CN112011639A - 水稻镉积累分子标记及其在改良水稻籽粒镉积累上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水稻镉积累分子标记及其在改良水稻籽粒镉积累上的应用。本发明公开的水稻镉积累分子标记为水稻7号染色体8899129‑9307609区域的DNA片段，其为lcrf1或lcrf2，lcrf1为水稻7号染色体8899129‑9307609所示的DNA片段，所述lcrf2为序列表中SEQ ID No.1所示的DNA片段。本发明发现该水稻镉积累分子标记与水稻籽粒的镉积累有关，水稻镉积累分子标记为序列表中SEQ ID No.1的纯合水稻在高镉污染田种植具有籽粒镉低积累的特性。因此，可以通过杂交、回交等育种方法将该DNA片段导入其他背景来选育籽粒镉低积累的水稻新品种。

Description

水稻镉积累分子标记及其在改良水稻籽粒镉积累上的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，水稻镉积累分子标记及其在改良水稻籽粒镉积累上的应用。

背景技术

稻米是世界上最重要的粮食作物之一，目前世界上有一半以上的人口以稻米为主食。镉对人体具有致癌作用，已被国际癌症研究机构列为I类致癌物。土壤中镉的主要来源为工业废气、汽车尾气的沉降，农药、化肥及农膜的施用，污水灌溉等；水稻主要通过根部吸收土壤中的镉，镉被根吸收后通过共质体和质外体两种运输途径抵达维管束，随后向茎叶转运，再迁移到籽粒，最终通过食物链循环富集到人体，从而对人类健康造成严重的危害。

目前主要有以下四种途径来降低水稻籽粒的镉含量，第一是利用物理、化学等方法去除土壤中的镉或改变土壤镉的存在形态，第二是通过水分、肥料管理等栽培措施抑制土壤交换态镉的形成，第三是从现有的水稻品种中筛选出籽粒镉低积累品种，第四是通过基因编辑技术获得籽粒镉低积累新材料。不过这四种途径在应用上都存在较大的局限性，比如镉污染土壤修复的成本较高，而且易对土壤造成二次污染；不同的土壤类型或水稻品种需要不同的栽培措施，而且施用效果受环境条件影响比较大；筛选镉低积累品种，需要经过多年多点的验证，而且许多筛选出来的品种在重度镉污染田会出现籽粒镉高积累；虽然通过基因编辑技术能够获得在重度镉污染田籽粒镉低积累新材料，但是目前国家一直未放开基因编辑技术在生产上的应用。

水稻籽粒镉积累是一个复杂的性状，很容易受外界环境和栽培措施的影响，因此鉴定水稻籽粒是否为镉低积累需要通过多年多点的验证，这给通过杂交、回交等方法选育籽粒镉积累水稻新品种带来了极大的难度。因此，探索出一种能够经济、快速、高效的选育籽粒镉低积累水稻新品种的方法成为了生产上一个亟需解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何经济、快速、高效的选育籽粒镉低积累水稻新品种。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述任一应用：

1、检测水稻镉积累分子标记的物质在鉴定或辅助鉴定水稻籽粒镉低积累性状中的应用，所述水稻镉积累分子标记为水稻7号染色体8899129-9307609区域(参考基因组为蜀恢498的CANU版本(更新日期为2018年11月23，网址：

http://www.mbkbase.org/R498/)的DNA片段，所述水稻镉积累分子标记为lcrf1或lcrf2或lcrf3，所述lcrf1为水稻7号染色体8899129-9307609区域的DNA片段(参考基因组为蜀恢498的CANU版本(更新日期为2018年11月23，网址：http://www.mbkbase.org/R498/)，所述lcrf2为序列表中SEQ ID No.1所示的DNA片段，所述lcrf3为序列表中SEQ IDNo.2所示的DNA片段；

