基变异，右侧标记K4用于检测18336590bp(日本晴参考基因组物理位置)处C(转基因)→G(非转基因)的单碱基变异。
其中K2标记引物包括用于检测转基因位点A的上游引物K2A-F、用于检测转基因位点A的下游引物K2A-R、用于检测非转基因位点G的上游引物K2G-F、用于检测非转基因位点G的下游引物K2G-R，
上游引物K2A-F具有SEQ ID NO.1所示的DNA序列，具体为：
TTAAAGAGAGAGTTGGCGCTAGA。
在上游引物K2A-F的5’端连接FAM荧光标签，获得FAM-K2A-F，具体的DNA序列为：
gaaggtgaccaagttcatgctTTAAAGAGAGAGTTGGCGCTAGA。
下游引物K2A-R具有SEQ ID NO.2所示的DNA序列，具体为：
TCTAAGCGTCAATTTGTCTAAGG。
上游引物K2G-F具有SEQ ID NO.3所示的DNA序列，具体为：
AAAGAGAGAGTTGGCGCTAGG。
在上游引物K2G-F的5’端连接HEX荧光标签，获得HEX-K2G-F，具体的DNA序列为：
gaaggtcggagtcaacggattAAAGAGAGAGTTGGCGCTAGG。
下游引物K2G-R具有SEQ ID NO.4所示的DNA序列，具体为：
CGTAGACGACTCCAGCCACT。
K4标记引物包括用于检测转基因位点C的上游引物K4C-F、用于检测转基因位点C的下游引物K4C-R、用于检测非转基因位点G的上游引物K4G-F、用于检测非转基因位点G的下游引物K4G-R，
上游引物K4C-F具有SEQ ID NO.5所示的DNA序列，具体为：
TTCAAGTTGTCTAAGCGTCAATTC。
在上游引物K4c-F的5’端连接FAM荧光标签，获得FAM-K4c-F，具体的DNA序列为：
gaaggtgaccaagttcatgctTTCAAGTTGTCTAAGCGTCAATTC。
下游引物K4C-R具有SEQ ID NO.6所示的DNA序列，具体为：
TGTCGGAGATCATCGAGTTG。
上游引物K4G-F具有SEQ ID NO.7所示的DNA序列，具体为：
CGTCTACGTCGTCCTGCG。
在上游引物K4G-F的5’端连接HEX荧光标签，获得HEX—K4G-F，具体的DNA序列为：
gaaggtcggagtcaacggattCGTCTACGTCGTCCTGCG。
下游引物K4G-R具有SEQ ID NO.8所示的DNA序列，具体为：
TGTCGGAGATCATCGAGTTG。
实施例2：
一种试剂盒，包括实施例1的用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物和1x KASPMaster Mix。
实施例3：
一种实施例2的试剂盒在水稻强优恢复系R900的螟虫抗性回交转育检测，具体的检测方法为：
(1)材料选择：
1.1、基因供体：本实施例选用的螟虫抗性基因供体为明辉86背景的mfb-MH86，含有抗虫基因Cry1Ab。抗虫改良受体材料为水稻强优恢复系R900，不含有螟虫抗性基因。
1.2、本实施例的检测群体为：抗虫基因供体亲本mfb-MH86与受体亲本R900的BC1F1回交群体，共包含886个群体单株。另外还有抗虫的阳性对照及阴性对照40个，共计926份叶片样品。检测所用组织样品为单株的幼嫩叶片，将其装入96孔板后备用。
本实施例中的回交群体及亲本对照材料均同期播种，于温室内软盘育秧，到三叶一心时取单株叶片备用。其中回交群体BC1F1及亲本材料于2019年长沙正季播种于温室软盘中。
(2)DNA的提取：本实施例中群体单株及亲本材料的基因组DNA均采用CTAB法提取，具体步骤如下：
2.1、采摘幼穗分化期的新鲜水稻叶片，取少量置于2ml离心管中并加入一颗5mm钢珠，放入液氮中浸泡1min，迅速取出并放入高通量组织碎磨仪中震荡打碎。
2.2、加入已预热的2×CTAB提取缓冲液750μl浸透粉末并倒转离心管，使粉末充分散开，于65℃水浴30min，其间每隔5分钟轻柔混合1次。
2.3、取出离心管，冷却至室温，加入750μl的氯仿/异戊醇(氯仿和异戊醇的体积比为24﹕1)，轻缓颠倒混匀，静置10min。
2.4、12000rpm离心10min，取上清600μl转移至新1.5ml离心管中，加等体积已预冷的异丙醇，保存于-20℃，静置20min。
2.5、12000rpm离心10min，倒掉上清液。加入75％酒精700μl，12000rpm离心10mim。
2.6、倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，自然干燥。
2.7、加入50μl TE缓冲液溶解DNA，4℃保存备用(-20℃长期保存)。
(3)分子标记：KASP反应测试在LGC SNPline基因分型平台上进行。
3.1、反应体系：将DNA加入到在微孔反应板，烘干后加入KASP反应混合液配制KASP反应体系。
KASP反应体系(总反应体系3μl)：
Figure BDA0002682998520000061
Primer X和Primer Y为K2和K4标记引物中的F；其中Primer C为通用引物，为K2、K4引物R中的任意一种。
KASP反应体系中，Primer C终浓度0.42μM，Primer X终浓度0.17μM，Primer Y终浓度0.17μM，KASP Master Mix终浓度1x。
3.2、PCR扩增在水浴热循环仪中完成，Touchdown PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。
3.3、反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。本发明中使用的LGC SNPline基因分型平台与其配套试剂耗材均购于英国LGC公司。
实验一：准确性检测
用于检测目标基因cry1Ab的SNP分子标记是根据抗虫基因序列设计开发的K2和K4，基因标记结果与供体相同且纯合时结果以“++”表示，基因标记结果与受体相同且纯合时结果以“--”表示，样品是杂合基因型时结果中以“+/-”表示；标记结果不清晰时结果以“缺失”表示。
实施例3中的抗虫基因供体亲本mfb-MH86及非转基因受体亲本R900、其他常规水稻品种等的检测结果如表1所示。
表1：KASP标记及金标试纸条检测结果
Figure BDA0002682998520000071
