CN110804676A

CN110804676A - 水稻OsNramp5-18突变型基因及其鉴定方法、鉴定用KASP分型引物及应用

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Publication number: CN110804676A
Application number: CN201911222439.8A
Authority: CN
Inventors: 赵炳然; 李文建; 韶也; 余丽霞; 唐丽; 杜艳; 毛毕刚; 李曜魁; 彭彦; 胡远艺; 张丹; 柏连阳; 袁隆平
Original assignee: Hunan Hybrid Rice Research Center
Current assignee: Hunan Hybrid Rice Research Center
Priority date: 2019-12-03
Filing date: 2019-12-03
Publication date: 2020-02-18

Abstract

本发明公开了一种水稻OsNramp5^‑18突变型基因，该OsNramp5^‑18突变型基因相比日本晴水稻的OsNramp5基因序列，包含有以下碱基缺失段，即：在8875646‑8875663位置(RAP_Locus)存在[CCTACGTGGCAATTCACA/‑]18个bp的缺失。同时公开了水稻OsNramp5^‑18突变型基因在作物分子辅助育种中的应用以及在选育或制备耐盐表型水稻品种中的应用，取得了显著的技术效果。本发明还公开了用于检测、筛选或获取水稻OsNramp5^‑18突变型基因的突变体的KASP分型引物，可提高现有创新种质筛查鉴定的准确性及效率。

Description

水稻OsNramp5-18突变型基因及其鉴定方法、鉴定用KASP分型引物及应用

技术领域

本发明属于水稻诱变育种技术领域，尤其涉及一种水稻突变型基因及鉴定方法，还涉及鉴定用KASP分型引物及相关应用。

背景技术

近年来，“镉大米”事件的相继发生，稻米品质便成为大众关注的焦点。重金属Cd系一种毒性极强的累积性肾毒素和致癌物，稻米Cd是以其为主食人群摄入Cd的最主要来源。申请公布号为CN105052641A的发明专利申请公开了一种低镉水稻的筛选方法，选定湘晚籼12号作为对照，进行大田种植与盆栽种植双重试验，设置镉污染程度轻、中、重三种筛选条件，筛选得到的低镉水稻品种/品系的低镉特征特性表现为全面、稳定。虽然现有技术中对于低镉水稻的选育方法已有报道，但是都主要集中于环境压力条件下的品种筛选，少有采用诱变育种及分子育种筛选低镉水稻的相关报道。因此，加强低镉累积水稻新品种的选育，将更有利于推动安全营养型安全农产品的产业发展。

种质资源是植物遗传育种的基础，诱变育种能产生丰富的遗传变异，造成的变异率是自然变异的成千上万倍。据世界原子能机构1985年统计，当时世界各国通过诱变方法就已经育成500多个品种，同时获得大量有价值的种质资源。但诱变育种也存在诸多明显的缺陷，其中最主要的是由于突变位置随机，并且只能在M2代才能选择目标突变体，这导致创新种质的准确性及效率都很低。

随着基因定点编辑技术在植物上的普及，该技术以其精准、高效、简便的特点有效地弥补了诱变育种的缺陷，正受到植物遗传育种界的青睐。尽管基因定点编辑技术克服了诱变育种的主要缺点，但基因定点编辑技术在植物上的应用，还需要通过转基因手段，而有些重要的植物转基因体系并不成熟，限制了基因定点编辑技术的应用。诱变育种是通过物理、化学手段，不借助转基因技术，大部分植物都能通过诱变获得稳定遗传的突变种质，因此诱变育种仍有其不可替代的优势。另外，诱变育种在植物中的应用历史悠久。1927年，Muller在第三次国际遗传学大会论述X-射线诱发果蝇产生大量变异，提出诱发突变改良植物。之后，Stadler首次证明X-射线可以诱发玉米和大麦突变。Nilsson-Ehle&Gustafsson(1930)利用X射线辐照获得了茎秆坚硬、穗型紧密、直立型的大麦突变体。1934年，Tollenear利用X射线育成了第一个烟草突变品种“Chlorina”。1948年，印度利用X射线诱变育成抗干旱的棉花品种。1957年，中国农业科学院成立了我国第一个原子能农业利用研究室，随后各省也相继成立有关研究机构。20世纪60年代中期开始在水稻、小麦、大豆等主要作物上利用辐射诱变育成了新品种，在生产上得到了应用。20世纪70年代后期，植物辐射诱变育种开始应用于蔬菜、糖料、瓜果、饲料、药用和观赏植物育种。可见，诱变育种经过了长时间的检验，为世界植物的遗传育种做出了巨大贡献，不论是在科学界还是在产业界，已经成为一种被普遍接受的育种手段。