2、检测所述水稻镉积累分子标记的物质在制备鉴定或辅助鉴定水稻籽粒镉低积累性状产品中的应用；

3、检测所述水稻镉积累分子标记的物质在水稻育种或制备水稻育种产品中的应用。

上述应用中，所述检测水稻镉积累分子标记的物质可为能区分水稻镉积累分子标记为所述lcrf1和所述lcrf2的PCR引物。

所述PCR引物具体可为序列表中SEQ ID No.3-6所示的四条单链DNA。

以水稻基因组DNA为模板，利用SEQ ID No.3和4所示的两条单链DNA能扩增到长度为483bp的DNA片段且利用SEQ ID No.5和6所示的两条单链DNA能扩增到长度为494bp的DNA片段的待测水稻为含有所述lcrf1和所述lcrf2的杂合水稻；以水稻基因组DNA为模板，利用SEQ ID No.3和4所示的两条单链DNA能扩增到长度为483bp的DNA片段且利用SEQ ID No.5和6所示的两条单链DNA不能扩增到长度为494bp的DNA片段的待测水稻为含有所述lcrf1的纯合水稻；以水稻基因组DNA为模板，利用SEQ ID No.3和4所示的两条单链DNA不能扩增到长度为483bp的DNA片段且利用SEQ ID No.5和6所示的两条单链DNA能扩增到长度为494bp的DNA片段的待测水稻为含有所述lcrf2的纯合水稻。

本发明还提供了鉴定或辅助鉴定水稻籽粒镉低积累性状的方法，所述方法包括：检测待测水稻7号染色体8899129-9307609区域的DNA片段，根据待测水稻7号染色体8899129-9307609区域的DNA片段确定所述待测水稻的籽粒镉低积累性状。

上述方法中，水稻7号染色体8899129-9307609区域的DNA片段为所述lcrf1或所述lcrf2，含有所述lcrf2的纯合水稻的籽粒镉含量低于或候选低于含有lcrf1和所述lcrf2的杂合水稻，含有所述lcrf2的纯合水稻的籽粒镉含量低于或候选低于含有lcrf1的纯合水稻，

所述鉴定或辅助鉴定水稻籽粒镉低积累性状的方法或序列表中SEQ ID No.1所示的DNA片段在水稻育种中的应用，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了水稻育种方法，所述方法包括检测水稻基因组中7号染色体8899129-9307609区域的DNA片段，选择7号染色体8899129-9307609区域的DNA片段为序列表中SEQ ID No.1的纯合型或杂合型水稻作为亲本进行育种。

上述方法中，所述水稻育种为培育籽粒镉低积累水稻。

在进行育种时，可通过杂交或回交等育种方法将序列表中SEQ ID No.1所示的DNA片段导入其他背景水稻中来选育籽粒镉低积累的水稻。

所述亲本可为水稻雄性不育系。在本发明的一个实施例中，所述亲本为珞红3A或珞红4A。

下述X1或X2，也属于本发明的保护范围：

X1、所述检测水稻镉积累分子标记的物质；

X2、序列表中SEQ ID No.1所示的DNA片段。

本发明中，所述检测水稻镉积累分子标记的物质可为试剂或试剂盒或系统。所述系统可包括试剂或试剂盒、仪器和分析软件的组合产品，如由PCR引物、PCR扩增所用试剂组成的产品。

本发明发现在水稻7号染色体上的8899129-9307609区域的DNA片段与水稻籽粒的镉积累有关，此处的DNA片段序列为序列表中SEQ ID No.1的纯合水稻在高镉污染田种植具有籽粒镉低积累的特性。因此，可以通过杂交、回交等育种方法将该DNA片段导入其他背景来选育籽粒镉低积累的水稻新品种。

附图说明

图1为mf-F和mf-R PCR检测的部分结果。M为DNA分子量标准(条带大小从上到下依次为：2000bp,1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)，1～24分别为F2群体的不同单株。

图2为lcrf-F和lcrf-R PCR检测的部分结果。M为DNA分子量标准条带大小从上到下依次为：2000bp,1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)，1～16分别为F2群体的不同单株。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的珞红3A(朱仁山，刘文军，李绍清，朱英国，红莲型杂交稻不育系珞红3A及其组合珞优8号的选育与利用，武汉大学学报(理学版)，第59卷第1期，2013年2月)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的珞红4A(朱仁山，黄文超，胡骏，刘文军，朱英国，红莲型杂交稻新不育系珞红4A的选育，武汉大学学报(理学版)，第59卷第1期，2013年2月)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的明恢63(吴方喜,蔡秋华,朱永生,et al.籼型杂交稻恢复系明恢63的利用与创新[J].福建农业学报,2011(06):1101-1112.)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的龙特甫B(胡德辉,刘开雨,周萍,等.分子标记辅助选择改良天B和龙特甫B稻米品质[J].分子植物育种印刷版,2013,11(005):486-493.)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的黄华占(潘甫河,吴多新.优质常规稻新品种黄华占高产栽培技术[J].现代农业科技,2009,000(001):193-193.)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

籽粒镉含量的检测方法：采用硝酸-高氯酸(4：1，V/V)湿法消煮，用超纯水定溶后，利用AA240FS型石墨炉原子吸收分光光度计(VARIAN，USA)，测定水稻籽粒的金属含量。以中国国家标准物质GB W080684为内标进行质量控制，同时全程做空白实验。所用器皿均用5％硝酸溶液浸泡过夜，并用去离子水冲洗干净。

金牌Mix：北京擎科生物科技有限公司；货号：TSE101。

实施例1、水稻镉积累分子标记的发现

1、在现有水稻资源中筛选籽粒镉低积累材料

目前已有多个应急性镉低积累水稻杂交组合被报道，但是这些应急性组合在中高镉污染土壤种植籽粒仍然为高积累(高于国家标准上限0.2mg/kg)，为了寻找在中高镉污染土壤种植籽粒仍为低积累的水稻材料，发明人将收集到的来自国内外的275份水稻资源(其中，恢复系162份，不育系35份，国外材料78份)播种到中度镉污染田(土壤全镉含量为0.8mg/kg)，来筛选籽粒镉低积累品种。对于不育系，用其他可育材料作为父本对其授粉使其结实。收获后测定每个材料的籽粒镉含量。发现相对于其他亲本，雄性不育系珞红3A和珞红4A所结籽粒镉含量极低，分别为0.01mg/kg和0.03mg/kg，而其他水稻材料的籽粒镉含量均高于0.20mg/kg。

再将珞红3A和珞红4A及其他材料播种到重度镉污染田(土壤全镉含量为5.0mg/kg)，其中，珞红3A和珞红4A仍用其他可育材料作为父本对其授粉使其结实。收获后测定每个材料的籽粒镉含量。发现珞红3A和珞红4A的籽粒镉含量也极低，分别为0.03mg/kg和0.06mg/kg，而其他水稻品种的籽粒镉含量均高于0.90mg/kg。

2、对珞红4A进行全基因组测序

为了从基因水平上获得珞红4A和珞红3A在重度镉污染田籽粒镉低积累的原因，发明人对珞红4A进行了第三代高深度测序和基因组de novo组装及比较基因组学分析。发现在珞红4A的7号染色体8899129-9307609区域(参考基因组为蜀恢498的CANU版本，更新日期为2018年11月23，网址：http://www.mbkbase.org/R498/)，即共有408481bp的片段(将该片段命名为lcrf1)，被一条2980bp的片段(将该片段命名为lcrf2，其序列为序列表中SEQ IDNo.1)替换。利用桑格测序对珞红3A的7号染色体8899129-9307609区域及其上下游进行扩增，发现同样也存在lcrf1被lcrf2替换。

3、lcrf2片段与水稻籽粒镉积累特性关联性分析

将珞红3A(作为母本)与明恢63杂交，收获种子后播种，获得52株F1植株，F1自交，混收获得F2种子，将部分F2种子播种到中度镉污染田(土壤全镉含量为0.8mg/kg)，获得F2群体。插秧后取1000个单株提取基因组DNA，以所得基因组DNA为模板进行PCR扩增检测每个单株的基因型，即7号染色体8899129-9307609区域的DNA片段情况。

检测方法为：在7号染色体8899129-9307609区域内设计正反引物(mf-F：5'-ACTTGACAATCGATCCAACTAGC-3'(序列表中SEQ ID No.3)；mf-R：5'-CGAAGCTTTGCTGATCGGG-3'(序列表中SEQ ID No.4))，扩增序列全长为483bp。PCR反应体系为10μl：金牌Mix 8.5μl，mf-F 0.5μl，mf-R 0.5μl，模板DNA0.5μl。PCR扩增程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，54℃退火10s，72℃延伸10s，30次循环，72℃延伸5min。然后进行电泳，电泳结果显示部分样品能扩增出483bp条带，而部分样品不能扩增出483bp条带。其中，能够扩增出483bp条带的样品为含有lcrf1的纯合或lcrf1/lcrf2的杂合单株(部分检测结果见附图1)。

对于不能扩出483bp条带的样品再进行下一步检测验证，即在lcrf2片段及侧翼(将该片段命名为lcrf3，序列表中SEQ ID No.2)分别设计正反引物(lcrf-F：5'-CGCCGAATTGTAGGAGTTG-3'(序列表中SEQ ID No.5)；lcrf-R：5'-GGATGGTTTAGGTGGATGG-3'(序列表中SEQ ID No.6))。扩增序列全长为494bp。PCR反应体系为10μl：金牌Mix 8.5μl，lcrf-F 0.5μl，lcrf-R 0.5μl，模板DNA 0.5μl。PCR扩增程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸10s，30次循环，72℃延伸5min。然后进行电泳，能够扩增出494bp条带的样品为含有lcrf2片段的纯合单株(部分检测结果见附图2)。

对能够扩增出483bp条带的样品利用lcrf-F与lcrf-R进行PCR扩增，能扩增出494bp条带的样品为含有lcrf1和lcrf2片段的杂合单株，不能扩增出494bp条带的样品为含有lcrf1片段的纯合单株。

对于所检测出的含有lcrf2片段的纯合单株、含有lcrf1和lcrf2片段的杂合单株、含有lcrf1片段的纯合单株各随机选取10株对其7号染色体8899129-9307609区域(参考基因组为蜀恢498的CANU版本，更新日期为2018年11月23，网址：http://www.mbkbase.org/R498/)进行测序，结果显示，含有lcrf2片段的纯合单株两条染色体的该区域均为lcrf2片段，含有lcrf1和lcrf2片段的杂合单株两条染色体的该区域一条为lcrf2片段，一条为lcrf1片段，含有lcrf1片段的纯合单株两条染色体的该区域均为lcrf1片段。

F2群体成熟后，分单株收获1000个单株的籽粒，然后对单株籽粒进行镉含量检测。结合基因型检测数据，最终结果表明，1000株单株中有含有lcrf2的纯合单株253株，单株籽粒镉含量的结果介于0.01～0.04mg/kg，平均为0.02mg/kg；含有lcrf1与lcrf2的杂合单株498株，单株籽粒镉含量的结果介于0.21～0.57mg/kg，平均为0.39mg/kg，显著高于含有lcrf2的纯合单株籽粒镉含量；含有lcrf1的纯合单株249株，单株籽粒镉含量的结果介于0.23～0.63mg/kg，平均为0.41mg/kg，显著高于含有lcrf2的纯合单株籽粒镉含量。含有lcrf1与lcrf2的杂合单株与含有lcrf1的纯合单株籽粒镉含量无显著差异。

之后将另一部分F2种子播种到高度镉污染田(土壤全镉含量为3.5mg/kg)，获得F2群体2。插秧后依然取1000个单株提取基因组DNA，按照上述方法检测每个单株的基因型。而后对于所检测出的含有lcrf2片段的纯合单株、含有lcrf1和lcrf2片段的杂合单株、含有lcrf1片段的纯合单株各随机选取10株对其7号染色体8899129-9307609区域(参考基因组为蜀恢498的CANU版本，更新日期为2018年11月23，网址：http://www.mbkbase.org/R498/)进行测序，结果显示，含有lcrf2片段的纯合单株两条染色体的该区域均为lcrf2片段，含有lcrf1和lcrf2片段的杂合单株两条染色体的该区域一条为lcrf2片段，一条为lcrf1片段，含有lcrf1片段的纯合单株两条染色体的该区域均为lcrf1片段。F2群体2成熟后，分单株收获该1000个单株的籽粒，然后对单株籽粒进行镉含量检测。最终结果表明，1000株单株中，含有lcrf2的纯合单株255株，单株籽粒镉含量的结果介于0.01～0.07mg/kg，平均为0.05mg/kg；含有lcrf1与lcrf2的杂合单株502株，单株籽粒镉含量的结果介于0.89～6.57mg/kg，平均为3.23mg/kg，显著高于含有lcrf2的纯合单株籽粒镉含量；含有lcrf1的纯合单株243株，单株籽粒镉含量的结果介于0.81～6.62mg/kg，平均为3.27mg/kg，显著高于含有lcrf2的纯合单株籽粒镉含量。含有lcrf1与lcrf2的杂合单株与含有lcrf1的纯合单株籽粒镉含量无显著差异。

以上研究表明，7号染色体8899129-9307609区域lcrf1被lcrf2替换为水稻在重度镉污染田籽粒镉低积累的原因，这两个片段可以作为水稻镉积累分子标记用于水稻育种。