Figure BDA0002682998520000081
从表1的结果可以看出：mfb-MH86在K2和K4标记的基因型均为纯合的A:A和C:C，受体R900则全部为非转基因型的G:G，杂种F1为A:G和C:G基因型，其他水稻材料R1至R31均为“--”基因型(其中K2标记缺失基因型2个)，证明本发明实施例2的检测试剂盒能准确的检测出目标基因cry1Ab，检测结果很好的符合了预期。
实验二：采用BT基因试纸条核验
对上述实施例3中的亲本材料鉴定结果利用cry1ab/ac金标免疫检测核验。具体操作方法是：
剪取待测个体2cm左右叶段，加入1ml蒸馏水稍研磨成水溶液后，将试纸条吸水端浸入溶液内(以不淹没指示线为限)，3～5分钟后若出现2条特异性条带(条带1为质控线，条带2为检测线)即表明此个体内已成功表达BT-Cry1Ab/Ac蛋白，若不出现或没有同时出现2条特异性条带则判断此个体内BT基因没有成功表达。
检测结果如图1所示：BT基因金标试纸条检测结果与KASP标记结果一致，同时标记K2和K4能显著的区分杂合基因型。
实验三：特异性和实用性检测
继续利用分型良好的抗虫KASP标记K2和K4对mfb-MH86和R900构建的BC1F1回交群体进行检测。标记在回交群体中的基因分型图如图2，图3所示。图2侧翼标记K2检测抗虫回交群体分型效果图；图3侧翼标记K4检测抗虫回交群体分型效果图。
侧翼标记K2和K4检测的886份BC1F1世代样品中，251份样品为杂合，603份样品与轮回亲本相同，32份样品数据为“缺失”。
同样的利用BT基因试纸条对上述群体进行验证，虽然验证结果一致，但在大群体的检测过程中，试纸条法突出的表现出整体速度较慢，结果读取等待时间长，试纸条本身失灵造成结果误判等不足。具体体现在以下方面：
一是试管中加入缓冲液耗时费力，虽有排枪等工具，但面对大群体的情况下，也是一项费时费力的工作，拒不完全统计，近千株的群体，光加缓冲液可能都需要耗时20分钟；二是试纸条需要逐一放入装好样品的试管中，如果群体较小，如100个单株以内，时间效率可能还好控制，但如果一旦是大群体，如本发明中的检测近千株的回交群体甚至群体规模更大的几千株回交自己群体等，再逐一放入试纸条时，时间成本就显而易见了。同时，等待试纸条显现结果条带的时间以及试纸条的好坏都直接影响了检测结果的快速获得。而这一些缺陷在利用KASP标记检测BT基因时是不存在的；可见本发明的KASP标记K2和K4不仅能够很好的区分回交转育群体中的杂合和纯合基因型单株，并且能够在群体较大的基础上精准、快速的获得单株基因型，为后续田间移栽、杂交实验争取了宝贵时间，同时为自交分离大群体的基因型验证提供了有力工具，有益于加快抗虫水稻新品种的回交转育过程。
至此，本发明人完成了对抗虫回交转育群体的基因型鉴定工作，同时还提供了与抗虫基因cry1Ab紧密连锁的2个KASP分子标记K2和K4，均位于水稻第5染色体上，分别检测18336554bp(日本晴参考基因组物理位置)处A(转基因)→G(非转基因)的单碱基变异和18336590bp(日本晴参考基因组物理位置)处C(转基因)→G(非转基因)的单碱基变异。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 湖南水稻研究中心
湖南农业大学
<120> 用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物及应用，由其组成的试剂盒及试剂盒的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttaaagagag agttggcgct aga 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctaagcgtc aatttgtcta agg 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaagagagag ttggcgctag g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtagacgac tccagccact 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttcaagttgt ctaagcgtca attc 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgtcggagat catcgagttg 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgtctacgtc gtcctgcg 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtcggagat catcgagttg 20

Claims (8)

1.一种用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物，其特征在于，包括K2标记引物和K4标记引物；
所述K2标记引物包括用于检测转基因位点A的上游引物K2A-F、用于检测转基因位点A的下游引物K2A-R、用于检测非转基因位点G的上游引物K2G-F、用于检测非转基因位点G的下游引物K2G-R，
所述上游引物K2A-F具有SEQ ID NO.1所示的DNA序列，
所述下游引物K2A-R具有SEQ ID NO.2所示的DNA序列，
所述上游引物K2G-F具有SEQ ID NO.3所示的DNA序列，
所述下游引物K2G-R具有SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
所述K4标记引物包括用于检测转基因位点C的上游引物K4C-F、用于检测转基因位点C的下游引物K4C-R、用于检测非转基因位点G的上游引物K4G-F、用于检测非转基因位点G的下游引物K4G-R，
所述上游引物K4C-F具有SEQ ID NO.5所示的DNA序列，
所述下游引物K4C-R具有SEQ ID NO.6所示的DNA序列，
所述上游引物K4G-F具有SEQ ID NO.7所示的DNA序列，
所述下游引物K4G-R具有SEQ ID NO.8所示的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物，其特征在于，所述所述K2A-F和所述K4C-F的5’端连接荧光标签序列；所述K2G-F和所述K4G-F的5’端连接另一荧光标签序列。