一直以来，诱变育种的通识是不对诱变当代(M1)进行突变选择，因为诱变引起的遗传变异多为隐性，并且是以嵌合体的形式存在于M1中。只有到诱变二代(M2)的分离群体中，M1产生的隐性变异才会以纯合的形式存在于M2的个体中，此时才能根据目标性状选择突变体。基于诱变育种仍具有不可替代的优势，我们希望能解决其选择到有益突变以及目标基因突变效率低的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种水稻OsNramp5^-18突变型基因，还提供一种效率高、准确性好、操作简便的从理化诱变样本中鉴定是否含水稻OsNramp5^-18突变型基因的方法以及用于检测、筛选或获取水稻OsNramp5^-18突变型基因的突变体的KASP分型引物，还相应提供一种水稻OsNramp5^-18突变型基因在作物分子辅助育种中的应用以及水稻OsNramp5^-18突变型基因或具有水稻OsNramp5^-18突变型基因的突变体在选育或制备镉低吸收表型水稻品种中的应用，该应用能以一种节省人力物力、效率高、精度好的方式获得镉低吸收表型水稻品种。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种水稻OsNramp5^-18突变型基因，所述OsNramp5^-18突变型基因相比日本晴水稻的OsNramp5基因序列，包含有以下碱基缺失段，即：

在8875646-8875663位置(RAP_Locus)存在[CCTACGTGGCAATTCACA/-]18个bp的缺失(该缺失有1bp位于第9外显子的起始碱基)。

作为进一步优选的，上述水稻OsNramp5^-18突变型基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或其截短序列，或与其有95％以上同源性的编码相同功能蛋白的特异性序列。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种从理化诱变样本中鉴定是否含上述水稻OsNramp5^-18突变型基因的方法，包括以下步骤：

a)通过非致死剂量的理化诱变方式对水稻进行诱变，获得水稻材料M1代；

b)将获得的M1代的植株分单株进行种植，并取各种植后单株上的叶片，将各单株的叶片混合；

c)对混合后的全部叶片材料提取出混池DNA；

d)对提取的混池DNA进行水稻OsNramp5基因区域的高深度靶向测序；

e)将高深度靶向测序结果与所述水稻OsNramp5^-18基因的相关序列进行比对，鉴定高深度靶向测序结果中的群体性DNA样品是否存在水稻OsNramp5^-18基因；

如果含有水稻OsNramp5^-18突变型基因则可进行后续筛选操作获得相应突变体，否则终止操作。

现今二代测序技术(NGS)以及最新的三代测序加速了遗传病、癌症等领域的研究，其本身也作为一种更为先进的基因检测手段逐步走进临床。在众多测序技术中，我们充分考虑灵活性与低成本，最终选用靶向测序技术，通过对基因组的目标区域进行高深度测序，将其转用于植物创新种质的快速筛查和鉴定，大大提高现有创新种质筛查的准确性及效率。

上述的方法，优选的，所述后续筛选操作还包括利用以下任意一种或多种方式对鉴定结果进行验证，验证样品中是否存在水稻OsNramp5^-18突变型基因，所述验证方式具体包括：

e₁：数字PCR(即Digital PCR，dPCR)鉴定方式对全部植株进行检测；

e₂：通过KASP分型方式对每个单株进行分型鉴定；

e₃：通过一代测序方式对每个单株进行鉴定。

数字PCR是近年快速发展起来的新一代PCR技术，是一种核酸分子绝对定量技术，凭借其超高灵敏度，数字PCR系统可以很容易地定量分析低至0.01％的低频突变。由于数字PCR是精确到DNA单个分子的绝对定量技术，所以具有超高的精准度，通过将数字PCR与高深度靶向测序技术相结合，能够对深度测序检测出的低频突变做出准确地验证，进一步提高现有创新种质筛查的准确性及效率。

KASP即竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAllele Specific PCR)是一种高通量已知SNP/Indel检测技术，基于终端荧光读数，双色荧光可以检测到同一位点的不同基因型。通过利用KASP技术对高深度靶向测序发现的SNP/Indel进行不同个体的高通量分型鉴定，又可进一步提高现有创新种质筛查的准确性及效率。

上述的方法，更优选的，所述验证方式包括以下两步：

1)先采用数字PCR鉴定方式对高深度靶向测序结果中的群体性DNA进行检测，鉴定群体性DNA样品中是否存在水稻OsNramp5^-18突变型基因；若存在则执行以下第2)步，否则终止；

2)再针对数字PCR鉴定存在的SNP和/或Indel位点，利用KASP分型引物，对含有该突变的混池样本所对应的群体，分单株进行KASP基因分型，最终确定是否含有水稻OsNramp5^-18突变型基因的嵌合体单株。

KASP作为一种高通量已知SNP/Indel检测技术，基于终端荧光读数，双色荧光可以检测到同一位点的不同基因型。通过利用数字PCR缩小候选区域群体，再利用KASP技术对高深度靶向测序发现的SNP/Indel进行不同个体的精确分型，可进一步提高现有创新种质筛查鉴定的准确性及效率。

上述的方法，优选的，所述KASP分型的分型引物包含以下序列：

FAM 5-’GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAAGAACCTGCACCCGTCCT-’3；

HEX 5-’GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAAGAACCTGCACCCGTCAC-’3；

COMMON 5-’GCATGGAAAGAAACTGAACAAAGAT-’3。

上述的方法，优选的，所述后续筛选操作还包括以下步骤：

f)对每一株含有目的基因区域突变的嵌合体单株，提取其每个穗子对应叶片的DNA进行DNA鉴定，选择含有该突变的穗子，并混收其种子；

g)对于混收的种子(M2代)进行混播，然后分单株提取叶片并进行DNA鉴定，最终获得具有OsNramp5^-18突变型基因遗传表型的突变体(M2单株)。

上述的方法，优选的，所述步骤f中，所述DNA鉴定优选是利用已经设计的上述KASP分型引物进行鉴定，但也可以是针对目标区域的一代测序鉴定；采用上述的KASP分型引物进行鉴定，能够更好地实现高通量、低成本和操作的便捷性。

上述的方法，优选的，所述步骤g)中，所述DNA鉴定优选是利用已经设计的上述KASP分型引物进行鉴定，但也可以是针对目标区域的一代测序鉴定。采用上述的KASP分型引物进行鉴定，能够更好地实现高通量、低成本和操作的便捷性。

上述的方法，优选的，所述步骤a)中的理化诱变方式包括以下物理诱变、化学诱变方式中的一种或多种的组合：

所述物理诱变包括紫外线诱变、X射线诱变、γ射线诱变、β射线诱变、α射线诱变、高能粒子诱变、宇宙射线诱变、微重力诱变；物理诱变更容易产生Indel突变；

所述化学诱变包括烷化剂诱变、叠氮化物诱变、碱基类似物诱变、氯化锂诱变、抗生素诱变、嵌入染料诱变；化学诱变更容易产生SNP突变；

所述烷化剂诱变包括甲基环酸乙酯(EMS)诱变、硫酸二乙酯(DES)诱变、乙烯亚胺(EI)诱变。

上述的方法，优选的，所述步骤a)中的非致死剂量是指将剂量控制在半致死剂量上下浮动20％的范围。该剂量控制既能获得一定突变率，又能获得一定的活种子数量；例如为半致死剂量。通过对诱变方式剂量的控制能够协调突变效率与活种量之间的平衡关系。

上述的方法，优选的，所述步骤b)中，将获得的M1代的植株分单株进行种植时以任意株数为一个群体，以每个群体为单位进行编号；后续步骤c)中，每个群体的叶片混合于一个离心管中提取DNA，以使得每管的DNA都包含整个群体的遗传信息。通过这样的分组操作可以使测序时包含较大的样本量，然后再将大量样本混池，减少测序成本，再结合后面加测分型的KASP技术，最终实现高通量和低成本的有效平衡。

上述的方法，优选的，所述步骤d)中，所述水稻OsNramp5基因区域包括水稻OsNramp5基因的外显子区域或水稻OsNramp5基因的非编码区(或者水稻基因组上其他感兴趣的区域，特别优选外显子区域)，所述高深度靶向测序包括基于多重PCR扩增靶向捕获技术、基于液相探针捕获杂交的靶向捕获技术或第三代测序单分子靶向测序技术；

所述高深度靶向测序的测序深度根据每个群体内的单株数量确定。

作为进一步的优选，所述每个群体的任意株数为48株、96株或192株；对其中每个单株取叶片时均选取同一单株不同部位的等量叶片。作为更进一步的优选，后续步骤d中，株数为48株的单个群体其高深度靶向测序的测序深度大于2000重，株数为96株的单个群体其高深度靶向测序的测序深度大于5000重，株数为192株的单个群体其高深度靶向测序的测序深度大于10000重。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种用于检测、筛选或获取水稻OsNramp5^-18突变型基因的突变体的KASP分型引物，所述KASP分型引物包含以下序列：

FAM 5-’GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAAGAACCTGCACCCGTCCT-’3；

HEX 5-’GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAAGAACCTGCACCCGTCAC-’3；

COMMON 5-’GCATGGAAAGAAACTGAACAAAGAT-’3。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种水稻OsNramp5^-18突变型基因在作物分子辅助育种中的应用。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种水稻OsNramp5^-18突变型基因或具有水稻OsNramp5^-18突变型基因的突变体在选育或制备镉低吸收表型水稻品种中的应用。该应用优选具体包括以下步骤：

1)以所述突变体为供体亲本，以其他任意水稻品种Y(例如华占、水稻Y58s)为受体亲本，进行杂交转育，获得F1种子；

2)将F1种子群体播种后，选单株与上述轮回亲本水稻品种Y进行杂交获得BC1F1种子；

3)播种BC1F1种子，分单株提取BC1F1群体DNA，用上述的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsNramp5^-18突变型基因的单株，进行背景选择，选择与所述轮回亲本背景相似度最高的单株继续回交获得BC2F1种子；

4)播种BC2F1种子，分单株提取BC2F1群体DNA，用上述的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsNramp5^-18突变型基因的单株，进行背景选择，选择与所述轮回亲本背景相似度最高的单株继续回交获得BC3F1种子；

5)播种BC3F1种子，分单株提取BC3F1群体DNA，用上述的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsNramp5^-18突变型基因的单株，进行背景选择，选择与轮回亲本背景相似度最高的单株自交结实获得BC3F2种子；

6)播种BC3F2种子，分单株提取BC3F2群体DNA，用上述的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsNramp5^-18突变型基因的单株，进行背景选择，选择与上述水稻品种Y遗传背景一致的单株Y-Nramp5^-18收种；获得镉低吸收表型水稻品种Y-Nramp5^-18。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1)本发明将高深度靶向测序技术创造性地结合靶向测序技术、数字PCR技术、KASP基因分型技术中的一种或多种，并创造性地转用于诱变育种突变筛查领域，实现了能在诱变M1代即对目标基因的突变进行高通量精准选择，精确定位到含有目标基因突变的嵌合体单株；

2)基于本发明的鉴定方法及筛选方法，我们创造性地获得了水稻OsNramp5^-18突变型基因，同时提出了水稻OsNramp5^-18突变型基因在作物分子辅助育种中的应用以及在选育或制备镉低吸收表型水稻品种中的应用，取得了显著的技术效果，并最终获得了镉低吸收表型的水稻品种；

3)本发明设计的用于检测、筛选或获取水稻OsNramp5^-18突变型基因的突变体的KASP分型引物，可以对高深度靶向测序发现的SNP/Indel进行不同个体的精确分型，可进一步提高现有创新种质筛查鉴定的准确性及效率；

4)本发明的技术方案不仅节省了繁殖一代所需的时间成本，而且解决了繁殖一代后，群体数量大量增加，所造成的土地、人力以及突变选择成本太高的问题，具有显著的进步意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明从理化诱变样本中鉴定是否含上述水稻OsNramp5^-18突变型基因的方法的流程简图。

图2为本发明实施例1中利用KASP分型引物对32号群体分型后的结果。

图3为本发明实施例2中测定突变体与对照单株籽粒干重的对比结果。

图4为本发明实施例2中测定突变体与对照糙米Cd含量的对比结果。

图5为本发明实施例2中突变体华占-Nramp5^-18与华占(WT)同时发苗的对比照片。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

一种水稻OsNramp5^-18突变型基因，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。从北京擎科新业生物技术有限公司检测结果来看，该水稻OsNramp5^-18突变型基因为在OsNramp5基因的8875646-8875663位置(RAP_Locus)存在[CCTACGTGGCAATTCACA/-]18个bp的缺失，该缺失有1bp位于第9外显子的起始碱基。

一种如图1所示从理化诱变样本中鉴定是否含上述水稻OsNramp5^-18突变型基因的方法，包括以下步骤：

1.用80MeV/u碳离子(¹²C⁶⁺)以180Gy的剂量照射两万粒水稻品种638S的种子，获得水稻品种638S(以下简称638S)的M1代。

2.将两万粒638S M1代的种子育秧后的植株分单株进行种植。以96株为一个群体，每个群体8行，每行12株，种植100个群体，共9600株，并对每个群体进行编号1-100。

3.以每个群体为单位，对其中每个单株取等量叶片，共96等份混合于1个离心管中提取DNA，共提取100份DNA，DNA编号对应每个群体编号1-100。

4.以每个群体的DNA为一个测序样本，针对OsNramp5基因(Os07g0257200)的外显子区域进行靶向高深度测序，测序深度>5000重。

5.将高深度靶向测序数据比对日本晴序列，获得100个样本中OsNramp5基因外显子存在的SNP与Indel数据。经北京擎科新业生物技术有限公司检测发现第32号样本中，在OsNramp5基因的8875646-8875663位置(RAP_Locus)存在[CCTACGTGGCAATTCACA/-]18个bp的缺失，该缺失有1bp位于第9外显子的起始碱基。

6.采用数字PCR技术对上述第32号群体样本测序数据中存在的Indel进行验证，验证结果表明样本中均存在靶向测序数据中的缺失突变基因型，即存在本发明的水稻OsNramp5^-18基因。

7.根据第32号群体样本中DNA存在的缺失突变基因型，设计一种KASP分型引物如下(北京擎科新业生物技术有限公司生产)：

FAM 5-’GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAAGAACCTGCACCCGTCCT-’3(SEQ ID NO.2所示，下划线部分表示荧光标签引物)；

HEX 5-’GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAAGAACCTGCACCCGTCAC-’3(SEQ ID NO.3所示，下划线部分表示荧光标签引物)；

COMMON 5-’GCATGGAAAGAAACTGAACAAAGAT-’3(SEQ ID NO.4所示)。

8.利用缺失突变位点的KASP分型引物，对32号群体的96个单株进行分型，分型的具体操作如下：

(1)CTAB法提取水稻叶片DNA；

(2)KASP分型体系5μl：

(3)PCR反应程序

经分型后发现32号群体里的4排第5株(32-D-5)含有在OsNramp5基因的8875646-8875663位置(RAP_Locus)存在[CCTACGTGGCAATTCACA/-]18个bp的缺失，该缺失有1bp位于第9外显子的起始碱基(参见图2)，最终获得1株目标基因缺失突变的M1代单株，即OsNramp5基因移码突变嵌合体32-D-5。

9.取32-D-5单株上每个穗子上对应的叶片提取DNA，针对单株存在的Indel突变进行测序检测，发现32-D-5单株中有3个穗子含有[CCTACGTGGCAATTCACA/-]突变基因型。以单株为单位混收含有突变基因型穗子的种子。

10.将32-D-5单株混收的种子进行播种，并用上述第7步中设计的KASP引物对单株进行分型，最终在32-D-5的M2群体中获得OsNramp5^-18突变型基因遗传表型的突变体。

实施例2：

一种水稻OsNramp5^-18突变型基因或实施例1中获得的具有水稻OsNramp5^-18突变型基因的突变体在选育、制备镉低吸收表型水稻品种中的应用，具体包括以下步骤：

1)以实施例1获得的具有OsNramp5^-18突变型基因遗传表型的突变体为供体亲本，以水稻华占为受体亲本，进行杂交转育，获得F1种子；

2)将F1种子群体播种后，选单株与轮回亲本水稻华占进行杂交获得BC1F1种子；

3)播种BC1F1种子，分单株提取BC1F1群体DNA，用实施例1中设计的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsNramp5^-18突变型基因的单株，进行背景选择，选择与所述轮回亲本背景相似度最高的单株继续回交获得BC2F1种子；

4)播种BC2F1种子，分单株提取BC2F1群体DNA，用实施例1中设计的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsNramp5^-18突变型基因的单株，进行背景选择，选择与所述轮回亲本背景相似度最高的单株继续回交获得BC3F1种子；

5)播种BC3F1种子，分单株提取BC3F1群体DNA，用实施例1中设计的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsNramp5^-18突变型基因的单株，进行背景选择，选择与轮回亲本背景相似度最高的单株自交结实获得BC3F2种子；

6)播种BC3F2种子，分单株提取BC3F2群体DNA，用实施例1中设计的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsNramp5^-18突变型基因的单株，进行背景选择，选择与水稻华占遗传背景一致的单株华占-Nramp5^-18收种；获得图5所示的镉低吸收表型水稻品种华占-Nramp5^-18。

对上述应用后获得的镉低吸收表型水稻品种华占-Nramp5^-18进行采取镉胁迫盆栽试验，土壤取自大田表层，测定基础肥力，风干、过筛、去杂、混匀，分装至每盆25mg/kg，将Cd(CdCl₂)以溶液形式加入备用土壤，镉处理浓度为2mg/kg，平衡4周待用。

将本实施例步骤6)中获得的突变体华占-Nramp5^-18及华占对照种植于镉污染盆，每盆6穴，每穴2株，3次重复。于水稻成熟期取样，将单株的茎叶和穗分开，脱粒，茎叶用自来水冲洗，用去离子水洗净，各样品105℃杀青30min，80℃烘干至恒重，测定单株籽粒的干重，结果参见图3。将糙米粉碎，过100目筛，用HNO₃-HClO₄消解，用电感耦合等离子体发射光谱仪ICP鉴定糙米镉含量及其他相关矿质元素含量，结果参见图4。前述图3、图4的结果显示，突变体糙米Cd含量较对照极显著降低，而植株的生物学产量较对照没有显著差异。

序列表

<110> 湖南杂交水稻研究中心

<120> 水稻OsNramp5-18突变型基因及其鉴定方法、鉴定用KASP分型引物及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7221

<212> DNA

<213> 水稻 (Oryza sativa L.)

<400> 1

aggacgttgg ctctgccctg aattatgata aatcatatcg tacatataaa ttacaaggat 60

acatgagcca cctcccctca aatgcttata tattaattgc acacccttgt cgatcgatcg 120

atctgcgagc gatctggacc gcacaaatat aaacgaacgg ctccgacgca cgcacgtggc 180

atccatagag gatgcacata tacgtacgta agtacgtata ttcacaatgt acgcgtacat 240

acgtacgtat acatacgcta taccatacgt atgcatgtcg atcttcttct tctctacctt 300

gggagcggga tgtcggccag gtcgtcgcgg tacggcaagg gctcgtcgtc gtcgacggcg 360

aggtcgccgg cgtcggcctt ctcggcgtcg acgacggcgg cgagggagga gtcggcgacg 420

aaggtgacga cggagtcctt cctgatggtg aggtagacga cggcgacgat gtagacgagc 480

atgaacggga agacggcggc gccgacgagc acgttggcgt acttggggag gtcgttgtgg 540

atgagccagc cgacgaagct cgtgctcagg aagtacatgt tgatgccgat gatgagcagc 600

cccaggaacc acgagaacac tattatctgc attcaattca attcaattta ttttttgaca 660

tacatgacgc taatttattc attgatagcg tcactaaata accagtcatc tttgacgggt 720

ggtaacttat atatcttttt aacgggtatc gactgatgag catgcgcaat ttttataggt 780

agtatattaa tatatatata tatagccatg tgtgtaataa taagaaataa atttacattt 840

gctcaatttt gttgtagatc agtttattta tggtccttaa aaaagaatta cattttctaa 900

tgttgacttg tatgtgtcta gaaatgttta agtagagata caacgatata cgtaattatc 960

tatgttaaat tatatttaca ttttacttcc atgcaagaaa aaatatatat agtgtactga 1020

agaacttggc tcttcgatgt ctgtaaagat caagcaagta cgttactgca tgattttgac 1080

acatcatgcc gacgacgcaa tacatgatta atctctggta ctactgcaag acagaaaaat 1140

gatgcaggac gtacatcttg gtcgtcgttt tcatatgtac gacgatcctc tatatgcatg 1200

gctggaccat atatatacct gtcctgcatt ggcccctgct gtgctatatt actattgcat 1260

gagctaggta gctaatgatt caattcaatt cactgcacat ctcgatctac attatgcaca 1320

cactgaccta tagaacatgg tgtcctgcag gggttgcatg catgcagggt gaaggaccag 1380

ctagctagcc aactatcatc attaatttat attctttacc aacaattatt gaaactctaa 1440

tttcatgcat ggacagatag atgcatatat ttatgttact tgtacatttg ctgccatttg 1500

agattaagaa acaaactata attaagcaat gcatatatat agtgtacgat cttacataga 1560

tagagttctt gtggggcccc atcttgctct tactgctgct gaacttgaga agagggatga 1620

gagcaaacgg cagctcgaag gacagtatca tctgcatgca cacaacacgt acggattagg 1680

aacaaattaa tcatatatat gtaattaagc aaacaagaac tagcaatgat cagatcacta 1740

ctttgatttg atttaattat atataattag tccttactta ttgagttgga agctagtcta 1800

gctagatggt acactgtatt atatatatgc atggtgctat tttagatcag attgcaaaaa 1860

aagaaaagat acctagctag tcagtgacat tttgctaatc agatcactac tttgatttgg 1920

caataatcta aaaaaagaag aaaaagtgct tttgctctaa tgacatatat atatgctctt 1980

agtactatgt cactaggtac ctagtggata ccccactact acctagctag ctacataaat 2040

ccgcacgatc gactgcacac acgtgactgt ttgggcatgt gcaaaattaa aaatttaaac 2100

gcattaaatt ttaatcgatc ggcgacacga cggccggccg gttgctcgcc ggcgggcgcc 2160

gccgtatggc gcacgcagtt tgatatagta aaatagtaat aatagtaaag atttgctata 2220

gtaaatagta ataataaaaa tgctgaccga agcgatgatg atgaggcggc cggcgcccct 2280

ggagccgccg atgatggaga cgatgaggct cggcgcgatg gcgatggttc ttgtcatcag 2340

gttccgaagc cacttcctca tcctgatgtc caagaaaccc tgcacataca tggatcatat 2400

catatatatc aacgcgacat gatgatgatt tatcatatac tccctccgtc attaaatatt 2460

tgacaccatt gatttttcta aacatattta accattcatc ttattcaata aatttaagta 2520

gttattaatt cttttcttat tatttaattc attgttgtat atactactac tactcaagtt 2580

ttttaaataa tattcacaaa agtttttgca taagacgaac ggtcaaacat atttataaaa 2640

aatcaacgac gtcaaatatt tagagacgga gtgagtatat cctgaagatc agtcctttgg 2700

agtgaaaaaa taaatatata ttttcgggtc cgatttatcc cgtaactgaa atacacttca 2760

tatcataaat agattattaa gaggaatgag actcgaacta gatcggttag cccgccaggt 2820

agattaggaa aactagttgt tctctttctc aacgttcact tcagaaagaa aattttacgg 2880

tgcgatggga tatcctattt tttttaatat aatttataga gtttcgttag catattttta 2940

ttaatcaatt ggttttctaa gtatatgtaa acagtaaaat cgctggttat tgatgagact 3000

gcaccgtgaa atggactaga ccaaaagagc ggagaaatat ggacgaaagt ggtaagtagt 3060

ggcagcaagg tagcgtctta attcgatctt actttaacaa aaacatatgg tgaaatccga 3120

cgaggatcgc cagattacct aattaataaa ggaatattat atcactaaat attcgtgatg 3180

taaacaggat taggtgtgca cccctacaat tcgtcagtta acctccataa ttgaacggat 3240

taacaaatta attatgtggc agctagccgt ttaattaatt atagttcaat catttaatta 3300

cgcgctaagc tagctggtga tgtacaggta caggtacagt taagttaatt aatttaatta 3360

attacctgca tgatgtactg tccagcgtat gtgccggtaa tagtggagct ctgcccagat 3420

gccaacagtg ccacgccgta cacgatcgca ctcgacttgc ccagcacgtt ctgaaccaca 3480

taaaaaattg acgtcacaat ttgaccataa attagttact cctcctattc aaaaatataa 3540

acatatctaa taaagttatt atattttagg acggagaaat cgtgtagact aattcggtgt 3600

tattgtggtt aattaaatat tgattaaatt gaacacatac aagctagtac tacgaatctg 3660

aataaattcc tatatctgta gtattaggat acgtctaatc catttaaaaa cttttaatat 3720

taaagagtag gaagtaataa tgaatgaatg accttgagaa ggaaggagga ggtgtcgagg 3780

ctgaggttgg cgcacttgtc ggcgtcctct tgggagaggt tggcggagga gcaggcggtg 3840

ccggagacgg agacgacggc gatgtttatc agcagcgcca cgaacagcgc gaacccgctc 3900

tcgtacagga agaacctgca cccgtcacca tatagtacat attaattatt agcctggatc 3960

tttgttcagt ttctttccat gcatgaaaaa attcttagct gaatccagtg gtactggagc 4020

ccgaaattat agaagattag tgctaaaata aaacttagct aataaagtat tggttttcta 4080

tgaaatttac atgttaattt aataaaattt aaacaagatt taagagacag gactagatcg 4140

agttcatgtc ctagctaccc tatacctatc tcgatctgcc caggctgaag atagctacct 4200

tgattcctct gactgatgcc ggtgtcttcc tcgatagcac caaggcagaa tgcaagaaca 4260

gattgtggct gcatatatat aaatgcatgc agtagttaat taactgatta gttgtatgaa 4320

ttaattgatt gattgttgcg tatgtatgta tgtatgtatg taaaagcgta cggcatgaca 4380

agagctccga ggagggcaat ggcgtcggcg gtggcgccgt cgccgttgag cctggggatg 4440

aagagcccct tcatcacctc cttcgccggc ggcttcacga tgctcagctc cccgaagaag 4500

cacgccgcca tcacgaacac cagcatcgat atcagaaact ccagcttcct cacctgtttt 4560

ttttcaaaaa aaattcatca atcaattttc atgcagttcc acagtcagag aaaaaaaaac 4620

tgaataatgt acatataata tgccatttga gtacttgaca atcgatccaa ctagctaatt 4680

tcatatacta ttccattttt ataatcgttt ctttgagtgc atcctacgct aatgcttgtg 4740

atactaaaca aaaacaactt acaaaaaata atttataccc cgtatttttg gaggccaaga 4800

agcagtagag tgctggtgcc ggtgatgagg acgccgaccc acaccggaat atggaacaat 4860

atgttgaaag caaaggccgt ccctataact gcatccacca aaattaacaa catcaaacga 4920

catgtaatta attaattaat tataatcaca tcgatctgta cctttctatc tgttgatcga 4980

tctatctatc tatctatata tcacctttgc tatcatcatg tgaggtatct tccataacta 5040

gtttaatttt tttaaaaaag aacttgcatg catgatcaat taaaaaggca atttacaacg 5100

gttgaggtta actaatcccg atcagcaaag cttcgcgcag ctccgttttg caactgctac 5160

accactgatc tatcttccat gttgctagat agatagatat ttagatattg ttgttattgt 5220

ttaaacacac atggatgtat acaggacagg acaaatgtga aatgacaaga gggtgacaaa 5280

atagttgttt actaatctgc gtaagatgat gaacgtactc acccagtgtt taaaatctaa 5340

tcttgatgtg catcattgac aattttatgg gaagctactg tggacgtggt cactactcta 5400

aacagctaaa acgcgcattt gcttatgttt gaaacagatt attcaacaga tatattattg 5460

gtacatatta tctaccttat tatatggatg aattaaatat tttttaaaaa aatggcttag 5520

aacttgtaat ctatgcaata tcgcagaata tatttttttt agaaaaacat atttactagc 5580

tagagacatg aaagaaataa tatgtgagaa taatctggtg agtagctgag aagaacgtgg 5640

cttgatggtg attggtgaga tattaatttg cctatgtttg tggattagga attccagtat 5700

gtaggcccgt acggttggag ctacatatgc tagccagatc aacttgtttt cttctactgt 5760

cagagagctt aaactgaatt aattaattag ctcaaagtca aagatggtga cactgttaaa 5820

cacaagtagt ttaataaatt aattattcag gctggaccgt gtcaagttgt tctaataagt 5880

atataccttc tgggatatct gcagcgatga cggccaactc tgccagcagc cataggaaaa 5940

tcttgacgaa cttggggtac tcactcttgc agatctcagc cagatgcctc cctaggatgt 6000

aaattaatgc cggccatata ttagcacttt atcaagttgg taattacagt ttaattgcgt 6060

gtcatttagt cacctgtaac cactccaaga ttagctgcta gcgactgtat gataagtgcg 6120

aagatgagtc caatcagaat cacccagagc agctgcaaat tgaaacaaca caatggacag 6180

aaaagcacat agaaatcaat taatggtgca gattattcac ttttctcttt tctctagatg 6240

atgtgagagt gagatacata tgcactgggg attaaaagtg gttctgaaaa gtttgtcaat 6300

ttggagaatt tgatggagct agcagatgaa ttaatggagt gtgagtctgc gagggacaag 6360

gaaagggacg aacacctaga aagcatgaaa gttactcatg ctttcagtca ttcagtgcgt 6420

aaacagtaaa ataaagtcga ctgtacgtac ctcatatctg tggttggctc cggcttgcag 6480

atcggtttcc actgtttcat tttgtgacaa aattaacagt tacaatccag agtttgtcaa 6540

aataaaagtt tcagttgaga gagagagaga gagagagaga gagagattca gagattctca 6600

caattgccag gatccaagta ggctaaagac accatgaatc caggaccaac atgggcaagg 6660

aaccttttcc atgcaggctc ctgtacacaa tttaccaaaa ctgagaaact aacaaaaaga 6720

aacacagaca taattgagga tccaatgttc catcagtcct taattaccac atacacacac 6780

acacacatga acattcatga gcaatgaatg ccatgccagg aagtactctc aagatctatc 6840

tacattaagc tctgctcttg cttctgcagt tacagtgaac aactgtccat ggtgacagtg 6900

gagtgcttac aagaagacaa ctttgtgata attaaggtag caactgacct tcattagcag 6960

ctgatcatct gcgtcgagct tcttggcatc ttgatcatgt gccgcactag ctctccagct 7020

gatgctccct ctctcactgc tctctctctc aatctccatt gttgcttcct ctcttagctt 7080

cttcaggcta agctagagct aagctagact caggctagct ggaagtagac gaagaagaga 7140

atggtggtag tgacgaactc tcaagccaca ccctcctgtc ctacttatac acaaaccatg 7200

caagtatgca gccaaattaa c 7221

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc tgaagaacct gcacccgtcc t 41

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaggtcgga gtcaacggat tgaagaacct gcacccgtca c 41

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcatggaaag aaactgaaca aagat 25

Claims

1.一种水稻OsNramp5^-18突变型基因，其特征在于，所述OsNramp5^-18突变型基因相比日本晴水稻的OsNramp5基因序列，包含有以下碱基缺失段，即：

在8875646-8875663位置(RAP_Locus)存在[CCTACGTGGCAATTCACA/-]18个bp的缺失。

2.根据权利要求1所述的水稻OsNramp5^-18突变型基因，其特征在于，其具有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，或其截短序列，或与其有95％以上同源性的编码相同功能蛋白的特异性序列。

3.一种从理化诱变样本中鉴定是否含权利要求1或2所述水稻OsNramp5^-18突变型基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

c)对混合后的全部叶片材料提取出混池DNA；

e)将高深度靶向测序结果与所述水稻OsNramp5^-18突变型基因的相关序列进行比对，鉴定高深度靶向测序结果中的群体性DNA样品是否存在水稻OsNramp5^-18突变型基因；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述后续筛选操作还包括利用以下任意一种或多种方式对所述步骤e)的鉴定结果进行验证，验证样品中是否存在水稻OsNramp5^-18突变型基因，所述验证方式具体包括：

e₁：数字PCR鉴定方式对全部植株进行检测验证；

e₂：通过KASP分型方式对每个单株进行分型验证；

e₃：通过一代测序方式对每个单株进行验证。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述验证方式包括以下两步：

1)先采用数字PCR鉴定方式对高深度靶向测序结果中的群体性DNA进行检测，鉴定群体性DNA样品中是否存在OsNramp5^-18基因的目标SNP和/或Indel；若存在则执行以下第2)步，否则终止；

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述KASP分型的分型引物包含以下序列：

FAM 5-’GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAAGAACCTGCACCCGTCCT-’3；

HEX 5-’GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAAGAACCTGCACCCGTCAC-’3；

COMMON 5-’GCATGGAAAGAAACTGAACAAAGAT-’3。

7.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述后续筛选操作还包括以下步骤：

f)对鉴定出含有OsNramp5^-18突变型基因的嵌合体单株，提取其每个穗子对应叶片的DNA进行DNA鉴定，选择含有该突变的穗子，并混收其种子；

g)对于混收的种子进行混播，然后分单株提取叶片并进行DNA鉴定，最终获得具有OsNramp5^-18突变型基因遗传表型的突变体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤f)中，所述DNA鉴定是利用已经设计的KASP分型引物进行鉴定；所述步骤g)中，所述DNA鉴定是利用已经设计的KASP分型引物进行鉴定。

9.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤a)中的非致死剂量是指将剂量控制在半致死剂量上下浮动20％的范围。

10.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中，将获得的M1代的植株分单株进行种植时以一定株数为一个群体，以每个群体为单位进行编号；后续步骤c)中，每个群体的叶片混合于一个离心管中提取DNA。

11.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤d)中，所述高深度靶向测序包括基于多重PCR扩增靶向捕获技术、基于液相探针捕获杂交的靶向捕获技术或第三代测序单分子靶向测序技术；

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述每个群体的株数为48株、96株或192株；株数为48株的单个群体其高深度靶向测序的测序深度大于2000重，株数为96株的单个群体其高深度靶向测序的测序深度大于5000重，株数为192株的单个群体其高深度靶向测序的测序深度大于10000重。

13.一种用于检测、筛选或获取水稻OsNramp5^-18突变型基因的突变体的KASP分型引物，其特征在于，所述KASP分型引物包含以下序列：

FAM 5-’GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAAGAACCTGCACCCGTCCT-’3；

HEX 5-’GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAAGAACCTGCACCCGTCAC-’3；

COMMON 5-’GCATGGAAAGAAACTGAACAAAGAT-’3。

14.一种水稻OsNramp5^-18突变型基因在作物分子辅助育种中的应用。

15.一种水稻OsNramp5^-18突变型基因或具有水稻OsNramp5^-18突变型基因的突变体在选育或制备镉低吸收表型水稻品种中的应用。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)以所述突变体为供体亲本，以其他任意水稻品种Y为受体亲本，进行杂交转育，获得F1种子；

3)播种BC1F1种子，分单株提取BC1F1群体DNA，用权利要求13所述的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsNramp5^-18突变型基因的单株，进行背景选择，选择与所述轮回亲本背景相似度最高的单株继续回交获得BC2F1种子；

4)播种BC2F1种子，分单株提取BC2F1群体DNA，用权利要求13所述的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsNramp5^-18突变型基因的单株，进行背景选择，选择与所述轮回亲本背景相似度最高的单株继续回交获得BC3F1种子；

5)播种BC3F1种子，分单株提取BC3F1群体DNA，用权利要求13所述的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsNramp5^-18突变型基因的单株，进行背景选择，选择与轮回亲本背景相似度最高的单株自交结实获得BC3F2种子；

6)播种BC3F2种子，分单株提取BC3F2群体DNA，用权利要求13所述的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsNramp5^-18突变型基因的单株，进行背景选择，选择与上述水稻品种Y遗传背景一致的单株Y-Nramp5^-18收种；获得镉低吸收表型水稻品种Y-Nramp5^-18。