实施例2、水稻镉积累分子标记在水稻育种中的应用

1、水稻低镉材料DGHJ的制备

将珞红4A(作为母本)与黄华占杂交；收种后播种，获得F1群体，将F1群体与黄华占进行回交；收种后播种，获得BC1F1群体，提取BC1F1群体单株基因组DNA，利用实施例1的引物lcrf-F/lcrf-R进行PCR扩增，将能够扩增出494bp条带的样品对应的单株与黄华占回交；收种后播种，获得BC2F1群体，提取BC2F1群体单株基因组DNA，利用实施例1的引物lcrf-F/lcrf-R进行PCR扩增，将能够扩增出494bp条带的样品对应的单株与黄华占回交；收种后再次播种，获得BC3F1群体，提取BC3F1群体单株基因组DNA，利用实施例1的引物lcrf-F/lcrf-R进行PCR扩增，将能够扩增出494bp条带的样品对应的单株与黄华占回交；收种后再次播种，获得BC4F1群体，提取BC4F1群体单株基因组DNA，利用实施例1的引物lcrf-F/lcrf-R进行PCR扩增，将能够扩增出494bp条带的样品对应的单株进行花药培养，获得幼苗后，提取基因组DNA，对所得基因组DNA先用实施例1的引物mf-F/mf-R进行PCR扩增，将不能扩增出483bp条带的样品对应的单株再用实施例1的引物lcrf-F/lcrf-R进行PCR扩增，能够扩增出494bp条带的样品所对应的单株，即为lcrf2片段纯合、综合性状稳定且与黄华占相似的水稻二倍体低镉新材料DGHJ。

对低镉新材料DGHJ的7号染色体8899129-9307609区域(参考基因组为蜀恢498的CANU版本，更新日期为2018年11月23，网址：http://www.mbkbase.org/R498/)进行测序，结果显示，其两条染色体的该区域均为lcrf2片段。

而后将低镉材料DGHJ播种在重度镉污染田(土壤全镉含量为5.0mg/kg)，同时播种黄华占作为对照，成熟后收获籽粒检测镉含量，发现DGHJ的籽粒镉含量为0.04mg/kg，而黄华占的籽粒镉含量为2.15mg/kg。

2、水稻低镉新材料DGZJ的制备

将珞红3A(作为母本)与龙特甫B杂交；收种后播种，获得F1群体；收种后播种，获得F2群体，提取F2群体单株基因组DNA，利用实施例1的引物lcrf-F/lcrf-R进行PCR扩增，将能够扩增出494bp条带的样品对应的单株收种；然后播种，获得F3群体，提取F3群体单株基因组DNA，利用实施例1的引物lcrf-F/lcrf-R进行PCR扩增，将能够扩增出494bp条带的样品对应的单株收种；然后再次播种，获得F4群体，提取F4群体单株基因组DNA，利用实施例1的引物lcrf-F/lcrf-R进行PCR扩增，将能够扩增出494bp条带的样品对应的单株收种；然后再次播种，获得F4群体，提取F4群体单株基因组DNA，先用实施例1的引物mf-F/mf-R进行PCR扩增，将不能扩增出483bp条带的样品再用实施例1的引物lcrf-F/lcrf-R进行PCR扩增，能够扩增出494bp条带的样品所对应的单株，即为含有lcrf2片段的纯合单株，将该含有lcrf2片段的纯合单株再通过自交，获得稳定的综合性状优异的低镉新材料DGZJ。

对低镉新材料DGZJ的7号染色体8899129-9307609区域(参考基因组为蜀恢498的CANU版本，更新日期为2018年11月23，网址：http://www.mbkbase.org/R498/)进行测序，结果显示，其两条染色体的该区域均为lcrf2片段。

而后将低镉材料DGZJ播种在重度镉污染田(土壤全镉含量为5.0mg/kg)，同时播种龙特甫B作为对照，成熟后收获籽粒检测镉含量，发现DGZJ的籽粒镉含量为0.05mg/kg，而龙特甫B的籽粒镉含量为2.73mg/kg。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 湖南杂交水稻研究中心

<120> 水稻镉积累分子标记及其在改良水稻籽粒镉积累上的应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2980

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 1

agctaagcct taactaaacc gcagcgggat caccactcca caggcatcct cgacggcacg 60

gacgaagcct actcctcaga gaaaccttca tctgacctga actcgaactc tggggttggg 120

aaaagtagag caagactgag tactacccac tgtactcagc aagtcatacc ggaatagagg 180

tatgatgcag ggaatcatca aaaaaaaaac taaagtggtt catttgcata aagcgagcat 240

ttataaacag aagttgaaag gtttaaacag ttgtaataat taatgattat taatcatccg 300

ctgtccaacg ctaacctacg ttgcgacagg cccaaccatc cacctaaacc atccaaatta 360

aaagattaca ctaaggtgag actaatcacg gtgaatctgg ttgaccgccc ataaccgcgg 420

gcacggctat tcgaatagtt ttactctgat cagaggtgta caactgtacc cacaagacac 480

agccccacga cacgtttccg tgcgccgaca tgtcaccacg acatatcgga aagaggccgt 540

gacaggacca ttcgcataac cccctctaac caagcacacc acacctcagg tttcaccccc 600

actcctcgca aggtagcggg cagtcccctc tcgtgcctag gtgaatccga aagccgcata 660

ggccgtcgca gggcccatcc aaactccatc acgcccaccc ttgcctggat gcgtctgcta 720

ggggaaagct acactacaag cccagccgtt gcccatgctg gcttgtggta agtacgttaa 780

gttcttccag ggcatcccgc gaaccggtcc ttaactgcca tgggtgcgac cagcaaaacc 840

atgcacccac agcccaccat gtgattcatt ttatttaacc aacaccagag cggtggtact 900

aatccaacat taccagaaga accaacagtc taaacattaa tatgattttc cccattgtga 960

actagttgaa ctaagcatgg ctaagcaatt cctagtccaa actctaatca tgttataacc 1020

ccaagctaac aaaggagcat ggtatccaaa aagcatggct gtaacaatag gtaaccctcc 1080

ccaaagtaat attgtaaaac aatgcaatat ttgaaaggaa acaatagagc atttgcaata 1140

taggatcaac atgttcaagt gacaagcatg acttgccttg ctctgctgct ggaggaacct 1200

cggcgactat ctcgaagtac actggagcgt cggaggaatc ggaatctagc gacatacaaa 1260

gcaaacattg caaaaaggct attagactac tgaaacagag gacaaaacca tttttaatgg 1320

attctacaca tttttcttga tttactgaga cttgaatggg cttaaacgga gctcggatga 1380

attagttatg aattttagaa gattcactat gtttgttact ataaaagaaa aaccttaaac 1440

aatttattgc gcaatatctt ccagggctga cgtcagcaca gagggggggt gcggcgccga 1500

catgcgggcc ccaccggtca gcggctcagg gggagcggtt caccgtggac cgggaccacg 1560

cgggtggtcc accgccggtc cacgggaccg acggcccaga tcgccctcgg gccgatcgga 1620

tgggcggcgg tagcggcagc cgccgggctc acctctgcat caaagccaac cggccgaccc 1680

gtgctaacgg cggcggcacg cgcgcgtcgc gttgagggcg acggcatccg gcggcggagg 1740

cgacggcaca aaggcgacgc gaaagcggcg gcagtcgaag gcgacggcgc gcgactcgaa 1800

gcggcggcgc ggcactaaag aggagaggaa ggggaaaaga ggggaggggc tgcctcaccg 1860

agggtggccg gcgcggagga agacgatggc gaacggcgac agcaagccgc gggaggatga 1920

cgtcggcggg cggacgagct tcggggtgcc ctagggaagg agaagagagg gattagagag 1980

aggggaatga accacggcga ccggaaacca tggccgaagg cggcggtaga gatggtgctc 2040

acccgtgcgc gtggggatgg gggctccggc gacgaacctc gacggaggag gggtggacga 2100

ggtggatctc ggccacgcga atcgaacggc ggcgatggcg caagacggcg gcgagcctag 2160

cggcggctag cggcggccgg agtagcggaa acggcggcgg caagaggttg cacagcgcgg 2220

gggcgatggg aggctcgaga gagtgcggcg aaatggggaa aaagtgagag gggacgacgg 2280

cgatgcttaa atagggggag aggggaccgg acgtggccgg gagaggcggg aatcaccggc 2340

cgacgcgggg gagtggggga ggagagagag gcgggattcg aaaatcgaat cccggccatc 2400

tcgggcgcgg gctcgagcgg gagagagagg ggagtgggcg cggaagacgg cgcacgcgcg 2460

ggcgtggacg acgtggcccg acaggtgggt gcggcggcgg tttcgggcgc ggcggcgcga 2520

gcgagggcgg cggtaggtgg gggaaggacc caacaggtgg gccccacctg tcggcgaccc 2580

cggagaggag ggcggcgggc ggcctggctg ggcctcggcc tgcggccggc ccagcaagga 2640

ggaggggaag gaatgggccg gcggcccatt cgaaaaaaag aggaaaaagg gagggaaaag 2700

aaaaagaaaa aaaagaaaaa ggaaaaaggg ttttccctgg aattaaaata ttgcttgctc 2760

cattttaatt ggttaaaatt atttctagag ctctgaaaat tccactaaaa atcctgttag 2820

tgaatttcga catgtagaac tcaaaaaaaa ttccacatgt cagatccgat tattatttgc 2880

attactttct tagggttttc tcctgatttg caccggtatt ttcttagggt catttataaa 2940

ttacaatttt ggcttgggag gaaaacttcg gggtgtgaca 2980

<210> 2

<211> 3609

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 2

cgccgaattg taggagttga caacgtcgtc gatgaagaag aatacaacca gaatcttcat 60

gtaagacctc acattgacct tgacgatgat ctccaagagc ctgtggcata tgctcattta 120

gatcatatgg aaggcataac agctaagcct taactaaacc gcagcgggat caccactcca 180

caggcatcct cgacggcacg gacgaagcct actcctcaga gaaaccttca tctgacctga 240

actcgaactc tggggttggg aaaagtagag caagactgag tactacccac tgtactcagc 300

aagtcatacc ggaatagagg tatgatgcag ggaatcatca aaaaaaaaac taaagtggtt 360

catttgcata aagcgagcat ttataaacag aagttgaaag gtttaaacag ttgtaataat 420

taatgattat taatcatccg ctgtccaacg ctaacctacg ttgcgacagg cccaaccatc 480

cacctaaacc atccaaatta aaagattaca ctaaggtgag actaatcacg gtgaatctgg 540

ttgaccgccc ataaccgcgg gcacggctat tcgaatagtt ttactctgat cagaggtgta 600

caactgtacc cacaagacac agccccacga cacgtttccg tgcgccgaca tgtcaccacg 660

acatatcgga aagaggccgt gacaggacca ttcgcataac cccctctaac caagcacacc 720

acacctcagg tttcaccccc actcctcgca aggtagcggg cagtcccctc tcgtgcctag 780

gtgaatccga aagccgcata ggccgtcgca gggcccatcc aaactccatc acgcccaccc 840

ttgcctggat gcgtctgcta ggggaaagct acactacaag cccagccgtt gcccatgctg 900

gcttgtggta agtacgttaa gttcttccag ggcatcccgc gaaccggtcc ttaactgcca 960

tgggtgcgac cagcaaaacc atgcacccac agcccaccat gtgattcatt ttatttaacc 1020

aacaccagag cggtggtact aatccaacat taccagaaga accaacagtc taaacattaa 1080

tatgattttc cccattgtga actagttgaa ctaagcatgg ctaagcaatt cctagtccaa 1140

actctaatca tgttataacc ccaagctaac aaaggagcat ggtatccaaa aagcatggct 1200

gtaacaatag gtaaccctcc ccaaagtaat attgtaaaac aatgcaatat ttgaaaggaa 1260

acaatagagc atttgcaata taggatcaac atgttcaagt gacaagcatg acttgccttg 1320

ctctgctgct ggaggaacct cggcgactat ctcgaagtac actggagcgt cggaggaatc 1380

ggaatctagc gacatacaaa gcaaacattg caaaaaggct attagactac tgaaacagag 1440

gacaaaacca tttttaatgg attctacaca tttttcttga tttactgaga cttgaatggg 1500

cttaaacgga gctcggatga attagttatg aattttagaa gattcactat gtttgttact 1560

ataaaagaaa aaccttaaac aatttattgc gcaatatctt ccagggctga cgtcagcaca 1620

gagggggggt gcggcgccga catgcgggcc ccaccggtca gcggctcagg gggagcggtt 1680

caccgtggac cgggaccacg cgggtggtcc accgccggtc cacgggaccg acggcccaga 1740

tcgccctcgg gccgatcgga tgggcggcgg tagcggcagc cgccgggctc acctctgcat 1800

caaagccaac cggccgaccc gtgctaacgg cggcggcacg cgcgcgtcgc gttgagggcg 1860

acggcatccg gcggcggagg cgacggcaca aaggcgacgc gaaagcggcg gcagtcgaag 1920

gcgacggcgc gcgactcgaa gcggcggcgc ggcactaaag aggagaggaa ggggaaaaga 1980

ggggaggggc tgcctcaccg agggtggccg gcgcggagga agacgatggc gaacggcgac 2040

agcaagccgc gggaggatga cgtcggcggg cggacgagct tcggggtgcc ctagggaagg 2100

agaagagagg gattagagag aggggaatga accacggcga ccggaaacca tggccgaagg 2160

cggcggtaga gatggtgctc acccgtgcgc gtggggatgg gggctccggc gacgaacctc 2220

gacggaggag gggtggacga ggtggatctc ggccacgcga atcgaacggc ggcgatggcg 2280

caagacggcg gcgagcctag cggcggctag cggcggccgg agtagcggaa acggcggcgg 2340

caagaggttg cacagcgcgg gggcgatggg aggctcgaga gagtgcggcg aaatggggaa 2400

aaagtgagag gggacgacgg cgatgcttaa atagggggag aggggaccgg acgtggccgg 2460

gagaggcggg aatcaccggc cgacgcgggg gagtggggga ggagagagag gcgggattcg 2520

aaaatcgaat cccggccatc tcgggcgcgg gctcgagcgg gagagagagg ggagtgggcg 2580

cggaagacgg cgcacgcgcg ggcgtggacg acgtggcccg acaggtgggt gcggcggcgg 2640

tttcgggcgc ggcggcgcga gcgagggcgg cggtaggtgg gggaaggacc caacaggtgg 2700

gccccacctg tcggcgaccc cggagaggag ggcggcgggc ggcctggctg ggcctcggcc 2760

tgcggccggc ccagcaagga ggaggggaag gaatgggccg gcggcccatt cgaaaaaaag 2820

aggaaaaagg gagggaaaag aaaaagaaaa aaaagaaaaa ggaaaaaggg ttttccctgg 2880

aattaaaata ttgcttgctc cattttaatt ggttaaaatt atttctagag ctctgaaaat 2940

tccactaaaa atcctgttag tgaatttcga catgtagaac tcaaaaaaaa ttccacatgt 3000

cagatccgat tattatttgc attactttct tagggttttc tcctgatttg caccggtatt 3060

ttcttagggt catttataaa ttacaatttt ggcttgggag gaaaacttcg gggtgtgaca 3120

tctactatag aactaacata tccattcact agttgtggca tggatataag tgaagcatcg 3180

cacaactctt ctttatcacg agaaacatca agcaaattgt tttgtgacaa aagtatttca 3240

gcaattgatt ccactatggg ttgctccaac atagcataag ggtgtgttcg caggtggagg 3300

atgggaaccc atccctcctg cacgcaaatg gagcagcctt ttaacacgta attaattaag 3360

tattagttaa ttttttttga aaaaatggat caatatgaat ttttaaagca actttcgtat 3420

ataaaatttt ttgaaaaaga tgcaccgttt agtagtttga aaagcgtgca tgcggaaaac 3480

gagagaggtg ggttgggaag agggagtgcc aaactcagcc taagtagtgg acatagttgg 3540

cacatcataa atatgcatac cttgagtagt tgtagcacca ttatcattac cttttttctc 3600

atcttcaga 3609

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

acttgacaat cgatccaact agc 23

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

cgaagctttg ctgatcggg 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

cgccgaattg taggagttg 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

ggatggttta ggtggatgg 19

Claims (10)

1.检测水稻镉积累分子标记的物质在鉴定或辅助鉴定水稻籽粒镉低积累性状中的应用，所述水稻镉积累分子标记为水稻7号染色体8899129-9307609区域的DNA片段，所述水稻镉积累分子标记为lcrf1或lcrf2，所述lcrf1为水稻7号染色体8899129-9307609所示的DNA片段，所述lcrf2为序列表中SEQ ID No.1所示的DNA片段。

2.检测权利要求1中所述水稻镉积累分子标记的物质在制备鉴定或辅助鉴定水稻籽粒镉低积累性状产品中的应用。

3.检测权利要求1中所述水稻镉积累分子标记的物质在水稻育种或制备水稻育种产品中的应用。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述检测水稻镉积累分子标记的物质为能区分水稻镉积累分子标记为所述lcrf1和所述lcrf2的PCR引物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述PCR引物为序列表中SEQ ID No.3-6所示的四条单链DNA。

6.鉴定或辅助鉴定水稻籽粒镉低积累性状的方法，包括：检测待测水稻7号染色体8899129-9307609区域的DNA片段，根据待测水稻7号染色体8899129-9307609区域的DNA片段确定所述待测水稻的籽粒镉低积累性状。

7.权利要求6所述的方法或序列表中SEQ ID No.1所示的DNA片段在水稻育种中的应用。

8.水稻育种方法，包括：检测水稻基因组中7号染色体8899129-9307609区域的DNA片段，选择7号染色体8899129-9307609区域的DNA片段为序列表中SEQ ID No.1的纯合型或杂合型水稻作为亲本进行育种。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述水稻育种为培育籽粒镉低积累水稻。

10.下述X1或X2：

X1、权利要求1-5中任一所述检测水稻镉积累分子标记的物质；

X2、序列表中SEQ ID No.1所示的DNA片段。

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