3.根据权利要求2所述的用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物，其特征在于，所述荧光标签序列为FAM或HEX。
4.一种权利要求1至3中任一项所述用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物在抗虫回交转育群体的基因型鉴定中的应用。
5.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至3中任一项所述的用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物和KASP反应混合液。
6.一种权利要求5所述的试剂盒在抗虫回交转育群体的基因型鉴定中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：
S1、将待测样品的DNA与试剂盒中的试剂置于微孔反应板中混合获得KASP反应体系；
S2、将所述KASP反应体系进行Touchdown PCR反应获得反应产物；
S3、根据反应产物中的分子标记，进行基因分型。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述S2中所述Touchdown PCR反应具体为：
S2-1、94℃预变性15分钟；
S2-2、94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒；
S2-3、将所述S2-2中变性、退火步骤重复10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；
S2-4、94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒；
S2-5、将所述S2-4中变性、退火步骤重复26个循环获得反应产物。
CN202010967845.3A 2020-09-15 2020-09-15 用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物及应用，由其组成的试剂盒及试剂盒的应用 Active CN112063742B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010967845.3A CN112063742B (zh) 2020-09-15 2020-09-15 用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物及应用，由其组成的试剂盒及试剂盒的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010967845.3A CN112063742B (zh) 2020-09-15 2020-09-15 用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物及应用，由其组成的试剂盒及试剂盒的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112063742A true CN112063742A (zh) 2020-12-11
CN112063742B CN112063742B (zh) 2022-08-19

Family

ID=73695874

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010967845.3A Active CN112063742B (zh) 2020-09-15 2020-09-15 用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物及应用，由其组成的试剂盒及试剂盒的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112063742B (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107083436A (zh) * 2017-06-09 2017-08-22 贵州大学 蛋鸭昼夜节律行为关联基因Cry1分子标记筛选方法
CN107653337A (zh) * 2017-11-14 2018-02-02 湖南杂交水稻研究中心 用于检测水稻als基因发生snp突变的kasp标记引物及其应用
CN109385466A (zh) * 2018-12-28 2019-02-26 广东省农业科学院水稻研究所 一种水稻稻瘟病抗性基因Pi2的KASP功能分子标记及其应用
CN110791581A (zh) * 2019-11-18 2020-02-14 湖北省农业科学院粮食作物研究所 一种检测转基因水稻tt51-1衍生系中外源基因的引物及方法
CN110804676A (zh) * 2019-12-03 2020-02-18 湖南杂交水稻研究中心 水稻OsNramp5-18突变型基因及其鉴定方法、鉴定用KASP分型引物及应用
CN110885896A (zh) * 2019-11-15 2020-03-17 湖南杂交水稻研究中心 用于水稻Wxop/hp基因检测的KASP分子标记及其应用
CN110885837A (zh) * 2019-12-03 2020-03-17 湖南杂交水稻研究中心 水稻OsRR22-1突变型基因及其鉴定方法、鉴定用KASP分型引物及应用
CN110885838A (zh) * 2019-12-03 2020-03-17 湖南杂交水稻研究中心 水稻OsRR22-7突变型基因及其鉴定方法、鉴定用KASP分型引物及应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107083436A (zh) * 2017-06-09 2017-08-22 贵州大学 蛋鸭昼夜节律行为关联基因Cry1分子标记筛选方法
CN107653337A (zh) * 2017-11-14 2018-02-02 湖南杂交水稻研究中心 用于检测水稻als基因发生snp突变的kasp标记引物及其应用
