JP7503134B2 - 物理的及び化学的突然変異誘発植物のｍ１世代突然変異を同定する方法、と突然変異体を取得する方法、及びイネの突然変異同定用のタイピングプライマー、突然変異遺伝子及び使用 - Google Patents
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Description
本発明は、植物突然変異体同定の分野に属し、特に物理的及び化学的突然変異誘発植物の突然変異体を同定する方法、と突然変異体を取得する方法に関し、さらに関連する突然変異用タイピングプライマーおよび取得されたイネ突然変異遺伝子と使用に関する。
種子によって繁殖する禾穀類作物の中で、小麦とイネは中国の主な食糧用作物である。国民経済と社会の急速な発展に伴い、人口増加と耕作可能地の縮小との矛盾がますます顕著になっている。中国にはさまざまな塩分を含む広大な土壌があり、耐塩性が向上した禾穀類作物を栽培すると、中国の耕作可能地の面積が増え、総食料生産量が増える可能性がある。禾穀類作物の中で、イネは耐塩性が低く、遺伝的改良により耐塩性が向上した新品種の栽培が急務となっている。通常、子孫のうちに耐塩性が改善された突然変異材料をスクリーニングするために突然変異誘発が主に使用され、ハイブリッド育種法を用いて、子孫のうちに耐塩性が改善された形質組換え優れた株をスクリーニングし、葯培養法によって耐塩性が改善された株を取得する報告もある。この分野では、中国の沿岸塩性土壌に大量に植え付け、限られた資源を有効に活用するために、耐塩性形質のための生殖質資源を取得することが急務となっている。また、近年、「カドミウム米」事件が相次いで発生しており、米の品質も注目されている。重金属Ｃｄは、毒性が高く累積的な腎毒性および発がん性物質であり、米Ｃｄは、主食として食べる人々によるＣｄ摂取の主な源である。特許文献１は、低カドミウムイネのスクリーニング方法を開示し、対照として湘晩汕１２号を選択し、野外植栽と鉢植えの二重実験を行い、軽度、中度、重度のカドミウム汚染の３つのスクリーニング条件を設定し、スクリーニングされた低カドミウムイネの品種／系統の低カドミウム特性は包括的で安定している。低カドミウムイネの育種方法は先行技術で報告されているが、それらは主に環境ストレス条件下での品種スクリーニングに焦点を合わせ、突然変異誘発育種と分子育種による低カドミウムイネのスクリーニングに関する報告はほとんどない。したがって、カドミウムの蓄積が少ない新種のイネの選択と育種を強化することは、安全で栄養価の高い安全な農産物の産業開発を促進するのにさらに役立つ。
生殖質資源は植物遺伝と育種の基礎であり、突然変異誘発育種は豊富な遺伝的変異を生み出し、結果として生じる変異率は、自然変異の数千乃至万倍である。１９８５年の国際原子力機関の統計によると、当時、世界各国で５００以上の品種が突然変異誘発によって育てられ、同時に多くの貴重な生殖質資源が得られた。しかし、突然変異誘発育種にも多くの明らかな欠陥があり、その中で最も重要なのは、突然変異の位置がランダムであり、かつターゲット突然変異体はＭ２世代でのみ選択できるため、革新的な生殖質資源の精度と効率が低くなることである。
植物における遺伝子指向編集技術の普及により、この技術は、その正確で効率的かつ単純な特性で突然変異誘発育種の欠陥を効果的に補い、植物遺伝学および育種コミュニティによって支持されている。遺伝子指向編集技術は突然変異誘発育種の主な欠点を克服するが、植物への遺伝子指向編集技術の適用には依然としてトランスジェニック手段が必要であるが、いくつかの重要な植物トランスジェニックシステムは未成熟であり、遺伝子指向編集技術の適用を制限する。突然変異誘発育種は、トランスジェニック技術の助けを借りずに、物理的および化学的手段を介して行われ、ほとんどの植物は突然変異誘発によって安定して遺伝する突然変異生殖質を得ることができるので、突然変異誘発育種には依然としてかけがえのない利点がある。さらに、植物における突然変異誘発育種の適用には長い歴史がある。１９２７年、Ｍｕｌｌｅｒは第３回国際遺伝学会議で、Ｘ線がショウジョウバエに多数の突然変異を引き起こすことを議論し、植物を改善するために突然変異を誘発することを提案した。その後、Ｓｔａｄｌｅｒは、Ｘ線がトウモロコシと大麦に突然変異を誘発する可能性があることを初めて実証した。Ｎｉｌｓｓｏｎ－Ｅｈｌｅ＆Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ（１９３０）は、Ｘ線照射により、茎がしっかりしていて、穂がコンパクトで、直立型の大麦変異体を取得した。１９３４年、ＴｏｌｌｅｎｅａｒはＸ線を使用して最初の突然変異タバコ品種「Ｃｈｌｏｒｉｎａ」を育てた。１９４８年、インドはＸ線突然変異誘発を使用して、干ばつに強い綿の品種を育てた。１９５７年、中国農業科学院は、中国で最初の原子能農業利用研究室を設立し、その後、各省も次々と関連する研究機構を設立した。１９６０年代半ばには、イネ、コムギ、大豆などの主要作物において放射線突然変異誘発によって新品種が育てられ、生産に使用された。１９７０年代後半に、植物放射線突然変異誘発育種は、野菜、砂糖、メロンと果物、飼料、薬用および観賞用植物育種に適用され始めた。突然変異誘発育種は長い間テストされており、世界の植物の遺伝子育種に多大な貢献をし、これは、科学と産業の両方で一般的に受け入れられている育種方法になっていることがわかる。
突然変異誘発によって引き起こされる遺伝的変異はほとんど劣性であり、Ｍ１にキメラの形で存在するため、長い間、突然変異誘発育種の一般的な知識は、突然変異誘発世代（Ｍ１）に対して突然変異選択を行われないことである。第二世代の突然変異誘発（Ｍ２）の分離集団においてのみ、Ｍ１によって生成された劣性突然変異がホモ接合性の形でＭ２の個体に存在し、その後、突然変異体はターゲット特性に従って選択することができる。突然変異誘発育種のかけがえのない利点に基づいて、有益な突然変異の選択とターゲット遺伝子突然変異の低効率の問題を解決したいと考えている。
本発明によって解決されるべき技術的問題は、上記の背景技術で言及された不足および欠陥を克服し、高効率、正確、および使いやすい物理的及び化学的突然変異誘発植物のＭ１世代突然変異のハイスループットターゲット同定方法を提供し、人的資源と材料資源を節約でき、効率と精度が高い物理的及び化学的突然変異誘発植物のＭ１世代突然変異のハイスループットターゲット同定方法と突然変異体の取得方法もそれに応じて提供し、そしてそれに応じて、さまざまなイネ突然変異遺伝子及びイネ突然変異遺伝子の突然変異体の検出、スクリーニング、または取得用のＫＡＳＰタイピングプライマーを提供する。
上記の技術的問題を解決するために、本発明によって提供される技術的解決手段は、物理的及び化学的突然変異誘発植物のＭ１世代突然変異のハイスループットターゲット同定方法であり、
非致死量の物理化学的突然変異誘発によって植物を突然変異誘発して、植物材料のＭ１世代を得るステップ（ａ）と、
得られたＭ１世代の植物を個体植物に分けて植え、植えた後の各個体植物の葉を取り、各個体植物の葉を混合するステップ（ｂ）と、
得られたＭ１世代の植物を個体植物に分けて植え、植えた後の各個体植物の葉を取り、各個体植物の葉を混合するステップ（ｂ）と、
混合後のすべての葉から混合プールＤＮＡを抽出するステップ（ｃ）と、
抽出された混合プールのＤＮＡに対して、ターゲット遺伝子領域の高深度ターゲットシーケンスを実行するステップ（ｄ）と、
高深度ターゲットシーケンス結果をターゲット遺伝子領域の関連配列と比較し、高深度ターゲットシーケンス結果で、集団ＤＮＡサンプルのターゲット遺伝子領域にターゲットＳＮＰ及び／又はＩｎｄｅｌが存在するかどうかを同定するステップ（ｅ）と、を含む。
抽出された混合プールのＤＮＡに対して、ターゲット遺伝子領域の高深度ターゲットシーケンスを実行するステップ（ｄ）と、
高深度ターゲットシーケンス結果をターゲット遺伝子領域の関連配列と比較し、高深度ターゲットシーケンス結果で、集団ＤＮＡサンプルのターゲット遺伝子領域にターゲットＳＮＰ及び／又はＩｎｄｅｌが存在するかどうかを同定するステップ（ｅ）と、を含む。
今日の次世代シーケンス技術（ＮＧＳ）と最新の第３世代シーケンスは、遺伝病や癌の分野での研究を加速させ、また、より高度な遺伝子検査法として徐々に臨床に参入している。多くのシーケンス技術の中から、柔軟性と低コストを十分に考慮し、最終的にターゲットシーケンス技術を選択し、ゲノムのターゲット領域への高深度シーケンスにより、植物の革新的な生殖質の迅速なスクリーニングと同定に移行し、これにより、既存の革新的な生殖質のスクリーニングの精度と効率が大幅に向上する。
上記の方法は、好ましくは、前記ステップ（ｅ）での同定が終了した後、以下の方法のいずれか１つまたは複数を使用して同定結果を検証し、サンプルのターゲット遺伝子領域にターゲットＳＮＰ及び／又はＩｎｄｅｌが存在することを検証することも含み、前記検証方法は具体的には、
すべての植物を検出するためのデジタルＰＣＲ（すなわち、Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ、ｄＰＣＲ）同定方法ｅ１と、
ＫＡＳＰタイピング方法による各個体植物のタイピング同定ｅ２と、
一世代シーケンス方法による各個体植物の同定ｅ３と、を含む。
すべての植物を検出するためのデジタルＰＣＲ（すなわち、Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ、ｄＰＣＲ）同定方法ｅ１と、
ＫＡＳＰタイピング方法による各個体植物のタイピング同定ｅ２と、
一世代シーケンス方法による各個体植物の同定ｅ３と、を含む。
デジタルＰＣＲは、近年急速に発展している新世代のＰＣＲ技術であり、核酸分子の絶対定量技術であり、超高感度のデジタルＰＣＲシステムは、０．０１％までの低頻度の突然変異を簡単に定量化できる。デジタルＰＣＲは、ＤＮＡの単一分子に対して正確な絶対定量技術であるため、超高精度であり、デジタルＰＣＲと高深度ターゲットシーケンス技術を組み合わせることにより、深度シーケンスによって検出された低頻度の突然変異を正確に検証でき、既存の革新的な生殖質スクリーニングの精度と効率をさらに向上させることができる。
ＫＡＳＰ即ち競合する対立遺伝子特異性ＰＣＲ（Ｋｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ Ａｌｌｅｌｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ）はハイスループットの既知のＳＮＰ／Ｉｎｄｅｌ検出技術であり、ターミナル蛍光の読み取りに基づいて、二色蛍光は同じ遺伝子座で異なる遺伝子型を検出できる。ＫＡＳＰ技術を使用して、ハイスループットのタイピングと、高深度ターゲットシーケンスによって発見されたＳＮＰ／Ｉｎｄｅｌに対してさまざまな個体のハイスループットタイピング同定を実行することにより、既存の革新的な生殖質スクリーニングの精度と効率をさらに向上させることができる。
上記の方法は、好ましくは、前記ステップ（ｅ）において、採用された具体的な同定方法は、
まず、デジタルＰＣＲ同定方法を使用して、高深度ターゲットシーケンス結果での集団ＤＮＡを検出し、集団ＤＮＡサンプルのターゲット遺伝子領域にターゲットＳＮＰ及び／又はＩｎｄｅｌがあるかどうかを同定し、存在する場合に、次のステップ（２）を実行し、存在しない場合に終了するステップ（１）と、
まず、デジタルＰＣＲ同定方法を使用して、高深度ターゲットシーケンス結果での集団ＤＮＡを検出し、集団ＤＮＡサンプルのターゲット遺伝子領域にターゲットＳＮＰ及び／又はＩｎｄｅｌがあるかどうかを同定し、存在する場合に、次のステップ（２）を実行し、存在しない場合に終了するステップ（１）と、
次に、デジタルＰＣＲによって存在するＳＮＰ及び／又はＩｎｄｅｌ部位を同定し、ＫＡＳＰタイピングプライマーを設計し、該突然変異を含む混合プールサンプルに対応する集団に対して個体植物を分けてＫＡＳＰジェノタイピングを実行し、ターゲット遺伝子領域に突然変異キメラ個体植物を含むかどうかを最終決定するステップ（２）と、を含む。
ＫＡＳＰは、ハイスループットの既知のＳＮＰ／Ｉｎｄｅｌ検出技術であり、ターミナル蛍光の読み取りに基づいて、二色蛍光は同じ遺伝子座で異なる遺伝子型を検出できる。デジタルＰＣＲを使用して候補領域の集団を絞り込み、次にＫＡＳＰ技術を使用して、高深度ターゲットシーケンスによって発見されたＳＮＰ／Ｉｎｄｅｌに対してさまざまな個体の正確なタイピングを行うことにより、既存の革新的な生殖質スクリーニングの精度と効率をさらに向上させることができる。
上記の方法は、好ましくは、前記ターゲット遺伝子領域の関連配列は、イネのＯｓＮｒａｍｐ５遺伝子の遺伝子配列であり、ＯｓＮｒａｍｐ５遺伝子の８８７５６４６－８８７５６６３の位置では、９番目のエクソンに位置する開始塩基に［ＣＣＴＡＣＧＴＧＧＣＡＡＴＴＣＡＣＡ／－］１８個ｂｐの欠失があることに対して、前記ＫＡＳＰタイピングプライマーには次の配列が含まれている。
ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＴＣＣＴ－’３、
ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＴＣＡＣ－’３、
ＣＯＭＭＯＮ ５－’ＧＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＡＡＣＡＡＡＧＡＴ－’３。
上記の方法は、好ましくは、前記ターゲット遺伝子領域の関連配列は、イネのＯｓＲＲ２２遺伝子の遺伝子配列であり、ＯｓＲＲ２２遺伝子の４１３８９０２位置では、３番目のエクソン内に［Ｇ／－］１個ｂｐの欠失があることに対して、前記ＫＡＳＰタイピングプライマーには次の配列が含まれている。
ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＴＡＴＣＣＣＴ－’３、
ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＴＡＴＣＣＣＣ－’３、
ＣＯＭＭＯＮ ５－’ＴＧＴＴＡＴＣＡＧＴＡＡＡＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＣ－’３。
上記の方法は、好ましくは、前記ターゲット遺伝子領域の関連配列は、イネのＯｓＲＲ２２遺伝子の遺伝子配列であり、ＯｓＲＲ２２遺伝子の４１４０８６１－４１４０８６７位置では、５番目のエクソン内に［ＣＧＧＣＴＴＴ／－］７個ｂｐの欠失があることに対して、前記ＫＡＳＰタイピングプライマーには次の配列が含まれている。
ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＡＡ－’３、
ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＣＧ－’３、
ＣＯＭＭＯＮ ５－’ＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＡ－’３。
上記の方法は、好ましくは、前記ステップ（ａ）の非致死量とは、半致死量の上下２０％の範囲内で量を制御することを指す。この量制御は、特定の突然変異率を取得できるだけでなく、特定の生きている種子の数を取得することもでき、たとえば、特に好ましい半致死量である。突然変異誘発方法の投与量を制御することにより、突然変異効率と生きている種子の数とのバランスを調和させることができる。
上記の方法は、好ましくは、前記ステップ（ａ）の物理的及び化学的突然変異誘発方法は、
紫外線突然変異誘発、Ｘ線突然変異誘発、ガンマ線突然変異誘発、ベータ線突然変異誘発、アルファ線突然変異誘発、高エネルギー粒子突然変異誘発、宇宙線突然変異誘発、および微小重力突然変異誘発が含まれる、Ｉｎｄｅｌ突然変異を起こしやすい物理的突然変異誘発方法と、
紫外線突然変異誘発、Ｘ線突然変異誘発、ガンマ線突然変異誘発、ベータ線突然変異誘発、アルファ線突然変異誘発、高エネルギー粒子突然変異誘発、宇宙線突然変異誘発、および微小重力突然変異誘発が含まれる、Ｉｎｄｅｌ突然変異を起こしやすい物理的突然変異誘発方法と、
エチルメチルシクロエート（ＥＭＳ）突然変異誘発、硫酸ジエチル（ＤＥＳ）突然変異誘発、エチレンイミン（ＥＩ）突然変異誘発が含まれるアルキル化剤突然変異誘発、アジド突然変異誘発、塩基類似体突然変異誘発、塩化リチウム突然変異誘発、抗生物質突然変異誘発、挿入色素突然変異誘発が含まれる、ＳＮＰ突然変異を起こしやすい化学的突然変異誘発方法との１つまたは複数の組み合わせを含む。
上記の方法は、好ましくは、前記ステップ（ｂ）において、得られたＭ１世代の植物を個体植物に分けて植える場合、任意の数の植物を１つの集団として、各集団を単位で番号付け、次のステップ（ｃ）では、各集団の葉を１つの遠心分離管で混合してＤＮＡを抽出するため、各管のＤＮＡにはすべて集団全体の遺伝子情報を含有させる。このようなグループ化操作により、大きなサンプルサイズをシーケンスに含めることができ、次に大量のサンプルをプールしてシーケンスのコストを削減し、次に追加のテストとタイピングのためのＫＡＳＰ技術と組み合わせることで、ハイスループットと低コストの効果的なバランスが最終的に達成される。
さらに好ましくは、前記１つの集団内の任意の株数は、４８株、９６株、または１９２株であり、そのうちの各個体植物から葉をとるときに、すべて同じ個体植物の異なる部分から同じ量の葉を選択する。さらに好ましくは、次のステップ（ｄ）では、４８株の単一集団の高深度ターゲットシーケンスのシーケンス深度は２０００×を超え、９６株の単一集団の高深度ターゲットシーケンスのシーケンス深度は５０００×を超え、１９２株の単一集団の高深度ターゲットシーケンスのシーケンス深度は１００００×を超える。
上記の方法は、好ましくは、前記ステップ（ｄ）において、前記ターゲット遺伝子領域は、ターゲット遺伝子のエキソン領域またはターゲット遺伝子の非コード領域（または植物ゲノム上の他の関心のある領域、特に好ましくはエキソニック領域）を含み、前記高深度ターゲットシーケンスには、マルチプレックスＰＣＲ増幅に基づくターゲットキャプチャテクノロジー、液相プローブキャプチャーハイブリダイゼーションに基づくターゲットキャプチャーテクノロジー、または第３世代シーケンス単一分子ターゲットシーケンステクノロジーが含まれ、
前記高深度ターゲットシーケンスのシーケンス深度は、各集団内の個体植物の数に応じて決定される。
本発明の実施例の実験データから、本発明の上記の方法は、イネ、ソルガム、トウモロコシ、さらには野菜などの様々な植物に適用することができるが、行ったいくつかの実験によれば、好ましくは、前記ターゲット遺伝子はイネＯｓＮｒａｍｐ５遺伝子またはイネＯｓＲＲ２２遺伝子である。後の試験の結果に基づいて、より多くの植物のより多くの遺伝子型に適用できることを除外しない。
一般的な技術的概念として、本発明はまた、上記の方法によって物理的及び化学的突然変異誘発によってイネのＭ１世代突然変異を同定するときに、得られたイネ突然変異遺伝子を提供し、前記イネ突然変異遺伝子は、イネＯｓＮｒａｍｐ５－１８突然変異遺伝子、イネＯｓＲＲ２２－１突然変異遺伝子、またはイネＯｓＲＲ２２－７突然変異遺伝子であり、
日本晴イネのＯｓＮｒａｍｐ５遺伝子配列と比較して、前記イネＯｓＮｒａｍｐ５－１８突然変異遺伝子は、８８７５６４６－８８７５６６３位置（ＲＡＰ＿Ｌｏｃｕｓ）で９番目のエクソンに［ＣＣＴＡＣＧＴＧＧＣＡＡＴＴＣＡＣＡ／－］１８個ｂｐの欠失があるという塩基欠失セグメントを含み、
日本晴イネのＯｓＲＲ２２遺伝子配列と比較すると、前記イネＯｓＲＲ２２－１突然変異遺伝子は、ＯｓＲＲ２２遺伝子の４１３８９０２位置（ＲＡＰ＿Ｌｏｃｕｓ）の３番目のエクソンに［Ｇ／－］１個ｂｐの欠失があるという塩基欠失を含み、
日本晴イネのＯｓＲＲ２２遺伝子配列と比較すると、前記イネＯｓＲＲ２２－７突然変異遺伝子は、４１４０８６１－４１４０８６７位置（ＲＡＰ＿Ｌｏｃｕｓ）の５番目のエクソンに［ＣＧＧＣＴＴＴ／－］７個ｂｐの欠失があるという塩基欠失セグメントを含む。
日本晴イネのＯｓＲＲ２２遺伝子配列と比較すると、前記イネＯｓＲＲ２２－７突然変異遺伝子は、４１４０８６１－４１４０８６７位置（ＲＡＰ＿Ｌｏｃｕｓ）の５番目のエクソンに［ＣＧＧＣＴＴＴ／－］７個ｂｐの欠失があるという塩基欠失セグメントを含む。
上記のイネ突然変異遺伝子、より好ましくは、前記イネＯｓＮｒａｍｐ５－１８突然変異遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９に示すヌクレオチド配列、又はその短縮配列、または９５％以上の相同性を持つ同じ機能性タンパク質をコードする特定の配列を持って、
前記イネＯｓＲＲ２２－１突然変異遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０に示すヌクレオチド配列、又はその短縮配列、または９５％以上の相同性を持つ同じ機能性タンパク質をコードする特定の配列を持って、
前記イネＯｓＲＲ２２－７突然変異遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１に示すヌクレオチド配列、又はその短縮配列、または９５％以上の相同性を持つ同じ機能性タンパク質をコードする特定の配列を持っている。
一般的な技術的概念として、本発明はまた、作物の分子支援育種における上記のイネ突然変異遺伝子の使用を提供する。
上記の使用では、好ましくは、前記イネ突然変異遺伝子がイネＯｓＮｒａｍｐ５－１８突然変異遺伝子である場合、前記イネＯｓＮｒａｍｐ５－１８突然変異遺伝子またはイネＯｓＮｒａｍｐ５－１８突然変異遺伝子を有する突然変異体を、カドミウム低吸収表現型イネ品種の育種または調製に使用し、
前記イネ突然変異遺伝子がイネＯｓＲＲ２２－１突然変異遺伝子またはイネＯｓＲＲ２２－７突然変異遺伝子である場合、前記イネＯｓＲＲ２２－１、ＯｓＲＲ２２－７突然変異遺伝子またはイネＯｓＲＲ２２－１、ＯｓＲＲ２２－７突然変異遺伝子を有する突然変異体を耐塩性表現型イネ品種の育種または調製に使用する。
一般的な技術的概念として、本発明はまた、物理的及び化学的突然変異誘発Ｍ１世代の突然変異をハイスループットターゲット同定する方法および突然変異体を取得する方法を提供し、本発明の上記の方法により、ターゲット遺伝子領域の突然変異を含むキメラの個体植物を同定することに基づいて、以下のステップを実行し続ける。
（ｆ）ターゲット遺伝子領域の突然変異を含むキメラ個体植物ごとに、各穗の対応する葉のＤＮＡを抽出してＤＮＡ同定を行い、該突然変異を含む穗を選択し、その種子を混合収集する。
（ｇ）混合収集された種子（Ｍ２世代）を混合播種した後、個体植物から葉を抽出し、ＤＮＡ同定を行って、最終的にターゲット遺伝子表現型を持つＭ２個体植物を取得する。
上記の方法は、好ましくは、前記ターゲット遺伝子領域の突然変異を含むキメラ個体植物とは、イネＯｓＮｒａｍｐ５－１８突然変異遺伝子、イネＯｓＲＲ２２－１突然変異遺伝子、またはイネＯｓＲＲ２２－７突然変異遺伝子を含むキメラ個体植物を指し、
日本晴イネのＯｓＮｒａｍｐ５遺伝子配列と比較して、前記イネＯｓＮｒａｍｐ５－１８突然変異遺伝子は、８８７５６４６－８８７５６６３位置（ＲＡＰ＿Ｌｏｃｕｓ）で９番目のエクソンに［ＣＣＴＡＣＧＴＧＧＣＡＡＴＴＣＡＣＡ／－］１８個ｂｐの欠失があるという塩基欠失セグメントを含み、
日本晴イネのＯｓＲＲ２２遺伝子配列と比較すると、前記イネＯｓＲＲ２２－１突然変異遺伝子は、ＯｓＲＲ２２遺伝子の４１３８９０２位置（ＲＡＰ＿Ｌｏｃｕｓ）の３番目のエクソンに［Ｇ／－］１個ｂｐの欠失があるという塩基欠失を含み、
日本晴イネのＯｓＲＲ２２遺伝子配列と比較すると、前記イネＯｓＲＲ２２－７突然変異遺伝子は、４１４０８６１－４１４０８６７位置（ＲＡＰ＿Ｌｏｃｕｓ）の５番目のエクソンに［ＣＧＧＣＴＴＴ／－］７個ｂｐの欠失があるという塩基欠失セグメントを含む。
上記の方法は、好ましくは、前記ステップ（ｆ）では、前記ＤＮＡ同定は、好ましくは設計されたＫＡＳＰタイピングプライマーを利用して同定することであるが、ターゲット領域を対象とした一世代シーケンス同定であってもよく、上記のＫＡＳＰタイピングプライマーを同定に使用すると、ハイスループット、低コスト、操作の利便性をよりよく達成できる。
前記ステップ（ｇ）では、前記ＤＮＡ同定は、好ましくは設計されたＫＡＳＰタイピングプライマーを利用して同定することであるが、ターゲット領域を対象とした一世代シーケンス同定であってもよい。上記のＫＡＳＰタイピングプライマーを同定に使用すると、ハイスループット、低コスト、操作の利便性をよりよく達成できる。
一般的な技術的概念として、本発明はまた、上記の方法において、イネの突然変異体を同定する又は取得するためのＫＡＳＰタイピングプライマーを提供し、前記ＫＡＳＰタイピングプライマーには、
イネＯｓＮｒａｍｐ５－１８突然変異遺伝子を同定または取得するためのプライマーペア１
ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＴＣＣＴ－’３、
ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＴＣＡＣ－’３、
ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＴＣＣＴ－’３、
ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＴＣＡＣ－’３、
ＣＯＭＭＯＮ ５－’ＧＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＡＡＣＡＡＡＧＡＴ－’３、と、
イネＯｓＲＲ２２－１突然変異遺伝子を同定または取得するためのプライマーペア２
ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＴＡＴＣＣＣＴ－’３、
ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＴＡＴＣＣＣＣ－’３、
イネＯｓＲＲ２２－１突然変異遺伝子を同定または取得するためのプライマーペア２
ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＴＡＴＣＣＣＴ－’３、
ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＴＡＴＣＣＣＣ－’３、
ＣＯＭＭＯＮ ５－’ＴＧＴＴＡＴＣＡＧＴＡＡＡＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＣ－’３、と、
イネＯｓＲＲ２２－７突然変異遺伝子を同定または取得するプライマーペア３
ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＡＡ－’３、
ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＣＧ－’３、
ＣＯＭＭＯＮ ５－’ＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＡ－’３と、を含むプライマーペアのいずれか１つが含まれる。
イネＯｓＲＲ２２－７突然変異遺伝子を同定または取得するプライマーペア３
ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＡＡ－’３、
ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＣＧ－’３、
ＣＯＭＭＯＮ ５－’ＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＡ－’３と、を含むプライマーペアのいずれか１つが含まれる。
従来技術と比較して、本発明の利点は以下のとおりである。
本発明は、高深度ターゲットシーケンス技術を、ターゲットシーケンス技術、デジタルＰＣＲ技術およびＫＡＳＰジェノタイピング技術の１つまたは複数と創造的に組み合わせ、且つそれを突然変異誘発育種のための突然変異スクリーニングの分野に創造的に移し、突然変異誘発Ｍ１世代では、ターゲット遺伝子突然変異のハイスループットで正確な選択を実現でき、ターゲット遺伝子突然変異を含むキメラ個体植物を正確に特定することができる。本発明の技術的解決手段は、一世代の繁殖に必要な時間と費用を節約するだけでなく、一世代の繁殖後に集団数が大幅に増加すると、土地、人員、突然変異の選択にかかるコストが高すぎるという問題を解決し、革新的な生殖質の同定と取得には、著しい進歩意義を有する。
本発明は、高深度ターゲットシーケンス技術を、ターゲットシーケンス技術、デジタルＰＣＲ技術およびＫＡＳＰジェノタイピング技術の１つまたは複数と創造的に組み合わせ、且つそれを突然変異誘発育種のための突然変異スクリーニングの分野に創造的に移し、突然変異誘発Ｍ１世代では、ターゲット遺伝子突然変異のハイスループットで正確な選択を実現でき、ターゲット遺伝子突然変異を含むキメラ個体植物を正確に特定することができる。本発明の技術的解決手段は、一世代の繁殖に必要な時間と費用を節約するだけでなく、一世代の繁殖後に集団数が大幅に増加すると、土地、人員、突然変異の選択にかかるコストが高すぎるという問題を解決し、革新的な生殖質の同定と取得には、著しい進歩意義を有する。
本発明の同定方法およびスクリーニング方法に基づいて、発明者らはまた、イネＯｓＮｒａｍｐ５－１８突然変異遺伝子、イネＯｓＲＲ２２－１突然変異遺伝子およびイネＯｓＲＲ２２－７突然変異遺伝子を創造的に得て、同時に、作物の分子支援育種および低カドミウム吸収表現型および耐塩性表現型を有するイネ品種の選択または調製における前述の突然変異遺伝子の使用を提供し、顕著な技術的効果が達成され、最終的に低カドミウム吸収表現型イネ品種と耐塩性表現型イネ品種が得られた。
さらに、本発明で設計されたイネ突然変異遺伝子の突然変異体を検出、スクリーニング、または取得するためのＫＡＳＰタイピングプライマーは、高深度ターゲットシーケンスによって発見されたＳＮＰ／Ｉｎｄｅｌに対してさまざまな個体の正確なタイピングを行い、既存の革新的な生殖質スクリーニング同定の精度と効率をさらに向上させることができる。
本発明の技術的解決手段は、一世代の繁殖に必要な時間と費用を節約するだけでなく、一世代の繁殖後に集団数が大幅に増加すると、土地、人員、突然変異の選択にかかるコストが高すぎるという問題を解決し、著しい進歩意義を有する。
本発明の実施例または先行技術における技術的解決手段をより明確に説明するために、以下は、実施例または先行技術の説明において使用される必要がある添付の図面を簡単に紹介し、明らかに、以下の説明の図面は、本発明のいくつかの実施例であり、当業者にとって、他の図面もまた、創造的な努力なしにこれらの図面から得ることができる。
本発明の理解を容易にするために、本発明を添付の図面および本明細書の好ましい実施例を参照して以下により包括的かつ詳細に説明するが、本発明の保護範囲は以下の具体的な実施例に限定されない。
別の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。 本明細書で使用される専門用語は、具体的な実施例を説明することのみを目的としており、本発明の保護範囲を限定することを意図するものではない。
特に明記しない限り、本発明で使用される様々な原材料、試薬、器具および装置等はすべて、市場から購入することができ、または既存の方法によって調製することができる。
実施例１：
図１に示されるような本発明の物理的及び化学的突然変異誘発植物Ｍ１世代の突然変異のハイスループットターゲット同定方法および突然変異体の取得方法は、具体的には、以下のステップを含む。
図１に示されるような本発明の物理的及び化学的突然変異誘発植物Ｍ１世代の突然変異のハイスループットターゲット同定方法および突然変異体の取得方法は、具体的には、以下のステップを含む。
１．８０ＭｅＶ／ｕの炭素イオン（１２Ｃ６＋）を用いて１８０Ｇｙの線量でイネ品種６３８Ｓの２０，０００種子を照射して、Ｍ１世代のイネ品種６３８Ｓ（以下６３８Ｓと呼ばれる）を得た。
２．６３８ＳＭ１世代の２０，０００の種子を育苗した後の植物を個体植物に分けて、植え、９６株を１つの集団、各集団に８行、各行に１２株、１００の集団、合計９６００株を植え、かつ各集団に１～１００の番号を付けた。
３．各集団を１つの単位とし、各個体植物から等量の葉を取り、合計９６等分を１つの遠心分離管で混合してＤＮＡを抽出し、合計１００個のＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ番号は各集団番号１～１００に対応した。
４．各集団のＤＮＡを１つのシーケンスサンプルとして使用して、ＯｓＮｒａｍｐ５遺伝子（Ｏｓ０７ｇ０２５７２００）およびＯｓＲＲ２２遺伝子（Ｏｓ０６ｇ０１８３１００）遺伝子のエクソン領域でターゲット高深度シーケンスを実行し、シーケンス深度＞５０００×であった。
５．高深度ターゲットシーケンスデータを日本晴配列と比較し、１００個サンプルのＯｓＮｒａｍｐ５遺伝子およびＯｓＲＲ２２遺伝子エクソンに存在するＳＮＰおよびＩｎｄｅｌデータを取得し、検出後、サンプル３２番号では、ＯｓＮｒａｍｐ５遺伝子の８８７５６４６－８８７５６６３位置（ＲＡＰ＿Ｌｏｃｕｓ）に［ＣＣＴＡＣＧＴＧＧＣＡＡＴＴＣＡＣＡ／－］１８個ｂｐの欠失があることがわかり、該欠失は９番目のエクソンの開始塩基に１個ｂｐを持って、検出後、サンプル２６番号には、３番目のエクソン内にあるＯｓＲＲ２２遺伝子の４１３８９０２（ＲＡＰ＿Ｌｏｃｕｓ）の位置に［Ｇ／－］１ｂｐの欠失があることもわかり、検出後、サンプル３４番号は５番目のエクソン内にあるＯｓＲＲ２２遺伝子の４１４８０６１－４１４０８６７位置（ＲＡＰ＿Ｌｏｃｕｓ）に［ＣＧＧＣＴＴＴ／－］７個ｂｐの欠失があることもわかった。
６．デジタルＰＣＲ技術を使用して、上記の集団サンプル番号 ３２、２６、および３４のシーケンスデータに存在するＩｎｄｅｌを検証し、検証結果は、ターゲットシーケンスデータの欠失突然変異遺伝子型が３つのサンプルすべてに存在することを示した。
７．３２、２６、３４番号の集団サンプルのＤＮＡの欠失突然変異遺伝子型に従って、ＫＡＳＰタイピングプライマーを次のように設計した（北京Qing科新業生物技術有限公司製）
３２ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＴＣＣＴ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
３２ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＴＣＡＣ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
３２ＣＯＭＭＯＮ ５－’ＧＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＡＡＣＡＡＡＧＡＴ－’３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示す）、
２６ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＴＡＴＣＣＣＴ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
２６ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＴＡＴＣＣＣＣ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
２６ＣＯＭＭＯＮ ５－’ＴＧＴＴＡＴＣＡＧＴＡＡＡＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＣ－’３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示す）、
３４ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＡＡ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
３４ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＣＧ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
３４ＣＯＭＭＯＮ ５－’ＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＡ－’３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９に示す）。
３２ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＴＣＣＴ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
３２ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＴＣＡＣ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
３２ＣＯＭＭＯＮ ５－’ＧＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＡＡＣＡＡＡＧＡＴ－’３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示す）、
２６ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＴＡＴＣＣＣＴ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
２６ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＴＡＴＣＣＣＣ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
２６ＣＯＭＭＯＮ ５－’ＴＧＴＴＡＴＣＡＧＴＡＡＡＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＣ－’３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示す）、
３４ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＡＡ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
３４ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＣＧ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
３４ＣＯＭＭＯＮ ５－’ＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＡ－’３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９に示す）。
８．３つの欠失突然変異部位を持つＫＡＳＰタイピングプライマーを使用して、それぞれ３２、２６、および３４の集団の９６＊３＝２８８個の個体植物をタイピングし、タイピング後、集団３２番号の４行目の５番目の株（３２－Ｄ－５）には、ＯｓＮｒａｍｐ５遺伝子の９番目のエクソン［ＣＣＴＡＣＧＴＧＧＣＡＡＴＴＣＡＣＡ／－］の１８個ｂｐの欠失遺伝子型が含まれていることがわかり（図２を参照）、また、集団２６番号の１行目の７番目の株（２６－Ａ－７）には、ＯｓＲＲ２２遺伝子の３番目のエクソン［Ｇ／－］の１個ｂｐの欠失遺伝子型が含まれていることがわかり（図３を参照）、さらに、集団３４番号の３行目の６番目の株（３４－Ｃ－６）には、ＯｓＲＲ２２遺伝子の５番目のエクソン［ＣＧＧＣＴＴＴ／－］に７個ｂｐの欠失遺伝子型が含まれていることがわかった（図４を参照）。最後に、１つのＯｓＮｒａｍｐ５遺伝子フレームシフト突然変異キメラ３２－Ｄ－５、および２つのＯｓＲＲ２２遺伝子フレームシフト突然変異キメラ２６－Ａ－７および３４－Ｃ－６を含む、ターゲット遺伝子の欠失突然変異を伴うＭ１世代の３つの個体植物が得られた。
欠失突然変異部位のＫＡＳＰタイピングプライマーを使用して、３２、２６、および３４の集団で９６＊３＝２８８個の個体植物をタイピングするための具体的な操作は次のとおりである。
（１）ＣＴＡＢ法によるイネの葉からのＤＮＡの抽出。
（２）ＫＡＳＰタイピングシステム５μｌ
ＦＡＭ－Ｘ １０μＭ ０．１５μｌ
ＨＥＸ－Ｙ １０μＭ ０．１５μｌ
ＣＯＭＭＯＮ １０μＭ ０．３μｌ
ＫＡＳＰ ＭＩＸ ２．５μｌ
サンプルＤＮＡ １０ｎｇ－１００ｎｇ
Ｈ２Ｏ ５μｌまで水を補充し
（２）ＫＡＳＰタイピングシステム５μｌ
ＦＡＭ－Ｘ １０μＭ ０．１５μｌ
ＨＥＸ－Ｙ １０μＭ ０．１５μｌ
ＣＯＭＭＯＮ １０μＭ ０．３μｌ
ＫＡＳＰ ＭＩＸ ２．５μｌ
サンプルＤＮＡ １０ｎｇ－１００ｎｇ
Ｈ２Ｏ ５μｌまで水を補充し
（３）ＰＣＲ反応プログラム
９．３２－Ｄ－５、２６－Ａ－７、３４－Ｃ－６の個体植物の各穗の対応する葉からＤＮＡを抽出し、個体植物におけるＩｎｄｅｌ変異に対してシーケンス検出を行い、３２－Ｄ－５個体植物の３つの穗は［ＣＣＴＡＣＧＴＧＧＣＡＡＴＴＣＡＣＡ／－］変異遺伝子型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９に示す）を含み、２６－Ａ－７個体植物の２つの穗は［Ｇ／－］変異遺伝子型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０に示す）を含み、３４－Ｃ－６個体植物の４つの穗は［ＣＧＧＣＴＴＴ／－］変異遺伝子型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１に示す）を含むことがわかった。個体植物を単位として変異遺伝子型穗を含む種子を混合収穫した。
１０．３２－Ｄ－５、２６－Ａ－７、３４－Ｃ－６という混合収穫種子を３つの集団に分けて播種し、そして、上記のステップ７で設計されたＫＡＳＰプライマーを使用して、個体植物をタイピングし、最終的に３２－Ｄ－５のＭ２集団でカドミウム低吸収表現型の６３８Ｓ－３２－Ｄ－５が得られ、２６－Ａ－７、３４－Ｃ－６集団のＭ２集団で耐塩性表現型の６３８Ｓ－２６－Ａ－７および６３８Ｓ－３４－Ｃ－６が得られた。
実施例２
図１に示されるような本発明の物理的及び化学的突然変異誘発植物Ｍ１世代の突然変異のハイスループットターゲット同定方法および突然変異体の取得方法は、具体的には以下のステップを含む。
図１に示されるような本発明の物理的及び化学的突然変異誘発植物Ｍ１世代の突然変異のハイスループットターゲット同定方法および突然変異体の取得方法は、具体的には以下のステップを含む。
１．イネ品種華航３１の種子を２０，０００個取り、２８℃の恒温インキュベーターで１６時間浄水に浸し、種子をすくい上げ、水分を乾燥させた。種子を１％（ｗ／ｗ）メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）溶液に、２８℃の恒温インキュベーターで８時間再度浸し、種子をすくい上げ、水分を乾燥させた。浄水で種子をすすぎ、８回に水を交換した後、３７℃で発芽を促進して播種して苗を育てた後に植え、９６株を１つの集団、各集団に８行、各行に１２株、１００の集団、合計９６００株を植え、かつ各集団に１～１００の番号を付けた。
２．各集団を１つの単位とし、各個体植物から等量の葉を取り、合計９６等分を１つの遠心分離管で混合してＤＮＡを抽出し、合計１００個のＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ番号は各集団番号１～１００に対応した。
３．各集団のＤＮＡを１つのシーケンスサンプルとして使用して、ＯｓＢＡＤＨ２（Ｏｓ０８ｇ０４２４５００）遺伝子のエクソン領域でターゲット高深度シーケンスを実行し、シーケンス深度＞５０００×であった。
４．高深度ターゲットシーケンスデータを日本晴配列と比較し、１００個サンプルの ＯｓＢＡＤＨ２遺伝子エクソンに存在するＳＮＰおよびＩｎｄｅｌデータを取得し、検出後、サンプル７２番号では、ＯｓＢＡＤＨ２遺伝子の２０３８１４４５位置（ＲＡＰ＿Ｌｏｃｕｓ）に［Ｇ／Ａ］の一塩基突然変異があることがわかり、この変異により、１０９番号のアミノ酸がＴｒｐからターミネーターに変化し、ＯｓＢＡＤＨ２遺伝子によってコードされるタンパク質が早期に停止した。
５．上記集団サンプル７２番号のシーケンスデータのＳＮＰをデジタルＰＣＲ技術で検証した結果、ターゲットシーケンスデータのＳＮＰ遺伝子型がこのサンプルに存在することがわかった。
６．集団サンプル７２番号のＤＮＡに存在するＳＮＰ遺伝子型によると、ＫＡＳＰタイピングプライマーを次のように設計した。
７２ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＴＣＴＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＴＧ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
７２ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＧＡＡＧＣＣＴＣＴＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＴＡ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
７２ＣＯＭＭＯＮ ５－’ＣＡＡＣＡＴＣＧＴＣＣＴＧＡＣＡＡＡＴＧＧＡＡＴ－’３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２に示す）。
７２ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＴＣＴＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＴＧ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
７２ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＧＡＡＧＣＣＴＣＴＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＴＡ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
７２ＣＯＭＭＯＮ ５－’ＣＡＡＣＡＴＣＧＴＣＣＴＧＡＣＡＡＡＴＧＧＡＡＴ－’３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２に示す）。
７．上記で設計されたＫＡＳＰタイピングプライマーを使用して、それぞれ集団７２番号の９６個の個体植物をタイピングした。タイピング後、集団７２番号の７行目３株（７２－Ｇ－３）には、ＯｓＢＡＤＨ２遺伝子の３番目のエクソン［Ｇ／Ａ］一塩基変異遺伝子型が含まれていることがわかった。最後に、ターゲット遺伝子の早期終結突然変異を有するＭ１世代の個体植物７２－Ｇ－３が得られた。
８．７２－Ｇ－３個体植物の各穗の対応する葉からＤＮＡを抽出し、個体植物におけるＳＮＰ変異に対してシーケンス検出を行い、７２－Ｇ－３個体植物の３つの穂には［Ｇ／Ａ］一塩基変異遺伝子型が含まれていることがわかり、変異遺伝子型の穂を含む種子を混合収穫した。
９．７２－Ｇ－３個体植物に混合収穫された種子を、育苗した後に個体に植え、そして、上記のステップ６で設計されたＫＡＳＰプライマーを使用して、個体植物をタイピングし、最終的に７２－Ｇ－３のＭ２集団で米の香りの表現型を持つ華航３１－７２－Ｇ－３が得られた。
実施例３：
図１に示されるような本発明の物理的及び化学的突然変異誘発植物Ｍ１世代の突然変異のハイスループットターゲット同定方法および突然変異体の取得方法は、具体的には以下のステップを含む。
図１に示されるような本発明の物理的及び化学的突然変異誘発植物Ｍ１世代の突然変異のハイスループットターゲット同定方法および突然変異体の取得方法は、具体的には以下のステップを含む。
１．６０Ｃｏ－γ射線を用いて３５０Ｇｙの線量でイネ品種華占の１０万種子を照射して、Ｍ１世代のイネ品種華占を得た。
２．華占Ｍ１世代の１０万種子を育苗した後、９６株を１つの集団、各集団に８行、各行に１２株、５００の集団、合計４８０００株を植え、かつ各集団に１～５００の番号を付けた。
３．各集団を１つの単位とし、各個体植物から等量の葉を取り、合計９６等分を１つの遠心分離管で混合してＤＮＡを抽出し、合計５００個のＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ番号は各集団番号１～５００に対応した。
４．各集団のＤＮＡを１つのシーケンスサンプルとして使用して、Ｏｓ１１Ｎ３遺伝子（Ｏｓ１１ｇ０５０８６００）およびＯｓ８Ｎ３遺伝子（Ｏｓ０８ｇ０５３５２００）の遺伝子調節領域における斑点細菌病原菌のＴＡＬエフェクター結合領域に対してターゲット高深度シーケンスを行い、シーケンス深度＞５０００×であった。
５．高深度ターゲットシーケンスデータを日本晴配列と比較し、５００個サンプルのＯｓ１１Ｎ３遺伝子およびＯｓ８Ｎ３遺伝子調節領域における斑点細菌病原菌ＴＡＬエフェクター結合領域に存在するＳＮＰ及びＩｎｄｅｌデータを取得した。検出後、サンプル２６１番号では、Ｏｓ１１Ｎ３遺伝子の１８１７４４７６－１８１７４４９７位置（ＲＡＰ＿Ｌｏｃｕｓ）に［ｃｃａａｃｃａｇｇｔｇｃｔａａｇｃｔｃａｔｃ／－］２２個ｂｐの欠失があることがわかり、検出後、サンプル３８５番号はＯｓ８Ｎ３遺伝子の２６７２８８３７－２６７２８８７０位置（ＲＡＰ＿Ｌｏｃｕｓ）に［ｔｃｔｃｃｃｃｃｔａｃｔｇｔａｃａｃｃａｃｃａａａａｇｔｇｇａｇｇｇ／－］３４個ｂｐの欠失があることもわかった。
６．デジタルＰＣＲ技術を使用して、上記のサンプル番号 ２６１、３８５のサンプルシーケンスデータに存在するＩｎｄｅｌを検証し、検証結果は、ターゲットシーケンスデータの欠失突然変異遺伝子型が３つのサンプルすべてに存在することを示した。
７．２６１、３８５番号の集団サンプルのＤＮＡの欠失突然変異遺伝子型に従って、ＫＡＳＰタイピングプライマーを次のように設計した。
２６１ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴｔｃｃｔａｇｃａｃｔａｔａｔａａａｃｃｃｃｃｔｃ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
２６１ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴｔｃｃｔａｇｃａｃｔａｔａｔａａａｃｃｃｃｃｔＡ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
２６１ＣＯＭＭＯＮ ５－’ｃｔｔｇａｇｔｔｔｇｃｔｔｔｇｃｔｔｇａａｇｇｃ－’３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５に示す）、
３８５ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＴＧＴＴＴＡＴＡＴＡＧＴＴＧＧＡＧＡＣ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
３８５ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴｇｇｃｔｃａｇｔｇｔｔｔａｔａｔａｇｔｔｇｇａｇａ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
３８５ＣＯＭＭＯＮ ５－’ｇａａａａａａａａｇｃａａａｇｇｔｔａｇａｔａｔｇｃａ－’３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８に示す）。
２６１ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴｔｃｃｔａｇｃａｃｔａｔａｔａａａｃｃｃｃｃｔｃ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
２６１ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴｔｃｃｔａｇｃａｃｔａｔａｔａａａｃｃｃｃｃｔＡ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
２６１ＣＯＭＭＯＮ ５－’ｃｔｔｇａｇｔｔｔｇｃｔｔｔｇｃｔｔｇａａｇｇｃ－’３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５に示す）、
３８５ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＴＧＴＴＴＡＴＡＴＡＧＴＴＧＧＡＧＡＣ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
３８５ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴｇｇｃｔｃａｇｔｇｔｔｔａｔａｔａｇｔｔｇｇａｇａ－’３
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７に示すように、下線部分は蛍光標識プライマーを示す）、
３８５ＣＯＭＭＯＮ ５－’ｇａａａａａａａａｇｃａａａｇｇｔｔａｇａｔａｔｇｃａ－’３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８に示す）。
８．２つの欠失突然変異部位を持つＫＡＳＰタイピングプライマーを使用して、それぞれ２６１、３８５番号の集団の９６＊２＝１９２個の個体植物をタイピングした。タイピング後、集団２６１番号の２行目の７番目の株（２６１－Ｂ－７）には、Ｏｓ１１Ｎ３遺伝子の調節領域における斑点細菌病原菌ＴＡＬエフェクター結合領域［ｃｃａａｃｃａｇｇｔｇｃｔａａｇｃｔｃａｔｃ／－］の２２個ｂｐの欠失遺伝子型が含まれていることがわかり、タイピング後、３８５番号集団の８行目の３番目の株（３８５－Ｈ－３）には、Ｏｓ８Ｎ３遺伝子調節領域における斑点細菌病原菌ＴＡＬエフェクター結合領域［ｔｃｔｃｃｃｃｃｔａｃｔｇｔａｃａｃｃａｃｃａａａａｇｔｇｇａｇｇｇ／－］に３４個ｂｐの欠失遺伝子型が含まれていることがわかった。最後に、１つのＯｓ１１Ｎ３遺伝子フレームシフト突然変異キメラ２６１－Ｂ－７、および１つのＯｓ８Ｎ３遺伝子フレームシフト突然変異キメラ３８５－Ｈ－３を含む、ターゲット遺伝子の欠失突然変異を伴うＭ１世代の２つの個体植物が得られた。
９．２６１－Ｂ－７、３８５－Ｈ－３の個体植物の各穗の対応する葉からＤＮＡを抽出し、個体植物におけるＩｎｄｅｌ変異に対してシーケンス検出を行い、２６１－Ｂ－７個体植物の４つの穂には［ｃｃａａｃｃａｇｇｔｇｃｔａａｇｃｔｃａｔｃ／－］変異遺伝子型が含まれ、３８５－Ｈ－３個体植物の三つの穂には［ｔｃｔｃｃｃｃｃｔａｃｔｇｔａｃａｃｃａｃｃａａａａｇｔｇｇａｇｇｇ／－］変異遺伝子型が含まれることがわかった。個体植物を単位として変異遺伝子型穗を含む種子を混合収穫した。
１０．２６１－Ｂ－７と３８５－Ｈ－３の混合収穫種子を２つの集団で播種し、そして、ステップ７で設計されたＫＡＳＰプライマーを使用して、個体植物をタイピングし、最後に、２６１－Ｂ－７、３８５－Ｈ－３のＭ２集団で斑点細菌抵抗性華占２６１－Ｂ－７、３８５－Ｈ－３が得られた。
実施例４：
上記の実施例１で得られたイネＯｓＮｒａｍｐ５－１８変異遺伝子であって、それはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９に示すヌクレオチド配列を有する。北京Qing科新業生物技術有限公司の検出結果から、該イネのＯｓＮｒａｍｐ５－１８変異遺伝子は、ＯｓＮｒａｍｐ５遺伝子の８８７５６４６－８８７５６６３位置（ＲＡＰ＿Ｌｏｃｕｓ）に［ＣＣＴＡＣＧＴＧＧＣＡＡＴＴＣＡＣＡ／－］の１８個ｂｐの欠失があり、該欠失には９番目のエクソンにある１ｂｐの開始塩基がある。
上記の実施例１で得られたイネＯｓＮｒａｍｐ５－１８変異遺伝子であって、それはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９に示すヌクレオチド配列を有する。北京Qing科新業生物技術有限公司の検出結果から、該イネのＯｓＮｒａｍｐ５－１８変異遺伝子は、ＯｓＮｒａｍｐ５遺伝子の８８７５６４６－８８７５６６３位置（ＲＡＰ＿Ｌｏｃｕｓ）に［ＣＣＴＡＣＧＴＧＧＣＡＡＴＴＣＡＣＡ／－］の１８個ｂｐの欠失があり、該欠失には９番目のエクソンにある１ｂｐの開始塩基がある。
図１に示す実施例１の同定方法により上記のイネＯｓＮｒａｍｐ５－１８変異遺伝子が物理的及び化学的突然変異誘発サンプルに含まれているかどうかを同定することができる。
低カドミウム吸収表現型のイネ品種の育種および調製における該イネＯｓＮｒａｍｐ５－１８変異遺伝子または実施例１で得られたイネＯｓＮｒａｍｐ５－１８変異遺伝子を有する変異体の使用は、具体的には以下のステップを含む。
（１）得られたＯｓＮｒａｍｐ５－１８変異遺伝子の遺伝子表現型を有する変異体をドナー親とし、イネ華占をレシピエント親として交雑育種し、Ｆ１種子を取得した。
（２）Ｆ１種子集団を播種した後、個体植物を選択して再発親イネ華占と交雑して、ＢＣ１Ｆ１種子を得た。
（３）ＢＣ１Ｆ１種子を播種し、個体植物に分けてＢＣ１Ｆ１集団ＤＮＡを抽出し、実施例１で設計されたＫＡＳＰタイピングプライマーマーカーを使用した前景選択を行い、イネＯｓＮｒａｍｐ５－１８変異遺伝子を含む個体植物に対して背景選択を行い、前記再発する親との背景類似性が最も高い個体植物を選択し戻し交配を続けて、ＢＣ２Ｆ１種子を得た。
（２）Ｆ１種子集団を播種した後、個体植物を選択して再発親イネ華占と交雑して、ＢＣ１Ｆ１種子を得た。
（３）ＢＣ１Ｆ１種子を播種し、個体植物に分けてＢＣ１Ｆ１集団ＤＮＡを抽出し、実施例１で設計されたＫＡＳＰタイピングプライマーマーカーを使用した前景選択を行い、イネＯｓＮｒａｍｐ５－１８変異遺伝子を含む個体植物に対して背景選択を行い、前記再発する親との背景類似性が最も高い個体植物を選択し戻し交配を続けて、ＢＣ２Ｆ１種子を得た。
（４）ＢＣ２Ｆ１種子を播種し、個体植物に分けてＢＣ２Ｆ１集団ＤＮＡを抽出し、実施例１で設計されたＫＡＳＰタイピングプライマーマーカーを使用した前景選択を行い、イネＯｓＮｒａｍｐ５－１８変異遺伝子を含む個体植物に対して背景選択を行い、前記再発する親との背景類似性が最も高い個体植物を選択し戻し交配を続けて、ＢＣ３Ｆ１種子を得た。
（５）ＢＣ３Ｆ１種子を播種し、個体植物に分けてＢＣ３Ｆ１集団ＤＮＡを抽出し、実施例１で設計されたＫＡＳＰタイピングプライマーマーカーを使用した前景選択を行い、イネＯｓＮｒａｍｐ５－１８変異遺伝子を含む個体植物に対して背景選択を行い、再発する親との背景類似性が最も高い個体植物を選択し自家交配して実りＢＣ３Ｆ２種子を得た。
（６）ＢＣ３Ｆ２種子を播種し、個体植物に分けてＢＣ３Ｆ２集団ＤＮＡを抽出し、実施例１で設計されたＫＡＳＰタイピングプライマーマーカーを使用した前景選択を行い、イネＯｓＮｒａｍｐ５－１８変異遺伝子を含む個体植物に対して背景選択を行い、イネ華占と同じ遺伝的背景を持つ個体植物華占－Ｎｒａｍｐ５－１８を収穫用に選択し、図５に示すカドミウム取り込み表現型の低いイネ品種華占－Ｎｒａｍｐ５－１８が得られた。
上記の使用後に得られた低カドミウム吸収表現型を有する華占－Ｎｒａｍｐ５－１８イネ品種に対してカドミウムストレスポット実験を行い、土壌は、畑の表面から取られ、基礎肥沃度を測定し、風乾し、ふるいにかけ、不純物を取り除き、均一に混合し、ポットあたり２５ｍｇ／ｋｇまで分けて入れ、溶液としてＣｄ（ＣｄＣｌ２）を予備用土壌に追加し、カドミウム処理濃度は２ｍｇ／ｋｇであり、４週間して使用に備えた。
本実施例のステップ（６）で得られた変異体華占－Ｎｒａｍｐ５－１８および華占対照を、カドミウムで汚染されたポットに植え、ポットあたり６穴、穴あたり２株、３回の繰り返した。イネの成熟時にサンプリングし、個体植物の茎、葉、穂を分離し、脱穀し、茎と葉を水道水ですすぎ、脱イオン水で洗浄し、各サンプルを１０５℃で３０分間硬化させ、８０℃で恒量になるまで乾燥させ、個体植物の種子の乾燥重量を測定し、結果を図６に示した。玄米をすりつぶし、１００メッシュのふるいにかけ、それをＨＮＯ３－ＨＣｌＯ４で分解し、玄米中のカドミウムおよびその他の関連ミネラル元素の含有量を、誘導結合プラズマ発光分析装置ＩＣＰによって特定し、結果を図７に示した。前述の図６および７の結果は、変異体玄米のＣｄ含有量が対照よりも有意に低く、植物の生物学的収量は対照と比較して有意差はないことを示した。
実施例５：
上記の実施例１で得られたイネＯｓＲＲ２２－１変異遺伝子であって、それはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０に示すヌクレオチド配列を有する。北京Qing科新業生物技術有限公司の検出結果から、該イネのＯｓＲＲ２２－１変異遺伝子は、イネＯｓＲＲ２２遺伝子の３番目のエクソン［Ｇ／－］１個ｂｐ（４１３８９０２位置）の欠失遺伝子型である。
上記の実施例１で得られたイネＯｓＲＲ２２－１変異遺伝子であって、それはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０に示すヌクレオチド配列を有する。北京Qing科新業生物技術有限公司の検出結果から、該イネのＯｓＲＲ２２－１変異遺伝子は、イネＯｓＲＲ２２遺伝子の３番目のエクソン［Ｇ／－］１個ｂｐ（４１３８９０２位置）の欠失遺伝子型である。
図１に示す実施例１の同定方法により上記のイネＯｓＲＲ２２－１変異遺伝子が物理的及び化学的突然変異誘発サンプルに含まれているかどうかを同定することができる。
低カドミウム吸収表現型のイネ品種の育種および調製における該イネＯｓＲＲ２２－１変異遺伝子または実施例１で得られたイネＯｓＲＲ２２－１変異遺伝子を有する変異体の使用は、具体的には以下のステップを含む。
（１）実施例１で得られたＯｓＲＲ２２－１変異遺伝子の遺伝子表現型を有する変異体をドナー親とし、イネ華占をレシピエント親として交雑育種し、Ｆ１種子を取得した。
（２）Ｆ１種子集団を播種した後、個体植物を選択して再発親イネ華占と交雑して、ＢＣ１Ｆ１種子を得た。
（３）ＢＣ１Ｆ１種子を播種し、個体植物に分けてＢＣ１Ｆ１集団ＤＮＡを抽出し、実施例１で設計されたＫＡＳＰタイピングプライマーマーカーを使用した前景選択を行い、イネＯｓＲＲ２２－１変異遺伝子を含む個体植物に対して背景選択を行い、前記再発する親との背景類似性が最も高い個体植物を選択し戻し交配を続けて、ＢＣ２Ｆ１種子を得た。
（２）Ｆ１種子集団を播種した後、個体植物を選択して再発親イネ華占と交雑して、ＢＣ１Ｆ１種子を得た。
（３）ＢＣ１Ｆ１種子を播種し、個体植物に分けてＢＣ１Ｆ１集団ＤＮＡを抽出し、実施例１で設計されたＫＡＳＰタイピングプライマーマーカーを使用した前景選択を行い、イネＯｓＲＲ２２－１変異遺伝子を含む個体植物に対して背景選択を行い、前記再発する親との背景類似性が最も高い個体植物を選択し戻し交配を続けて、ＢＣ２Ｆ１種子を得た。
（４）ＢＣ２Ｆ１種子を播種し、個体植物に分けてＢＣ２Ｆ１集団ＤＮＡを抽出し、実施例１で設計されたＫＡＳＰタイピングプライマーマーカーを使用した前景選択を行い、イネＯｓＲＲ２２－１変異遺伝子を含む個体植物に対して背景選択を行い、前記再発する親との背景類似性が最も高い個体植物を選択し戻し交配を続けて、ＢＣ３Ｆ１種子を得た。
（５）ＢＣ３Ｆ１種子を播種し、個体植物に分けてＢＣ３Ｆ１集団ＤＮＡを抽出し、実施例１で設計されたＫＡＳＰタイピングプライマーマーカーを使用した前景選択を行い、イネＯｓＲＲ２２－１変異遺伝子を含む個体植物に対して背景選択を行い、再発する親との背景類似性が最も高い個体植物を選択し自家交配して実りＢＣ３Ｆ２種子を得た。
（６）ＢＣ３Ｆ２種子を播種し、個体植物に分けてＢＣ３Ｆ２集団ＤＮＡを抽出し、実施例１で設計されたＫＡＳＰタイピングプライマーマーカーを使用した前景選択を行い、イネＯｓＲＲ２２－１変異遺伝子を含む個体植物に対して背景選択を行い、イネ華占と同じ遺伝的背景を持つ個体植物華占－ＯｓＲＲ２２－１を収穫用に選択し、図８に示す耐塩表現型のイネ品種華占－ＯｓＲＲ２２－１が得られた。
本実施例で得られた変異体華占－ＯｓＲＲ２２－１と華占（ＷＴ）を同時に発芽し、イネの苗が三葉・一心期のとき、０．８％濃度の塩化ナトリウム水溶液に１０日間継続的にストレス処理してから写真を撮り、突然変異体と対照群をそれぞれ１０株取り、純水で洗浄し、水分を吸収した後、苗の根の長さ、草丈、新鮮重を測定し、検出結果を以下の表１に示した。
表１：華占－ＯｓＲＲ２２－１と華占（ＷＴ）耐塩性試験の比較結果
表１の結果から、華占（ＷＴ）は１０日間のストレス処理後に枯れたが、変異体華占－ＯｓＲＲ２２－１は正常に成長でき、根長、株高、根の長さ、草丈、新鮮重も華占（ＷＴ）のそれよりも有意に高く、塩ストレス下での変異体華占－ＯｓＲＲ２２－１の成長能が、野生型対照の成長能よりも有意に強いことを示している。
実施例６：
上記の実施例１で得られたイネＯｓＲＲ２２－７変異遺伝子であって、それはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１に示すヌクレオチド配列を有する。北京Qing科新業生物技術有限公司の検出結果から、該イネＯｓＲＲ２２－７変異遺伝子は、イネＯｓＲＲ２２遺伝子の５番目のエクソン［ＣＧＧＣＴＴＴ／－］にある７個ｂｐ（４１４０８６１－４１４０８６７位置）の欠失遺伝子型である。
上記の実施例１で得られたイネＯｓＲＲ２２－７変異遺伝子であって、それはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１に示すヌクレオチド配列を有する。北京Qing科新業生物技術有限公司の検出結果から、該イネＯｓＲＲ２２－７変異遺伝子は、イネＯｓＲＲ２２遺伝子の５番目のエクソン［ＣＧＧＣＴＴＴ／－］にある７個ｂｐ（４１４０８６１－４１４０８６７位置）の欠失遺伝子型である。
図１に示す実施例１の同定方法により上記のイネＯｓＲＲ２２－７変異遺伝子が物理的及び化学的突然変異誘発サンプルに含まれているかどうかを同定することができる。
低カドミウム吸収表現型のイネ品種の育種および調製における該イネＯｓＲＲ２２－７変異遺伝子または実施例１で得られたイネＯｓＲＲ２２－７変異遺伝子を有する変異体の使用は、具体的には以下のステップを含む。
（１）実施例１得られたＯｓＲＲ２２－７変異遺伝子の遺伝子表現型を有する変異体をドナー親とし、イネ華占をレシピエント親として交雑育種し、Ｆ１種子を取得した。
（２）Ｆ１種子集団を播種した後、個体植物を選択して再発親イネ華占と交雑して、ＢＣ１Ｆ１種子を得た。
（３）ＢＣ１Ｆ１種子を播種し、個体植物に分けてＢＣ１Ｆ１集団ＤＮＡを抽出し、実施例１で設計されたＫＡＳＰタイピングプライマーマーカーを使用した前景選択を行い、イネＯｓＲＲ２２－７変異遺伝子を含む個体植物に対して背景選択を行い、前記再発する親との背景類似性が最も高い個体植物を選択し戻し交配を続けて、ＢＣ２Ｆ１種子を得た。
（４）ＢＣ２Ｆ１種子を播種し、個体植物に分けてＢＣ２Ｆ１集団ＤＮＡを抽出し、実施例１で設計されたＫＡＳＰタイピングプライマーマーカーを使用した前景選択を行い、イネＯｓＲＲ２２－７変異遺伝子を含む個体植物に対して背景選択を行い、前記再発する親との背景類似性が最も高い個体植物を選択し戻し交配を続けて、ＢＣ３Ｆ１種子を得た。
（２）Ｆ１種子集団を播種した後、個体植物を選択して再発親イネ華占と交雑して、ＢＣ１Ｆ１種子を得た。
（３）ＢＣ１Ｆ１種子を播種し、個体植物に分けてＢＣ１Ｆ１集団ＤＮＡを抽出し、実施例１で設計されたＫＡＳＰタイピングプライマーマーカーを使用した前景選択を行い、イネＯｓＲＲ２２－７変異遺伝子を含む個体植物に対して背景選択を行い、前記再発する親との背景類似性が最も高い個体植物を選択し戻し交配を続けて、ＢＣ２Ｆ１種子を得た。
（４）ＢＣ２Ｆ１種子を播種し、個体植物に分けてＢＣ２Ｆ１集団ＤＮＡを抽出し、実施例１で設計されたＫＡＳＰタイピングプライマーマーカーを使用した前景選択を行い、イネＯｓＲＲ２２－７変異遺伝子を含む個体植物に対して背景選択を行い、前記再発する親との背景類似性が最も高い個体植物を選択し戻し交配を続けて、ＢＣ３Ｆ１種子を得た。
（５）ＢＣ３Ｆ１種子を播種し、個体植物に分けてＢＣ３Ｆ１集団ＤＮＡを抽出し、実施例１で設計されたＫＡＳＰタイピングプライマーマーカーを使用した前景選択を行い、イネＯｓＲＲ２２－７変異遺伝子を含む個体植物に対して背景選択を行い、再発する親との背景類似性が最も高い個体植物を選択し自家交配して実りＢＣ３Ｆ２種子を得た。
（６）ＢＣ３Ｆ２種子を播種し、個体植物に分けてＢＣ３Ｆ２集団ＤＮＡを抽出し、実施例１で設計されたＫＡＳＰタイピングプライマーマーカーを使用した前景選択を行い、イネＯｓＲＲ２２－７変異遺伝子を含む個体植物に対して背景選択を行い、イネ華占と同じ遺伝的背景を持つ個体植物華占－ＯｓＲＲ２２－７を収穫用に選択し、図９に示す耐塩表現型のイネ品種華占－ＯｓＲＲ２２－７が得られた。
本実施例で得られた変異体華占－ＯｓＲＲ２２－７と華占（ＷＴ）を同時に発芽し、イネの苗が三葉・一心期のとき、０．８％濃度の塩化ナトリウム水溶液に１０日間継続的にストレス処理してから写真を撮り、突然変異体と対照群をそれぞれ１０株取り、純水で洗浄し、水分を吸収した後、苗の根の長さ、草丈、新鮮重を測定し、検出結果を以下の表２に示した。
表２：華占－ＯｓＲＲ２２－７と華占（ＷＴ）耐塩性試験の比較結果
表２の結果から、華占（ＷＴ）は１０日間のストレス処理後に枯れたが、変異体華占－ＯｓＲＲ２２－７は正常に成長でき、根の長さ、草丈、新鮮重も華占（ＷＴ）のそれよりも有意に高く、塩ストレス下での変異体華占－ＯｓＲＲ２２－７の成長能が、野生型対照の成長能よりも有意に強いことを示している。
実施例７：
図１に示されるような本発明の物理的及び化学的突然変異誘発ソルガム植物Ｍ１世代の突然変異のハイスループットターゲット同定方法および突然変異体の取得方法は、具体的には以下のステップを含む。
図１に示されるような本発明の物理的及び化学的突然変異誘発ソルガム植物Ｍ１世代の突然変異のハイスループットターゲット同定方法および突然変異体の取得方法は、具体的には以下のステップを含む。
１．ソルガム品種６５４の種子を２０，０００個取り、２８℃の恒温インキュベーターで１６時間浄水に種子を浸し、種子をすくい上げ、水分を乾燥させた。種子を１％（ｗ／ ｗ）メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）溶液に、２８℃の恒温インキュベーターで８時間再度浸し、種子をすくい上げ、水分を乾燥させた。浄水で種子をすすぎ、８回に水を交換した後、３７℃で発芽を促進して播種して苗を育てた後に移植し、９６株を１つの集団、各集団に８行、各行に１２株、１００の集団、合計９６００株を移植し、かつ各集団に１～１００の番号を付けた。
２．各集団を１つの単位とし、各個体植物から等量の葉を取り、合計９６等分を１つの遠心分離管で混合してＤＮＡを抽出し、合計１００個のＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ番号は各集団番号１～１００に対応した。
３．各集団のＤＮＡを１つのシーケンスサンプルとして使用して、ＡＬＳ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ： ＬＮ８９８４６７．１）遺伝子のエクソン領域でターゲット高深度シーケンスを実行し、シーケンス深度＞５０００×であった。
３．各集団のＤＮＡを１つのシーケンスサンプルとして使用して、ＡＬＳ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ： ＬＮ８９８４６７．１）遺伝子のエクソン領域でターゲット高深度シーケンスを実行し、シーケンス深度＞５０００×であった。
４．高深度ターゲットシーケンスデータをＳｏｒｇｈｕｍ＿ｂｉｃｏｌｏｒＮＣＢＩｖ３参考ゲノムと比較し、１００個サンプルにＡＬＳ遺伝子エクソンが存在するＳＮＰおよびＩｎｄｅｌデータを取得した。検出後、サンプル６８番号では、ＡＬＳ遺伝子の唯一のエクソンの塩基１８７１に［Ｇ／Ａ］の一塩基変異があり、該突然変異により、６２４番目のアミノ酸がＳｅｒからＡｓｎに変化したことがわかった。
５．上記集団サンプル６８番号のシーケンスデータのＳＮＰをデジタルＰＣＲ技術で検証した結果、ターゲットシーケンスデータのＳＮＰ遺伝子型がこのサンプルに存在することがわかった。
６．集団サンプル６８番号のＤＮＡに存在するＳＮＰ遺伝子型によると、ＫＡＳＰタイピングプライマーを次のように設計した。
６８ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴａｇｃａｔｇｔｇｔｔｇｃｃｔａｔｇａｔｃｃｃｔａｇ－’３
６８ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴａｇｃａｔｇｔｇｔｔｇｃｃｔａｔｇａｔｃｃｃｔａＡ－’３
６８ＣＯＭＭＯＮ ５－’ｔｃａａｔａｃａｃａｇｔｃｃｔｇｃｃａｔｃａｃｃ－’３。
６．集団サンプル６８番号のＤＮＡに存在するＳＮＰ遺伝子型によると、ＫＡＳＰタイピングプライマーを次のように設計した。
６８ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴａｇｃａｔｇｔｇｔｔｇｃｃｔａｔｇａｔｃｃｃｔａｇ－’３
６８ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴａｇｃａｔｇｔｇｔｔｇｃｃｔａｔｇａｔｃｃｃｔａＡ－’３
６８ＣＯＭＭＯＮ ５－’ｔｃａａｔａｃａｃａｇｔｃｃｔｇｃｃａｔｃａｃｃ－’３。
７．上記で設計されたＫＡＳＰタイピングプライマーを使用して、それぞれ集団６８番号の９６個の個体植物をタイピングした。タイピング後、集団６８番号の６行目８株（６８－Ｆ－８）には、ＡＬＳ遺伝子の１８７１番目のエクソン ［Ｇ／Ａ］一塩基変異遺伝子型が含まれていることがわかり、最後に、ターゲット遺伝子によってコードされるＡＬＳタンパク質がＳｅｒからＡｓｎまで６２４番目のアミノ酸で得られた。
８．６８－Ｆ－８個体植物の各穗の対応する葉からＤＮＡを抽出し、個体植物におけるＳＮＰ変異に対してシーケンス検出を行い、６８－Ｆ－８個体植物の５つの穂には［Ｇ／Ａ］一塩基変異遺伝子型が含まれていることがわかり、変異遺伝子型の穂を含む種子を混合収穫した。
９．６８－Ｆ－８個体植物に混合収穫された種子を、育苗した後に個体に移植し、そして、上記のステップ６で設計されたＫＡＳＰプライマーを使用して、個体植物をタイピングし、最終的に６８－Ｆ－８のＭ２集団でイミダゾリノン除草剤耐性表現型を持つソルガムが得られた。
９．６８－Ｆ－８個体植物に混合収穫された種子を、育苗した後に個体に移植し、そして、上記のステップ６で設計されたＫＡＳＰプライマーを使用して、個体植物をタイピングし、最終的に６８－Ｆ－８のＭ２集団でイミダゾリノン除草剤耐性表現型を持つソルガムが得られた。
実施例８：
図１に示されるような本発明の物理的及び化学的突然変異誘発ソルガム植物Ｍ１世代の突然変異のハイスループットターゲット同定方法および突然変異体の取得方法は、具体的には以下のステップを含む。
図１に示されるような本発明の物理的及び化学的突然変異誘発ソルガム植物Ｍ１世代の突然変異のハイスループットターゲット同定方法および突然変異体の取得方法は、具体的には以下のステップを含む。
１．８０ＭｅＶ／ｕの炭素イオン（１２Ｃ６＋）を用いて１８０Ｇｙの線量でコーン品種３４５の２０，０００種子を照射して、Ｍ１世代のコーン品種３４５（以下３４５と呼ばれる）を得た。
２．３４５ Ｍ１世代の２０，０００の種子を育苗した後の植物を個体植物に分けて、移植した。９６株を１つの集団、各集団に８行、各行に１２株、１００の集団、合計９６００株を移植し、かつ各集団に１～１００の番号を付けた。
２．３４５ Ｍ１世代の２０，０００の種子を育苗した後の植物を個体植物に分けて、移植した。９６株を１つの集団、各集団に８行、各行に１２株、１００の集団、合計９６００株を移植し、かつ各集団に１～１００の番号を付けた。
３．各集団を１つの単位とし、各個体植物から等量の葉を取り、合計９６等分を１つの遠心分離管で混合してＤＮＡを抽出し、合計１００個のＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ番号は各集団番号１～１００に対応した。
４．各集団のＤＮＡを１つのシーケンスサンプルとして使用して、ＺｍＴＭＳ５遺伝子エクソン領域でターゲット高深度シーケンスを実行し、シーケンス深度＞５０００×であった。
４．各集団のＤＮＡを１つのシーケンスサンプルとして使用して、ＺｍＴＭＳ５遺伝子エクソン領域でターゲット高深度シーケンスを実行し、シーケンス深度＞５０００×であった。
５．高深度ターゲットシーケンスデータをコーン参考ゲノムＢ７３＿ＲｅｆＧｅｎ＿ｖ４と比較し、１００個サンプルにＺｍＴＭＳ５遺伝子エクソンが存在するＳＮＰおよびＩｎｄｅｌデータを取得した。検出後、サンプル５４番号では、ＺｍＴＭＳ５遺伝子の最初のエクソンの３８番目の塩基に［Ｃ／－］１個ｂｐの欠失があることがわかった。
６．上記集団サンプル５４番号のシーケンスデータのＩｎｄｅｌをデジタルＰＣＲ技術で検証した結果、このサンプルのターゲットシーケンスデータに欠失変異遺伝子型が存在することを示した。
７．５４番号の集団サンプルにＤＮＡの欠失変異遺伝子型によると、ＫＡＳＰタイピングプライマーを次のように設計した。
３８ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＴＣＣＡＣＴＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣ－’３
３８ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＣＧＡＧＴＣＣＡＣＴＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＴ－’３
３８ＣＯＭＭＯＮ ５－’ＡＣＣＣＣＴＣＧＡＴＣＴＣＴＡＴＡＣＧＧＴＧ－’３
７．５４番号の集団サンプルにＤＮＡの欠失変異遺伝子型によると、ＫＡＳＰタイピングプライマーを次のように設計した。
３８ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＴＣＣＡＣＴＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣ－’３
３８ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＣＧＡＧＴＣＣＡＣＴＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＴ－’３
３８ＣＯＭＭＯＮ ５－’ＡＣＣＣＣＴＣＧＡＴＣＴＣＴＡＴＡＣＧＧＴＧ－’３
上記で設計されたＫＡＳＰタイピングプライマーを使用して、それぞれ集団５４番号の９６個の個体植物をタイピングした。タイピング後。集団５４番号の４行目３株（５４－Ｄ－３）には、ＺｍＴＭＳ５遺伝子の３８番目のエクソン ［Ｃ／－］一塩基変異遺伝子型が含まれていることがわかった。
８．５４－Ｄ－３個体植物の各穗の対応する葉からＤＮＡを抽出し、個体植物におけるＩｎｄｅｌ変異に対してシーケンス検出を行い、５４－Ｄ－３個体植物の４つの穂には［Ｃ／－］一塩基欠失変異遺伝子型が含まれていることがわかり、変異遺伝子型の穂を含む種子を混合収穫した。
９．５４－Ｄ－３個体植物に混合収穫された種子を、育苗した後に個体に移植し、そして、上記のステップ６で設計されたＫＡＳＰプライマーを使用して、個体植物をタイピングし、最後に、５４－Ｄ－３のＭ２集団で、感熱性の雄性不稔系統を備えたトウモロコシ品種３４５が得られた。
Claims (10)
- 物理的及び化学的突然変異誘発植物のＭ１世代突然変異をハイスループットターゲット同定しＭ２突然変異体を取得する方法であって、
非致死量の物理的及び化学的突然変異誘発によって植物を突然変異誘発して植物材料Ｍ１世代を得るステップ（ａ）と、
得られたＭ１世代の植物を個体植物に分けて植え、植えた後の各個体植物の葉を取り、各個体植物の葉を混合するステップ（ｂ）と、
混合後のすべての葉から混合プールＤＮＡを抽出するステップ（ｃ）と、
抽出された混合プールのＤＮＡに対して、ターゲット遺伝子領域の高深度ターゲットシーケンスを実行するステップ（ｄ）と、
高深度ターゲットシーケンス結果をターゲット遺伝子領域の関連配列と比較し、高深度ターゲットシーケンス結果で、集団ＤＮＡサンプルのターゲット遺伝子領域にターゲットＳＮＰ及び／又はＩｎｄｅｌが存在するかどうかを同定するステップ（ｅ）と、
ステップ（ｅ）の結果に対して、デジタルＰＣＲ同定方法により、ターゲットＳＮＰ及び／又はＩｎｄｅｌが存在する集団ＤＮＡサンプルを検証するステップ（ｅ１）と、
ステップ（ｅ１）で検証されたターゲットＳＮＰ及び／又はＩｎｄｅｌが存在する集団ＤＮＡサンプルの突然変異遺伝子型に従って、ＫＡＳＰタイピングプライマーを設計し、設計されたＫＡＳＰタイピングプライマーを使用して、ステップ（ｅ１）で検証された集団ＤＮＡサンプル中の個体植物をタイピングし、ターゲット遺伝子の突然変異を伴うＭ１世代の個体植物を得るステップと、
前記ターゲット遺伝子の突然変異を伴うＭ１世代の個体植物ごとに、各穗の対応する葉のＤＮＡを抽出して、前記ＫＡＳＰタイピングプライマーを利用してＤＮＡ同定を行い、前記ターゲット遺伝子の突然変異を含む穗を選択し、前記穗を含む種子を混合収集するステップ（ｆ）と、
混合収集された種子を混合播種した後、個体植物から葉を抽出し、前記ＫＡＳＰタイピングプライマーを利用してＤＮＡ同定を行って、最終的にターゲット遺伝子表現型を持つＭ２個体植物を取得するステップ（ｇ）と、
を含むことを特徴とする物理化学的突然変異誘発植物のＭ１世代突然変異をハイスループットターゲット同定しＭ２突然変異体を取得する方法。 - 前記ターゲット遺伝子領域の関連配列は、イネのＯｓＮｒａｍｐ５遺伝子の遺伝子配列であり、ＯｓＮｒａｍｐ５遺伝子の８８７５６４６－８８７５６６３の位置では、９番目のエクソンに位置する開始塩基に［ＣＣＴＡＣＧＴＧＧＣＡＡＴＴＣＡＣＡ／－］１８個ｂｐの欠失があることに対して、前記ＫＡＳＰタイピングプライマーには
ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＴＣＣＴ－’３、
ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＴＣＡＣ－’３、
ＣＯＭＭＯＮ ５－’ＧＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＡＡＣＡＡＡＧＡＴ－’３という配列が含まれていることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 前記ターゲット遺伝子領域の関連配列は、イネのＯｓＲＲ２２遺伝子の遺伝子配列であり、ＯｓＲＲ２２遺伝子の４１３８９０２位置では、３番目のエクソン内に［Ｇ／－］１個ｂｐの欠失があることに対して、前記ＫＡＳＰタイピングプライマーには
ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＴＡＴＣＣＣＴ－’３、
ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＴＡＴＣＣＣＣ－’３、
ＣＯＭＭＯＮ ５－’ＴＧＴＴＡＴＣＡＧＴＡＡＡＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＣ－’３という配列が含まれていることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 前記ターゲット遺伝子領域の関連配列は、イネのＯｓＲＲ２２遺伝子の遺伝子配列であり、ＯｓＲＲ２２遺伝子の４１４０８６１－４１４０８６７位置では、５番目のエクソン内に［ＣＧＧＣＴＴＴ／－］７個ｂｐの欠失があることに対して、前記ＫＡＳＰタイピングプライマーには
ＦＡＭ ５－’ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＡＡ－’３、
ＨＥＸ ５－’ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＣＧ－’３、
ＣＯＭＭＯＮ ５－’ＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＡ－’３という配列が含まれていることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 前記ステップ（ａ）の非致死量とは、半致死量の上下２０％の範囲内で量を制御することを指すことを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ（ａ）の物理的及び化学的突然変異誘発方法は、紫外線突然変異誘発、Ｘ線突然変異誘発、ガンマ線突然変異誘発、ベータ線突然変異誘発、アルファ線突然変異誘発、高エネルギー粒子突然変異誘発、宇宙線突然変異誘発、および微小重力突然変異誘発が含まれる物理的突然変異誘発方法と、エチルメチルシクロエート突然変異誘発、硫酸ジエチル突然変異誘発、エチレンイミン突然変異誘発が含まれるアルキル化剤突然変異誘発、アジド突然変異誘発、塩基類似体突然変異誘発、塩化リチウム突然変異誘発、抗生物質突然変異誘発、挿入色素突然変異誘発が含まれる化学的突然変異誘発方法との１つまたは複数の組み合わせを含むことを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ（ｂ）において、得られたＭ１世代の植物を個体植物に分けて植える場合、任意の数の植物を１つの集団として、各集団を単位で番号付け、次のステップｃでは、各集団の葉を１つの遠心分離管で混合してＤＮＡを抽出することを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記１つの集団内の任意の株数は、４８株、９６株、または１９２株であり、
そのうちの各個体植物から葉をとるとき、いずれも同じ個体植物の異なる部分から同じ量の葉を選択し、
次のステップ（ｄ）では、４８株の単一集団の高深度ターゲットシーケンスのシーケンス深度は２０００を超え、
９６株の単一集団の高深度ターゲットシーケンスのシーケンス深度は５０００を超え、
１９２株の単一集団の高深度ターゲットシーケンスのシーケンス深度は１００００を超える
ことを特徴とする請求項７に記載の方法。 - 前記ステップ（ｄ）において、前記ターゲット遺伝子領域は、ターゲット遺伝子のエキソン領域またはターゲット遺伝子の非コード領域を含み、
前記高深度ターゲットシーケンスには、マルチプレックスＰＣＲ増幅に基づくターゲットキャプチャテクノロジー、液相プローブキャプチャーハイブリダイゼーションに基づくターゲットキャプチャーテクノロジー、または第３世代シーケンス単一分子ターゲットシーケンステクノロジーが含まれ、
前記高深度ターゲットシーケンスのシーケンス深度は、各集団内の個体植物の数に応じて決定される
ことを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ターゲット遺伝子はイネＯｓＮｒａｍｐ５遺伝子またはイネＯｓＲＲ２２遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
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