CN110885837B

CN110885837B - 水稻OsRR22-1突变型基因及其鉴定方法、鉴定用KASP分型引物及应用

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Publication number: CN110885837B
Application number: CN201911223359.4A
Authority: CN
Inventors: 韶也; 余丽霞; 赵炳然; 李文建; 毛毕刚; 杜艳; 胡远艺; 彭彦; 唐丽; 李曜魁; 张丹; 袁隆平
Original assignee: Hunan Hybrid Rice Research Center
Current assignee: Hunan Hybrid Rice Research Center
Priority date: 2019-12-03
Filing date: 2019-12-03
Publication date: 2021-08-17
Anticipated expiration: 2039-12-03
Also published as: CN110885837A

Abstract

本发明公开了一种水稻OsRR22^‑1突变型基因，该OsRR22^‑1突变型基因相比日本晴水稻的OsRR22基因序列，包含有以下碱基缺失，即：在OsRR22基因的4138902位置(RAP_Locus)存在[G/‑]1个bp的缺失。同时公开了水稻OsRR22^‑1突变型基因在作物分子辅助育种中的应用以及在选育或制备耐盐表型水稻品种中的应用，取得了显著的技术效果。本发明还公开了用于检测、筛选或获取水稻OsRR22^‑1突变型基因的突变体的KASP分型引物，可对高深度靶向测序发现的SNP/Indel进行不同个体的精确分型，进一步提高现有创新种质筛查鉴定的准确性及效率。

Description

水稻OsRR22-1突变型基因及其鉴定方法、鉴定用KASP分型引物及应用

技术领域

本发明属于水稻诱变育种技术领域，尤其涉及一种水稻突变型基因及鉴定方法，还涉及鉴定用KASP分型引物及相关应用。

背景技术

以种子作为繁殖方式的禾谷类作物中，小麦和水稻是我国的主要粮食作物。随着国民经济和社会的迅速发展，人口增长与可耕地减少的矛盾日益突出。我国拥有大片含盐量不等的土壤，培育耐盐性提高的禾谷类作物可以增加我国的可耕地面积，提高粮食总产。

在禾谷类作物中，水稻的耐盐性较差，急需通过遗传改良的方法，培育耐盐性提高的新品种。通常大多采用诱变手段，在其后代中筛选耐盐性提高的变异材料；采用杂交育种方法，在其后代中筛选耐盐性提高的性状重组优良株系，也有通过花药培养方法获取耐盐性提高的株系的报道。本领域中急需获得耐盐性状的种质资源，以在我国滨海盐渍土上能够大量种植，有效利用有限资源。

种质资源是植物遗传育种的基础，诱变育种能产生丰富的遗传变异，造成的变异率是自然变异的成千上万倍。据世界原子能机构1985年统计，当时世界各国通过诱变方法就已经育成500多个品种，同时获得大量有价值的种质资源。但诱变育种也存在诸多明显的缺陷，其中最主要的是由于突变位置随机，并且只能在M2代才能选择目标突变体，这导致创新种质的准确性及效率都很低。

随着基因定点编辑技术在植物上的普及，该技术以其精准、高效、简便的特点有效地弥补了诱变育种的缺陷，正受到植物遗传育种界的青睐。尽管基因定点编辑技术克服了诱变育种的主要缺点，但基因定点编辑技术在植物上的应用，还需要通过转基因手段，而有些重要的植物转基因体系并不成熟，限制了基因定点编辑技术的应用。诱变育种是通过物理、化学手段，不借助转基因技术，大部分植物都能通过诱变获得稳定遗传的突变种质，因此诱变育种仍有其不可替代的优势。另外，诱变育种在植物中的应用历史悠久。1927年，Muller在第三次国际遗传学大会论述X-射线诱发果蝇产生大量变异，提出诱发突变改良植物。之后， Stadler首次证明X-射线可以诱发玉米和大麦突变。Nilsson-Ehle&Gustafsson(1930)利用X 射线辐照获得了茎秆坚硬、穗型紧密、直立型的大麦突变体。1934年，Tollenear利用X射线育成了第一个烟草突变品种“Chlorina”。1948年，印度利用X射线诱变育成抗干旱的棉花品种。1957年，中国农业科学院成立了我国第一个原子能农业利用研究室，随后各省也相继成立有关研究机构。20世纪60年代中期开始在水稻、小麦、大豆等主要作物上利用辐射诱变育成了新品种，在生产上得到了应用。20世纪70年代后期，植物辐射诱变育种开始应用于蔬菜、糖料、瓜果、饲料、药用和观赏植物育种。可见，诱变育种经过了长时间的检验，为世界植物的遗传育种做出了巨大贡献，不论是在科学界还是在产业界，已经成为一种被普遍接受的育种手段。

一直以来，诱变育种的通识是不对诱变当代(M1)进行突变选择，因为诱变引起的遗传变异多为隐性，并且是以嵌合体的形式存在于M1中。只有到诱变二代(M2)的分离群体中， M1产生的隐性变异才会以纯合的形式存在于M2的个体中，此时才能根据目标性状选择突变体。基于诱变育种仍具有不可替代的优势，我们希望能解决其选择到有益突变以及目标基因突变效率低的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种水稻 OsRR22^-1突变型基因，还提供一种效率高、准确性好、操作简便的从理化诱变样本中鉴定是否含水稻OsRR22^-1突变型基因的方法以及用于检测、筛选或获取水稻OsRR22^-1突变型基因的突变体的KASP分型引物，还相应提供一种水稻OsRR22^-1突变型基因在作物分子辅助育种中的应用以及水稻OsRR22^-1突变型基因或具有水稻OsRR22^-1突变型基因的突变体在选育或制备耐盐表型水稻品种中的应用，该应用能以一种节省人力物力、效率高、精度好的方式获得耐盐表型水稻品种。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种水稻OsRR22^-1突变型基因，所述 OsRR22^-1突变型基因相比日本晴水稻的OsRR22基因序列，包含有以下碱基缺失段，即：

在OsRR22基因的4138902位置(RAP_Locus)存在[G/-]1个bp的缺失，该缺失位于第3外显子内，即为水稻OsRR22基因第3外显子[G/-]1个bp的缺失基因型。

作为进一步优选的，上述水稻OsRR22^-1突变型基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或其截短序列，或与其有95％以上同源性的编码相同功能蛋白的特异性序列。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种从理化诱变样本中鉴定是否含上述水稻 OsRR22^-1突变型基因的方法，包括以下步骤：

a)通过非致死剂量的理化诱变方式对水稻进行诱变，获得水稻材料M1代；

b)将获得的M1代的植株分单株进行种植，并取各种植后单株上的叶片，将各单株的叶片混合；

c)对混合后的全部叶片材料提取出混池DNA；

d)对提取的混池DNA进行水稻OsRR22基因区域的高深度靶向测序；

e)将高深度靶向测序结果与所述水稻OsRR22^-1基因的相关序列进行比对，鉴定高深度靶向测序结果中的群体性DNA样品是否存在水稻OsRR22^-1基因；

如果含有水稻OsRR22^-1突变型基因则可进行后续筛选操作获得相应突变体，否则终止操作。

现今二代测序技术(NGS)以及最新的三代测序加速了遗传病、癌症等领域的研究，其本身也作为一种更为先进的基因检测手段逐步走进临床。在众多测序技术中，我们充分考虑灵活性与低成本，最终选用靶向测序技术，通过对基因组的目标区域进行高深度测序，将其转用于植物创新种质的快速筛查和鉴定，大大提高现有创新种质筛查的准确性及效率。

上述的方法，优选的，所述后续筛选操作还包括利用以下任意一种或多种方式对鉴定结果进行验证，验证样品中是否存在水稻OsRR22^-1突变型基因，所述验证方式具体包括：

e₁：数字PCR(即Digital PCR，dPCR)鉴定方式对全部植株进行检测；

e₂：通过KASP分型方式对每个单株进行分型鉴定；

e₃：通过一代测序方式对每个单株进行鉴定。

数字PCR是近年快速发展起来的新一代PCR技术，是一种核酸分子绝对定量技术，凭借其超高灵敏度，数字PCR系统可以很容易地定量分析低至0.01％的低频突变。由于数字PCR 是精确到DNA单个分子的绝对定量技术，所以具有超高的精准度，通过将数字PCR与高深度靶向测序技术相结合，能够对深度测序检测出的低频突变做出准确地验证，进一步提高现有创新种质筛查的准确性及效率。

KASP即竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAllele Specific PCR)是一种高通量已知SNP/Indel检测技术，基于终端荧光读数，双色荧光可以检测到同一位点的不同基因型。通过利用KASP技术对高深度靶向测序发现的SNP/Indel进行不同个体的高通量分型鉴定，又可进一步提高现有创新种质筛查的准确性及效率。

上述的方法，更优选的，所述验证方式包括以下两步：

1)先采用数字PCR鉴定方式对高深度靶向测序结果中的群体性DNA进行检测，鉴定群体性DNA样品中是否存在水稻OsRR22^-1突变型基因；若存在则执行以下第2)步，否则终止；

2)再针对数字PCR鉴定存在的SNP和/或Indel位点，利用KASP分型引物，对含有该突变的混池样本所对应的群体，分单株进行KASP基因分型，最终确定是否含有水稻OsRR22^-1突变型基因的嵌合体单株。

KASP作为一种高通量已知SNP/Indel检测技术，基于终端荧光读数，双色荧光可以检测到同一位点的不同基因型。通过利用数字PCR缩小候选区域群体，再利用KASP技术对高深度靶向测序发现的SNP/Indel进行不同个体的精确分型，可进一步提高现有创新种质筛查鉴定的准确性及效率。

上述的方法，优选的，所述KASP分型的分型引物包含以下序列：

FAM 5-’GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGGCACCATGAGTTATCCCT-’3；

HEX 5-’GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGGCACCATGAGTTATCCCC-’3；

COMMON 5-’TGTTATCAGTAAATGGAGAGACAAAGAC-’3。

上述的方法，优选的，所述后续筛选操作还包括以下步骤：

f)对每一株含有目的基因区域突变的嵌合体单株，提取其每个穗子对应叶片的DNA进行DNA鉴定，选择含有该突变的穗子，并混收其种子；

g)对于混收的种子(M2代)进行混播，然后分单株提取叶片并进行DNA鉴定，最终获得具有OsRR22^-1突变型基因遗传表型的突变体(M2单株)。

上述的方法，优选的，所述步骤f)中，所述DNA鉴定优选是利用已经设计的上述KASP 分型引物进行鉴定，但也可以是针对目标区域的一代测序鉴定；采用上述的KASP分型引物进行鉴定，能够更好地实现高通量、低成本和操作的便捷性。

上述的方法，优选的，所述步骤g)中，所述DNA鉴定优选是利用已经设计的上述KASP 分型引物进行鉴定，但也可以是针对目标区域的一代测序鉴定。采用上述的KASP分型引物进行鉴定，能够更好地实现高通量、低成本和操作的便捷性。

上述的方法，优选的，所述步骤a)中的理化诱变方式包括以下物理诱变、化学诱变方式中的一种或多种的组合：

所述物理诱变包括紫外线诱变、X射线诱变、γ射线诱变、β射线诱变、α射线诱变、高能粒子诱变、宇宙射线诱变、微重力诱变；物理诱变更容易产生Indel突变；

所述化学诱变包括烷化剂诱变、叠氮化物诱变、碱基类似物诱变、氯化锂诱变、抗生素诱变、嵌入染料诱变；化学诱变更容易产生SNP突变；

所述烷化剂诱变包括甲基环酸乙酯(EMS)诱变、硫酸二乙酯(DES)诱变、乙烯亚胺(EI)诱变。

上述的方法，优选的，所述步骤a)中的非致死剂量是指将剂量控制在半致死剂量上下浮动20％的范围。即将剂量控制在既能获得一定突变率、又能获得一定的活种子数量；例如为半致死剂量。通过对诱变方式剂量的控制能够协调突变效率与活种量之间的平衡关系。

上述的方法，优选的，所述步骤b)中，将获得的M1代的植株分单株进行种植时以任意株数为一个群体，以每个群体为单位进行编号；后续步骤c)中，每个群体的叶片混合于一个离心管中提取DNA，以使得每管的DNA都包含整个群体的遗传信息。通过这样的分组操作可以使测序时包含较大的样本量，然后再将大量样本混池，减少测序成本，再结合后面加测分型的KASP技术，最终实现高通量和低成本的有效平衡。

上述的方法，优选的，所述步骤d)中，所述水稻OsRR22基因区域包括水稻OsRR22基因的外显子区域或水稻OsRR22基因的非编码区(或者水稻基因组上其他感兴趣的区域，特别优选外显子区域)，所述高深度靶向测序包括基于多重PCR扩增靶向捕获技术、基于液相探针捕获杂交的靶向捕获技术或第三代测序单分子靶向测序技术；

所述高深度靶向测序的测序深度根据每个群体内的单株数量确定。

作为进一步的优选，所述每个群体的任意株数为48株、96株或192株；对其中每个单株取叶片时均选取同一单株不同部位的等量叶片。作为更进一步的优选，后续步骤d中，株数为48株的单个群体其高深度靶向测序的测序深度大于2000重，株数为96株的单个群体其高深度靶向测序的测序深度大于5000重，株数为192株的单个群体其高深度靶向测序的测序深度大于10000重。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种用于检测、筛选或获取水稻OsRR22^-1突变型基因的突变体的KASP分型引物，所述KASP分型引物包含以下序列：

FAM 5-’GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGGCACCATGAGTTATCCCT-’3；

HEX 5-’GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGGCACCATGAGTTATCCCC-’3；

COMMON 5-’TGTTATCAGTAAATGGAGAGACAAAGAC-’3。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种水稻OsRR22^-1突变型基因在作物分子辅助育种中的应用。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种水稻OsRR22^-1突变型基因或具有水稻OsRR22^-1突变型基因的突变体在选育或制备耐盐表型水稻品种中的应用。该应用优选具体包括以下步骤：

1)以所述突变体为供体亲本，以其他任意水稻品种Y(例如水稻华占或Y58s)为受体亲本，进行杂交转育，获得F1种子；

2)将F1种子群体播种后，选单株与上述轮回亲本水稻品种Y进行杂交获得BC1F1种子；

3)播种BC1F1种子，分单株提取BC1F1群体DNA，用上述的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsRR22^-1突变型基因的单株，进行背景选择，选择与所述轮回亲本背景相似度最高的单株继续回交获得BC2F1种子；

4)播种BC2F1种子，分单株提取BC2F1群体DNA，用上述的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsRR22^-1突变型基因的单株，进行背景选择，选择与所述轮回亲本背景相似度最高的单株继续回交获得BC3F1种子；

5)播种BC3F1种子，分单株提取BC3F1群体DNA，用上述的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsRR22^-1突变型基因的单株，进行背景选择，选择与轮回亲本背景相似度最高的单株自交结实获得BC3F2种子；

6)播种BC3F2种子，分单株提取BC3F2群体DNA，用上述的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsRR22^-1突变型基因的单株，进行背景选择，选择与上述水稻品种 Y遗传背景一致的单株Y-OsRR22^-1收种；获得耐盐表型水稻品种Y-OsRR22^-1。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1)本发明将高深度靶向测序技术创造性地结合靶向测序技术、数字PCR技术、KASP基因分型技术中的一种或多种，并创造性地转用于诱变育种突变筛查领域，实现了能在诱变 M1代即对目标基因的突变进行高通量精准选择，精确定位到含有目标基因突变的嵌合体单株；

2)基于本发明的鉴定方法及筛选方法，我们创造性地获得了水稻OsRR22^-1突变型基因，同时提出了水稻OsRR22^-1突变型基因在作物分子辅助育种中的应用以及在选育或制备耐盐表型水稻品种中的应用，取得了显著的技术效果，并最终获得了耐盐表型的水稻品种；

3)本发明设计的用于检测、筛选或获取水稻OsRR22^-1突变型基因的突变体的KASP分型引物，可以对高深度靶向测序发现的SNP/Indel进行不同个体的精确分型，可进一步提高现有创新种质筛查鉴定的准确性及效率；

4)本发明的技术方案不仅节省了繁殖一代所需的时间成本，而且解决了繁殖一代后，群体数量大量增加，所造成的土地、人力以及突变选择成本太高的问题，具有显著的进步意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明从理化诱变样本中鉴定是否含上述水稻OsRR22^-1突变型基因的方法的流程简图。

图2为本发明实施例1中利用KASP分型引物对26号群体分型后的结果。

图3为本发明实施例2中突变体华占-OsRR22^-1与华占(WT)同时发苗的对比照片。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

一种水稻OsRR22^-1突变型基因，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。从北京擎科新业生物技术有限公司检测结果来看，该水稻OsRR22^-1突变型基因为水稻OsRR22基因第3外显子[G/-]1个bp(4138902位置)的缺失基因型。

一种如图1所示从理化诱变样本中鉴定是否含上述水稻OsRR22^-1突变型基因的方法，包括以下步骤：

1.用80MeV/u碳离子(¹²C⁶⁺)以180Gy的剂量照射两万粒水稻品种638S的种子，获得水稻品种638S(以下简称638S)的M1代。

2.将两万粒638S M1代的种子育秧后的植株分单株进行种植。以96株为一个群体，每个群体8行，每行12株，种植100个群体，共9600株，并对每个群体进行编号1-100。

3.以每个群体为单位，对其中每个单株取等量叶片，共96等份混合于1个离心管中提取DNA，共提取100份DNA，DNA编号对应每个群体编号1-100。

4.以每个群体的DNA为一个测序样本，针对OsRR22基因(Os06g0183100)的外显子区域进行靶向高深度测序，测序深度>5000重。

5.将高深度靶向测序数据比对日本晴序列，获得100个样本中OsRR22基因外显子存在的SNP与Indel数据。经北京擎科新业生物技术有限公司检测发现第26号样本中，在OsRR22 基因的4138902位置(RAP_Locus)存在[G/-]1个bp的缺失，该缺失位于第3外显子内。

6.采用数字PCR技术对上述第26号群体样本测序数据中存在的Indel进行验证，验证结果表明样本中均存在靶向测序数据中的缺失突变基因型，即存在本发明的水稻OsRR22^-1基因。

7.根据第26号群体样本中DNA存在的缺失突变基因型，设计一种KASP分型引物如下 (北京擎科新业生物技术有限公司生产)：

FAM 5-’GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGGCACCATGAGTTATCCCT-’3 (SEQ ID NO.2所示，下划线部分表示荧光标签引物)；

HEX 5-’GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGGCACCATGAGTTATCCCC-’3 (SEQ ID NO.3所示，下划线部分表示荧光标签引物)；

COMMON 5-’TGTTATCAGTAAATGGAGAGACAAAGAC-’3(SEQ ID NO.4所示)；。

8.利用缺失突变位点的KASP分型引物，对26号群体的96个单株进行分型，分型的具体操作如下：

(1)CTAB法提取水稻叶片DNA；

(2)KASP分型体系5μl：

(3)PCR反应程序

经分型后发现26号群体里的1排第7株(26-A-7)含有OsRR22基因第3外显子[G/-]1个bp的缺失基因型(参见图2)，最终获得1株目标基因缺失突变的M1代单株，即OsRR22 基因移码突变嵌合体26-A-7。

9.取26-A-7单株上每个穗子上对应的叶片提取DNA，针对单株存在的Indel突变进行测序检测，发现26-A-7单株中有2个穗子含有[G/-]突变基因型。以单株为单位混收含有突变基因型穗子的种子。

10.将26-A-7单株混收的种子进行播种，并用上述第7步中设计的KASP引物对单株进行分型，最终在26-A-7的M2群体中获得OsRR22^-1突变型基因遗传表型的突变体。

实施例2：

一种水稻OsRR22^-1突变型基因或实施例1中获得的具有水稻OsRR22^-1突变型基因的突变体在选育、制备耐盐表型水稻品种中的应用，具体包括以下步骤：

1)以实施例1获得的具有OsRR22^-1突变型基因遗传表型的突变体为供体亲本，以水稻华占为受体亲本，进行杂交转育，获得F1种子；

2)将F1种子群体播种后，选单株与轮回亲本水稻华占进行杂交获得BC1F1种子；

3)播种BC1F1种子，分单株提取BC1F1群体DNA，用实施例1中设计的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsRR22^-1突变型基因的单株，进行背景选择，选择与所述轮回亲本背景相似度最高的单株继续回交获得BC2F1种子；

4)播种BC2F1种子，分单株提取BC2F1群体DNA，用实施例1中设计的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsRR22^-1突变型基因的单株，进行背景选择，选择与所述轮回亲本背景相似度最高的单株继续回交获得BC3F1种子；

5)播种BC3F1种子，分单株提取BC3F1群体DNA，用实施例1中设计的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsRR22^-1突变型基因的单株，进行背景选择，选择与轮回亲本背景相似度最高的单株自交结实获得BC3F2种子；

6)播种BC3F2种子，分单株提取BC3F2群体DNA，用实施例1中设计的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsRR22^-1突变型基因的单株，进行背景选择，选择与水稻华占遗传背景一致的单株华占-OsRR22^-1收种；获得图3所示的耐盐表型水稻品种华占-OsRR22^-1。

将本实施例获得的突变体华占-OsRR22^-1与华占(WT)同时发苗，在水稻苗三叶一心期时，置于浓度为0.8％的氯化钠水溶液连续胁迫处理10天后拍照，突变体与对照组分别取10 株，用纯水冲洗干净，吸干水分后，测量其根长，株高，苗鲜重，检测结果如下表1所示。

表1：华占-OsRR22^-1与华占(WT)耐盐测试对比结果

样品	根长(mm)	株高(mm)	苗鲜重(g)
				华占(WT)	89.37±2.31	109.10±1.42	0.17±0.01
华占-OsRR22<sup>-1</sup>	108±4.12	118±4.22	0.25±0.01

由表1结果可见，华占(WT)胁迫处理10天后枯死，而突变体华占-OsRR22^-1仍能正常生长，根长、株高、苗鲜重也显著高于华占(WT)，说明突变体华占-OsRR22^-1在盐胁迫下的生长势显著强于野生型对照。

序列表

<110> 湖南杂交水稻研究中心

<120> 水稻OsRR22-1突变型基因及其鉴定方法、鉴定用KASP分型引物及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5414

<212> DNA

<213> 水稻 (Oryza sativa L.)

<400> 1

catcagtcca ctcatcccca tgcccccctc attctgatcc tttataaatc agccacccag 60

caagacattc ctttccaacc tcactcacct tgctctagct cagctagctc ttgctgctag 120

tagcttcagc tttgctactg ctactaccac tactactact actactttca cctccaagaa 180

agtatagatt gcaagaacaa tttctgctgc tgttgttctt tcttgctgtt ctttctcctt 240

gtgtagttgt gtggtgtggt tgagctgagg tgtagttagg acagtggctg gctttgcttg 300

cttgattggt cacctgggaa ggtcgctgtc tctgcctttt gttttctttg ccatctcttt 360

ctttctgggc tgctttcacc ttttgctttc caacctcttc ttgccatcaa taatgatgga 420

ggagtaagat gagggcttgt tcttgaagtc tctccaatct aatctcattt catcttcatc 480

atctccaccc ggtccaaatc cacctactac tgtttttctt ttgtcccttc tctttttttt 540

cttcctctga tcttttcttt tttcaggtgt tttgtttttg gcagtaggtg cttgctatct 600

tttcattagg ctttggattt tcctctcgtg ttctttagtc tcagcctatt agaggtttga 660

ggaaagtttt ccatttctta gctctttttg cttccagctt cttgggattg ctctgtttct 720

tgctgagaat tggctcgatt tgggaggcct catcttgtgt tagctttcag gttttcttgc 780

ctgaaattga accgattggg taggttttta ggtgcttcag tttcagttgc tagctcgtca 840

ggcttgttct tgggctcctg ccttgaattg gggtcaaatt gggatgcttc tgggtgcttt 900

gaggatggag gagaggaagg gattgatggg gagggagagg gatcaattcc ccgtcggcat 960

gcgggtcctc gccgtcgacg atgacccggt gtgcctcaag gttcttgaga ccctcctccg 1020

gcgctgccaa taccatggtc agtatttaca gtaaccgcag ctaattgtac ttccattatc 1080

agctatccat gatgctcaac ttgctggttt ttttgttcga ttctgcatgt taatgacagt 1140

gttgttcttt tgcttctgct tgcattgttc attgttgtat tggagtactg tagttttctt 1200

agaaatctga aatgtcactg atactagcat acttggcaca ttttagaact tctgtatatc 1260

ttataaatgc aatgcaatat gcctactatg gtgcactgat aagagctctc ttatggtgat 1320

ttttaacagt aacatcaacc aaccaggcta ttactgcgtt gaagctgctc agggagaaca 1380

gggacatgtt tgatcttgtc atcagtgatg tccacatgcc cgacatggac ggatttaagc 1440

tccttgagct tgtggggctt gaaatggatc tcccagtcat cagtaagttc agattttcat 1500

tttttcccct tagtacaaac aaagttctag ataggaagga tcagctgttg tgtaaaaatg 1560

tcttagctga atttgagcaa aagaaatgga gatgctaatc gggtataatg cctgcagtgt 1620

tatcagtaaa tggagagaca aagactgtga tgaagggata actcatggtg cctgtgacta 1680

tcttctaaaa ccggtccgaa tcgaagaact aaggaacata tggcagcatg ttgttaggag 1740

gaagttcggt aatcgtgagc gaaacaatct tgatttctcc aaagaatgca ataagccgca 1800

aagcgcggat actgatcatg gaccatacca acctacctgt ggttcttctg atcaaaatgg 1860

gaggtccagc aggaaaagga aagaactaca cggcgaggac gacgatgaag gcgatgataa 1920

tgattatcaa gaaaatgatg agccctcagc tgcaaagaag cccagagttg tatggtcagt 1980

tgagctgcac cgaaaatttg ttgccgctgt caaccagctt ggaattgaca gtaagaaagc 2040

accccccccc ccaccccact tttttgcctt tctgtaaatg tccttgcagg tttgcagcaa 2100

actcatttat gtttgtgtcc tttttttttt tttacctcac tgttgatgca gaagctgtac 2160

caaaaagaat tcttgagctt atgaatgtgg agaaactcac cagggaaaat gttgcaagtc 2220

atctacaggt atagcattta cttccatgac aaaattatct gggtgccttt tttttttctt 2280

ttctttttat ccattcatga gagctcttga attttgctca accgtcatcc tttacatgtt 2340

cttctgtacc ttcagttgtt gatgcgtttt tacttcagtt tatgaggtcg tccatcattc 2400

attcattcat caggcctgca caaagtgaca gaaaatctct tatcattata catgttgcaa 2460

atgctgatgc tgcacagcat cgagaattca agattccacc acatggttgt ctgaactctg 2520

aaaaactcac cattttatca catcatttac tcaacctgca cagaaatgta gtacaacaaa 2580

cttcagatca ggattgatcc acacagactg cacattttct tccctgatgc aaaattatca 2640

tcgatcccga tgaacaccat cgaatcaaag cttcatccac catttgattt catcaatgaa 2700

atggaggagt ctgcacctga gcacacacgg ccacacagca tatgtagctg ggtagacctt 2760

cactctacca gagtaagcga tccaggcggc ctcgatggcg ccgccgcggc tcaaactggc 2820

cggcctcgtc gctgtggcag cgggccagct aggggatggc ggcggcgcag gggctccggc 2880

gatgggatct gaatccaaac agcagagagg gttttggttg agttgccact gaactgaacc 2940

tgcatatatt ttggtcatcc atatctgaaa aatgtgcaat acttcagatg tttagatcag 3000

tatttcctcc aaattcttgc aaatattttc ttcggctcac gaaattcttg ttagcattgt 3060

tggttgtgaa gtggcacacc tataatcatg tttgaatttg actcagtctc tcatcacctt 3120

ttatttagtg ttgatgcagt aagagtacta gaacagagct gatgtttcct actactttca 3180

tggctagcta gaattttatg gtgtcataca ggataaattg aacgaggttc caccatttta 3240

tctttgttgt tcatatgcaa ctagatttta ttaaactgtt gaaatgcaag aatgtgcaaa 3300

catctcgtat gacaaatcct aaacaatgtg ctatctaaat ctgaaaatag gtgatttgct 3360

gtttaaaaac tcaagtccat atctaatcag ttgattttca tgtgacatgc agaagtacag 3420

gctttacctc aagagactag gtgctgtagc atcacaacaa gccagcattg ttgctgcctt 3480

tggaggcaga gatccctcct tcttgcatat tggagcattt gaaggactcc agagctatca 3540

accttttgca ccttctgctg ctcttccatc tttcaatcca catggcctgc taacccgaac 3600

tagcgccgcc gcggctttcg gacttcagga gcttgctgcc ccctccagca caattcagac 3660

ttctacagga aatgtcacag ttggccattg cttggaagaa aaccagcagg caaatctagc 3720

acaaggcttg accgcggcga tcgggcaacc tcagcttcaa cagaactgga ttcatcaaga 3780

aggtaatggt ctgtctgatg ttttttctgg gagttctctg accaacactt tgtccagcac 3840

actccaaaga gttccaagca gttcattgcc accacaagaa ctcttggagt gcaaacaagc 3900

caaagttagc atgccgccat cgatacggat accgccttct agttcagcac ttcttgagag 3960

gactcttggg gtttccacca atttgggaga ttctagtata tcccagcagg gtgctcttcc 4020

aatagatggt ggattttctg ctgacaggtt accattgcac agttcatttg atggcgctgt 4080

tgcaacaaag ctagatacta gtttggcagc ttcacagaga gagattggcc agcaggggaa 4140

attttcagtt agcatgcttg tctccccttc tgacaatctt gcattagcca aaaatgccaa 4200

aactggagct agttcttctg gcagtactat aattctccct cttgatactg caagacattc 4260

agactacttg cagttcggag gtgcaagcaa ttctttgcag aaaatggatg gacagaaaca 4320

agatcatata cagagctcaa acattatatg gagttcaatg ccaagcactc aactgccaag 4380

tgatacccaa attcataata ctcaaaacca aagattggac agcggaagtt ttaaccataa 4440

tattggtgcc catttggctg accaaacaaa tgcaagtgcg tcaatacttc cgcaaatgaa 4500

gtttgacaca agaatatcag aagagaaaat gaagcagaag aatacatatg acttgggtag 4560

ttcaaagctg cagggtggat ttaattctag tggctgcaat tttgatggcc ttctcaattc 4620

cataatcaaa gtggtatgaa cctctaattt tcctttcctt tttccccata tagttttaaa 4680

tatttatcta catgaatatg ctcttccttc tcattgagta atttaaattg actccactgt 4740

atttaagcac aaagaacaaa ggccactcta aatattaagc tgtaaacagt tgtaacctac 4800

acataaacag gatatgccta gcagtaccta atatttgcat tttccatctt gttttatatt 4860

atagaaatgt tcttgagcca catttaactt ggttctaact tatctaatct ccatgggact 4920

ttaccttttg catatattct tctgaaagaa atgatggttt actgaagcct taattctaat 4980

tccaatgcag gagaaggatg atctcccatt catggacaat gaattgggct gtgacctttt 5040

tccacttggt gcctgcatat gaatccatca tttcggacac caaagatttt gcataatcta 5100

aaagagtcag ctgtgctgcc tgatctgtgc tacttcatcc aggctttgtg tatactagga 5160

tctagggaca gtagtggctt gtaatcttgc tttatctctt ctctagggtt ggctatggaa 5220

gtatggttag atcaagataa gaagaaaata taatgctgta atgtcagcgc cttttctagt 5280

caaaatctgt gtttgtttct aaccaagcaa ccacatctag tgtttgctgc accttctcag 5340

actgaaaaaa tatggaaact caccatggca tagataaatc aaaagggaag tctttaacca 5400

tccaagtttg ctac 5414

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc tcaggcacca tgagttatcc ct 42

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaggtcgga gtcaacggat tcaggcacca tgagttatcc cc 42

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgttatcagt aaatggagag acaaagac 28

Claims

1.一种从理化诱变样本中鉴定是否含水稻OsRR22 ^-1突变型基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a）通过非致死剂量的理化诱变方式对水稻进行诱变，获得水稻材料M1代；

b）将获得的M1代的植株分单株进行种植，并取各种植后单株上的叶片，将各单株的叶片混合；

c）对混合后的全部叶片材料提取出混池DNA；

d）对提取的混池DNA进行水稻OsRR22基因区域的高深度靶向测序；

e）将高深度靶向测序结果与所述水稻OsRR22 ^-1突变型基因的相关序列进行比对，鉴定高深度靶向测序结果中的群体性DNA样品是否存在水稻OsRR22 ^-1突变型基因；

如果含有水稻OsRR22 ^-1突变型基因则可进行后续筛选操作获得相应突变体，否则终止操作；

所述后续筛选操作还包括利用以下任意一种或多种方式对所述步骤e）的鉴定结果进行验证，验证样品中是否存在水稻OsRR22 ^-1突变型基因，所述验证方式具体包括：

e₁：数字PCR鉴定方式对全部植株进行检测验证；

e₂：通过KASP分型方式对每个单株进行分型验证；

e₃：通过一代测序方式对每个单株进行验证；

所述OsRR22 ^-1突变型基因相比日本晴水稻的OsRR22基因序列，包含有以下碱基缺失，即：

在日本晴水稻第6号染色体的4138902位置存在[G/-]1个bp的缺失；

所述的水稻OsRR22 ^-1突变型基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述验证方式具体包括：

e₁：数字PCR鉴定方式对全部植株进行检测验证；

e₂：通过KASP分型方式对每个单株进行分型验证。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述验证方式包括以下两步：

1）先采用数字PCR鉴定方式对高深度靶向测序结果中的群体性DNA进行检测，鉴定群体性DNA样品中是否存在OsRR22 ^-1基因的目标SNP和/或Indel；若存在则执行以下第2）步，否则终止；

2）再针对数字PCR鉴定存在的SNP和/或Indel位点，利用KASP分型引物，对含有该突变的混池样本所对应的群体，分单株进行KASP基因分型，最终确定是否含有水稻OsRR22 ^-1突变型基因的嵌合体单株。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述KASP分型的分型引物包含以下序列：

FAM 5-’GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGGCACCATGAGTTATCCCT-’3；

HEX 5-’GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGGCACCATGAGTTATCCCC-’3；

COMMON 5-’TGTTATCAGTAAATGGAGAGACAAAGAC-’3。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述后续筛选操作还包括以下步骤：

f）对鉴定出含有OsRR22 ^-1突变型基因的嵌合体单株，提取其每个穗子对应叶片的DNA进行DNA鉴定，选择含有该突变的穗子，并混收其种子；

g）对于混收的种子进行混播，然后分单株提取叶片并进行DNA鉴定，最终获得具有OsRR22 ^-1突变型基因遗传表型的突变体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤f）中，所述DNA鉴定是利用已经设计的KASP分型引物进行鉴定；所述步骤g）中，所述DNA鉴定是利用已经设计的KASP分型引物进行鉴定。

7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤a）中的非致死剂量是指将剂量控制在半致死剂量上下浮动20%的范围。

8.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤b）中，将获得的M1代的植株分单株进行种植时以一定株数为一个群体，以每个群体为单位进行编号；后续步骤c中，每个群体的叶片混合于一个离心管中提取DNA。

9.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤d）中，所述高深度靶向测序包括基于多重PCR扩增靶向捕获技术、基于液相探针捕获杂交的靶向捕获技术或第三代测序单分子靶向测序技术；

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述每个群体的株数为48株、96株或192株；株数为48株的单个群体其高深度靶向测序的测序深度大于2000重，株数为96株的单个群体其高深度靶向测序的测序深度大于5000重，株数为192株的单个群体其高深度靶向测序的测序深度大于10000重。

11.一种如权利要求1-10任一项方法筛选得到的水稻OsRR22 ^-1突变型基因在作物分子辅助育种中的应用。

12.一种如权利要求1-10任一项方法筛选得到的水稻OsRR22 ^-1突变型基因在选育或制备耐盐表型水稻品种中的应用。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：

1）以所述突变体为供体亲本，以其他任意水稻品种Y为受体亲本，进行杂交转育，获得F1种子；

2）将F1种子群体播种后，选单株与上述轮回亲本水稻品种Y进行杂交获得BC1F1种子；

3）播种BC1F1种子，分单株提取BC1F1群体DNA，用权利要求4中所述的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsRR22 ^-1突变型基因的单株，进行背景选择，选择与所述轮回亲本背景相似度最高的单株继续回交获得BC2F1种子；

4）播种BC2F1种子，分单株提取BC2F1群体DNA，用权利要求4中所述的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsRR22 ^-1突变型基因的单株，进行背景选择，选择与所述轮回亲本背景相似度最高的单株继续回交获得BC3F1种子；

5）播种BC3F1种子，分单株提取BC3F1群体DNA，用权利要求4中所述的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsRR22 ^-1突变型基因的单株，进行背景选择，选择与轮回亲本背景相似度最高的单株自交结实获得BC3F2种子；

6）播种BC3F2种子，分单株提取BC3F2群体DNA，用权利要求4中所述的KASP分型引物标记进行前景选择，对含有水稻OsRR22 ^-1突变型基因的单株，进行背景选择，选择与上述水稻品种Y遗传背景一致的单株Y- OsRR22 ^-1收种；获得耐盐表型水稻品种Y- OsRR22 ^-1。