CN109385466A (zh) * 2018-12-28 2019-02-26 广东省农业科学院水稻研究所 一种水稻稻瘟病抗性基因Pi2的KASP功能分子标记及其应用
CN110885896A (zh) * 2019-11-15 2020-03-17 湖南杂交水稻研究中心 用于水稻Wxop/hp基因检测的KASP分子标记及其应用
CN110791581A (zh) * 2019-11-18 2020-02-14 湖北省农业科学院粮食作物研究所 一种检测转基因水稻tt51-1衍生系中外源基因的引物及方法
CN110804676A (zh) * 2019-12-03 2020-02-18 湖南杂交水稻研究中心 水稻OsNramp5-18突变型基因及其鉴定方法、鉴定用KASP分型引物及应用
CN110885837A (zh) * 2019-12-03 2020-03-17 湖南杂交水稻研究中心 水稻OsRR22-1突变型基因及其鉴定方法、鉴定用KASP分型引物及应用
CN110885838A (zh) * 2019-12-03 2020-03-17 湖南杂交水稻研究中心 水稻OsRR22-7突变型基因及其鉴定方法、鉴定用KASP分型引物及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SINA-ELISABETH BEN ALI等: "Genetic and epigenetic characterization of the cry1Ab coding region and its 3′ flanking genomic region in MON810 maize using next-generation sequencing", 《EUROPEAN FOOD RESEARCH AND TECHNOLOGY》 *
唐丽等: "抗虫转基因水稻研究进展及发展趋势", 《杂交水稻》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112063742B (zh) 2022-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11041167B2 (en) Methods and compositions for selecting soybean plants resistant to Phytophthora root rot
JP6778235B2 (ja) 昆虫抵抗性および除草剤耐性ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１
EP3296403A1 (en) Soybean transgenic event mon87751 and methods for detection and use thereof
CN107058479B (zh) 用于选择南方根结线虫抗性大豆植物的方法和组合物
CN102958349A (zh) 用于在玉米中增强玉米大斑病抗性的组合物和方法
US11219174B2 (en) Methods for producing corn plants with northern leaf blight resistance and compositions thereof
JP7443491B2 (ja) ダイズ植物ｄｂｎ８００２を検出するための核酸配列およびそのための検出方法
CN105283069A (zh) 用于提高谷物产量的育种方法及相关材料与方法
CN106498030A (zh) 转基因大豆zuts‑33的制备方法、检测及其应用
US8779233B1 (en) QTL regulating ear productivity traits in maize
CN114787389A (zh) 用于检测大豆植物dbn8205的核酸序列及其检测方法
US9863008B2 (en) Soybean event pDAB9582.816.15.1 detection method
CN112063742B (zh) 用于鉴定Cry1Ab基因的KASP标记引物及应用，由其组成的试剂盒及试剂盒的应用
CN116769955A (zh) 一种快速转育转基因玉米自交系的方法及应用
Tassy et al. Biolistic transformation of wheat
Rogers et al. Direct PCR amplification from leaf discs
CN107034292B (zh) 白菜持绿性基因Brnye1及其分子标记与应用
CN111961748B (zh) 西瓜黄瓜绿斑驳花叶病毒病抗性鉴定snp分子标记及其用途
Omoigui et al. Molecular characterisation of cowpea breeding lines for Striga resistance using FTA® technology.
Hossain et al. Introgression of the QTL qSB11-1TT conferring sheath blight resistance in rice (Oryza sativa) into an elite variety, UKMRC 2, and evaluation of its backcross-derived plants
CN116144820B (zh) 黄瓜根重调控基因连锁的Indel标记及其应用
Sood et al. Applications of Genetic Engineering and DNA Markers in Plant Breeding
US20240035100A1 (en) Soybean transgenic event gm_csm63770 and methods for detection and uses thereof
CN117051159A (zh) 一种鉴定西瓜果皮耐裂性状的InDel分子标记及其应用
CN116814799A (zh) 一种用于检测小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR引物序列及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant