CN117925903A - 一种用于检测与水稻镉吸收相关基因OsNramp5连锁的分子标记的引物组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测与水稻镉吸收相关基因OsNramp5连锁的分子标记的引物组及其应用，所述分子标记用于检测蜀恢498的7号染色体第8899129位的碱基处是否存在大片段缺失；所述引物组包括特异性引物和通用引物，所述特异性引物包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明的分子标记，结合KASP检测技术，可以解决传统分子标记辅助育种中的技术问题，无需琼脂糖凝胶电泳，可快速、准确、高效、高通量的鉴定OsNramp5基因，加快镉低积累新品种的选育进程。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于检测与水稻镉吸收相关基因OsNramp5连锁的分子标记的引物组及其应用。
背景技术
镉（cadmium，Cd）是一种广泛存在于环境中的重金属元素，由于金属冶炼、工业活动及含镉肥料的使用，部分地区土壤中的镉含量严重超标。水稻作为重要的主粮作物，受镉污染尤为严重。稻米中镉含量超标会严重影响人体健康，长期摄入高镉稻米会诱发肾脏慢性中毒、骨质疏松、脊柱变形等多种疾病。
目前，已克隆参与水稻镉吸收、转运和积累的基因31个，主要分为6类：水稻Fe2+转运蛋白、重金属转运ATP酶、低亲和性阳离子转运蛋白、金属耐受蛋白、ABC转运蛋白和自然抗性相关巨噬细胞蛋白。OsNramp5属于自然抗性相关巨噬细胞蛋白，负责Mn2+、Fe2+和Cd2+的吸收和转运，并影响离子在根部和叶片中的分布，对维持水稻体内的离子平衡具有重要作用。在OsNramp5突变体中，根部对Cd2+的吸收明显减少，茎与籽粒中的Cd含量也显著降低。另有研究表明，OsNramp5编码蛋白定位于细胞膜上，主要负责Mn的吸收和转运。基因敲除OsNramp5可使水稻丧失吸收Mn和Cd的能力，导致水稻的地上部分与地下部分中Mn和Cd含量显著低于野生型。在最近的研究中，科研人员通过对1143份水稻资源进行重测序分析，发现水稻品种珞红3A和珞红4A的7号染色体存在一段约408Kb的片段缺失，该缺失片段中包含整个OsNramp5基因。进一步研究表明，由于珞红3A和珞红4A中的大片段缺失，两个品种的Cd吸收能力显著降低。有研究也证实珞红4A在7号染色体上存在一段408481bp的片段缺失，并且在该段缺失处插入了一段2980bp的序列。共分离试验表明，2980bp的插入片段与水稻中Cd的积累存在紧密关联。珞红3A与珞红4A作为天然的镉低积累品种，在水稻镉低积累新品种的选育和解决水稻镉污染问题中具有重要的应用价值。
水稻中镉含量的测定需要复杂的检测过程，并且受环境影响，测定数据容易出现偏差。目前，可用于镉低积累新品种选育的分子标记较少，这些标记的使用需要繁琐的凝胶电泳检测，自动化程度低通量小，大大的限制了镉低积累新品种的选育进程。因此，开发珞红3A和珞红4A缺失片段连锁的分子标记，一方面可促进珞红3A和珞红4A两个品种在镉低积累新品种选育中的应用；另一方面可快速高通量的筛选镉低积累水稻品种，加快新品种的选育进程，对减少水稻镉污染带来的危害具有重要意义。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于检测与水稻镉吸收相关基因OsNramp5连锁的分子标记的引物组。
本发明还提出一种试剂盒。
本发明还提出一种基因芯片。
本发明还提出上述引物组、试剂盒和/或基因芯片的应用。
本发明还提出利用上述引物组检测水稻镉吸收相关基因OsNramp5的方法。
根据本发明的第一方面实施方式，提供了一种用于检测与水稻镉吸收相关基因OsNramp5连锁的分子标记的引物组，所述分子标记用于检测蜀恢498的7号染色体第8899129位的碱基处是否存在大片段缺失；所述引物组包括特异性引物和通用引物，所述特异性引物包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述通用引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一些实施方式中，所述特异性引物分别连接FAM和HEX荧光接头序列。
根据本发明第二方面实施方式，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。
根据本发明第三方面实施方式，提供了一种基因芯片，所述基因芯片包括上述引物组。
根据本发明的第四方面的实施方式，提供了上述引物组、试剂盒或基因芯片的以下任一应用：
（1）在水稻镉吸收相关基因OsNramp5的基因型鉴定中的应用；
（2）在检测水稻镉吸收相关基因OsNramp5中的应用；
（3）在检测蜀恢498的7号染色体第8899129位的碱基处是否存在大片段缺失中的应用；
（4）在鉴定及筛选低镉水稻中的应用；
（5）在水稻育种中的应用；
（6）在水稻分子标记辅助育种中的应用。
根据本发明的第五方面的实施方式，提出了利用上述引物组检测水稻镉吸收相关基因OsNramp5的方法，所述方法包括以下步骤：
S1、从待测水稻中提取基因组DNA；
S2、利用上述引物组对步骤S1中提取的基因组DNA进行所述分子标记的多态性检测，根据检测结果判断所述待测水稻中是否含有OsNramp5基因。
在本发明的一些实施方式中，只检测到引物Primer X所对应的碱基，判定待测水稻含有OsNramp5基因；若只检测到引物Primer Y所对应的碱基，判定待测水稻不含有OsNramp5基因；若同时检测到PrimerX与PrimerY对应的碱基，判定测试的待测水稻为杂合基因型。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤S1中，基因组DNA提取采用简化CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵法）。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤S2中，用KASP（竞争性等位基因特异性PCR）技术对上述分子标记进行检测。
一种低镉水稻育种方法，包括如下步骤：利用上述方法，选择不含有OsNramp5基因的水稻进行后续育种。
根据本发明实施方式的一种与水稻镉吸收相关基因OsNramp5连锁的分子标记，至少具有如下有益效果：利用所述分子标记，结合KASP检测技术，可以解决传统分子标记辅助育种中的技术问题，无需琼脂糖凝胶电泳，可快速、准确、高效、高通量的鉴定OsNramp5基因，加快镉低积累新品种的选育进程。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例1中的标记开发流程图；
图2为本发明实施例1中的标记分型结果检测图；
图3为本发明实施例1中的标记分型结果检测图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例制备了一种与水稻镉吸收相关基因OsNramp5连锁的分子标记，该分子标记的具体设计过程如图1所示，通过已克隆目标基因OsNramp5在染色体上的物理位置，确定珞红4A中OsNramp5基因片段缺失边界序列，提取重测序BAM文件中序列，设计引物进行一代测序，并与蜀恢498参考基因组比对。利用珞红4A与蜀恢498在目的片段的序列差异，进行KASP标记开发，并对标记进行筛选测试，具体如下：
1 引物设计
根据相关技术，珞红4A的7号染色体存在一段408Kb的片段缺失，该缺失片段中包含整个OsNramp5基因。由于珞红4A中该片段的缺失，其Cd吸收能力显著降低。以蜀恢498为参考基因组，珞红4A中缺失片段位置为7号染色体8899129-9307609。根据珞红4A缺失片段左侧边界的位置，提取重测序BAM文件中序列，设计引物进行一代测序，并与蜀恢498参考基因组比对。利用珞红4A与蜀恢498在目的片段的序列差异，进行KASP标记开发。标记由3条引物组成，其中2条特异性引物的5’端分别连接FAM和HEX荧光接头序列，具体序列如表1所示。引物委托上海生工合成。
如果PCR产物只检测到Primer X对应的荧光信号，则检测位点碱基为C，该测试材料中OsNramp5基因片段未缺失；如果只检测到Primer Y对应的荧光信号，则检测位点碱基为G，该测试材料中缺失OsNramp5基因片段；如果同时检测到Primer X与Primer Y对应的荧光信号，则检测位点碱基为C:G，该测试材料为杂合基因型。
表1标记信息
2 样品检测
DNA提取：从水稻叶片中提取基因组DNA，采用简化CTAB法，包括以下步骤：
（1）取约30mg叶片至1.3mL 96孔板，并置于冻干机中，抽真空12h或以上；
（2）抽真空结束后，使用分珠器向每孔中加入两粒钢珠，并盖上硅胶膜，置于高通量研磨仪中研磨1min，研磨后置于深孔板离心机中瞬离，将磨碎组织离心到孔底；
（3）用移液工作站TECAN向每孔加CTAB提取液700μL，震荡混匀后置于65℃水浴锅中温浴约1-1.5h，每20min将1.3mL 96孔板取出于漩涡振荡器上振荡数次；
（4）温浴结束后取出1.3mL 96孔板，将其置于深孔板冷冻离心机中，4000rpm离心10min；
（5）用移液工作站TECAN将每孔380μL上清转移到新的1.3mL 96孔板中，并加入等体积氯仿，颠倒混匀后静置2min，置于深孔板冷冻离心机中，4000rpm，离心10min；
（6）离心后，用移液工作站TECAN抽取上清液250μL至预先加好250μL异丙醇的0.8mL 96孔板中，漩涡振荡混匀，将其置于-20℃冰箱沉淀1h或以上；
（7）取出0.8mL 96孔板置于深孔板冷冻离心机中，4000rpm，离心15min；
（8）弃掉上清，用移液工作站TECAN向每孔中加入250μL 70%乙醇，漩涡振荡器上振荡数次，5000rpm，离心15min；
（9）弃掉上清，并置于65℃烘箱中30min将其烘干；
（10）每孔加200μL灭菌超纯水，置于室温过夜溶解备用。
KASP反应测试：KASP反应测试在Douglas Arraytape基因分型平台上进行，反应体系如表2所示，从表中可以看出，PCR扩增反应使用的扩增体系以0.8μL计为：样品DNA 20ng-50ng烘干后加入100μM两条特异性引物各0.0013μL，100μM通用引物0.0033μL，2× KASPMaster Mix 0.3945μL，超纯水0.3996μL。PCR扩增在水浴热循环仪中完成，Touchdown PCR反应条件为：94℃预变性15min；第一步扩增反应，94℃变性20s，65℃～57℃退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20s，57℃退火并延伸60s，30个循环。反应完成后利用Arraytape扫描系统对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。
表2 KASP检测的反应体系
3标记分型数据
根据上述检测方法，用标记OS900414_K06对已知基因型的珞红4A和68份水稻常规育种材料进行KASP反应验证，每份材料3个重复。
分析结果如图2所示，从图中可以看出，珞红4A在测试位点检测结果为碱基G，其中OsNramp5基因缺失，属于低镉材料；68份水稻常规育种材料在测试位点检测结果为碱基C，其中OsNramp5基因未缺失，属于高镉材料，结果与预期一致。
4特异性和实用性检测
为检测本发明中标记的特异性及实用性，根据上述检测方法，检测了830份已知基因型的不同世代的水稻材料，这些材料由不同高镉受体亲本与珞红4A杂交而来。
标记分型结果如图3所示，295份材料在测试位点检测结果为碱基G，其中OsNramp5基因缺失，属于低镉材料；78份材料在测试位点检测结果为碱基C:G，材料为杂合基因型，属于高镉材料；457份材料在测试位点检测结果为碱基C，其中OsNramp5基因未缺失，属于高镉材料，与实际结果一致。标记OS900414_K06在检测OsNramp5基因片段缺失与否时具有高特异性，可准确并高效的鉴别水稻材料中是否含有OsNramp5基因片段。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (7)
1.一种用于检测与水稻镉吸收相关基因OsNramp5连锁的分子标记的引物组，其特征在于，所述分子标记用于检测蜀恢498的7号染色体第8899129位的碱基处是否存在大片段缺失；所述引物组包括特异性引物和通用引物，所述特异性引物包括如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列；所述通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述特异性引物分别连接FAM和HEX荧光接头序列。
3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-2任一项所述的引物组。
4.一种基因芯片，其特征在于，所述基因芯片包括如权利要求1-2任一项所述的引物组。
5.权利要求1-2任一项所述的引物组、权利要求3所述的试剂盒或权利要求4所述的基因芯片的以下任一应用：
（1）在水稻镉吸收相关基因OsNramp5的基因型鉴定中的应用；
（2）在检测水稻镉吸收相关基因OsNramp5中的应用；
（3）在鉴定及筛选低镉水稻中的应用；
（4）在检测蜀恢498的7号染色体第8899129位的碱基处是否存在大片段缺失中的应用；
（5）在水稻育种中的应用；
（6）在水稻分子标记辅助育种中的应用。
6.利用如权利要求1所述的引物组检测水稻镉吸收相关基因OsNramp5的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1、从待测水稻中提取基因组DNA；
S2、利用如权利要求1所述的引物组对步骤S1中提取的基因组DNA进行所述分子标记的多态性检测，根据检测结果判断所述待测水稻中是否含有OsNramp5基因。
7.一种低镉水稻育种方法，其特征在于，包括如下步骤：利用权利要求6所述的方法，选择不含有OsNramp5基因的水稻进行后续育种。
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2024
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