CN116622887A - 一种快速鉴定白掌杂交后代的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速鉴定白掌杂交后代的方法，通过利用筛选的16对SRAP分子引物组合，可以快速准确的鉴别出真假白掌杂种，减少育种的相关步骤，缩短育种周期，提高育种效率。通过对白掌属植物种间杂交的2个组合10份杂交后代进行了真假杂种的鉴定，结果表明，SRAP分子标记技术可以快速有效的对白掌杂交后代进行鉴定，为白掌种质创新和遗传改良提供技术和理论支持。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，尤其涉及一种快速鉴定白掌杂交后代的方法。
背景技术
白掌(Spathiphyllum Schott)是白鹤芋属植物属天南星科，原产中南美洲和东南亚(李恒，1979)。该属植物有较好的耐阴性，具观赏性强的佛焰花序，是国际上重要的室内观叶观花植物。上世纪80年代开始大量作为商品性观赏植物引入中国，成为了中国观叶植物产业发展的先锋和重要观叶植物(廖飞雄等，2011)。
天南星科植物有较独特的开花特性和花序结构，目前有关白掌的研究主要集中在组织培养、栽培技术、种子萌芽特性、开花习性等生物学特性研究(朱根发等，1997；詹启成等，2012；戴桦均等，2012)。关于白掌杂交后代鉴定方面的研究还比较少。
相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)是基于PCR技术的一种新型分子标记技术。本发明利用前期的研究(刘小飞,廖飞雄,李冬梅,刘晓荣.基于SRAP标记的白鹤芋属资源鉴定与亲缘关系分析[J].广东农业科学，2017，44(11):26-31.)中筛选到的多态性SRAP标记，进一步进行组合筛选，提出一种快速鉴定白掌杂交后代的方法，利用SRAP标记引物组合，对白掌属植物种间杂交的2个组合10份杂交后代进行了真假杂种的鉴定，然后比对具有父本特征带的多态性引物组合结果，筛选出真杂种后代，为后续研究提供技术支持与材料来源。
发明内容
本发明的目的是提出一种快速鉴定白掌杂交后代的方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提出的快速鉴定白掌杂交后代的方法，采用以下步骤：
提取白掌属杂交后代DNA，利用具有父本特征带的SRAP引物组合进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，最后依据父本特征带对试验结果进行统计；
设计合成具有父本特征带的SRAP引物序列如下：
正向引物me1：5'-TGAGTCCAAACCGGATA-3'
正向引物me2：5'-TGAGTCCAAACCGGAGC-3'
正向引物me3：5'-TGAGTCCAAACCGGAAT-3'
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具有父本特征带的SRAP引物组合为如下组合：
me1em1、me1em6、me2em1、me2em4、me2em6、me3em3、me3em5、me4em1、me4em2、me4em3、me4em4、me4em5、me5em4、me5em6。
进一步地，利用具有父本特征带的SRAP引物进行PCR扩增的体系如下：
在25μL SRAP-PCR体系中含2.5mM的dNTPs 2.5μL，2.5U Taq DNA聚合酶，浓度为10mM的上下游引物各0.75μL，模板DNA10 ng，用ddH 2O调整体系使终体积为25μL。
进一步地，利用具有父本特征带的SRAP引物进行PCR扩增的反应程序为94℃预变性5min；94℃l min，35℃40s，72℃2min，6个循环，随后的32个循环复性温度提高到46℃，最后72℃延伸5min，10℃保存。
与现有技术相比，本发明的技术效果：
本发明提出一种快速鉴定白掌杂交后代的方法，通过利用筛选的16对SRAP分子引物组合，可以快速准确的鉴别出真假白掌杂种，减少育种的相关步骤，缩短育种周期，提高育种效率。通过对白掌属植物种间杂交的2个组合10份杂交后代进行了真假杂种的鉴定，结果表明，SRAP分子标记技术可以快速有效的对白掌杂交后代进行鉴定，为白掌种质创新和遗传改良提供技术和理论支持。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的杂交后代SRAP分子鉴定结果。M：marker，sf：S.floribundum，spa：S.‘Parrish’，1-9为spa×sf杂交后代不同株系。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步的详细介绍。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
试验材料为白掌属2个杂交组合的3个种源亲本(如表1所示)及其10份杂交后代(如表2所示)，均种植于广东省农业科学院环境园艺研究所资源圃。
表1杂交组合选用的亲本
表2杂交组合及其后代
实施例1、DNA的提取
采用本发明人前期的研究(刘小飞,廖飞雄,李冬梅,刘晓荣.基于SRAP标记的白鹤芋属资源鉴定与亲缘关系分析[J].广东农业科学，2017，44(11):26-31.)改良的CTAB-氯仿-异戊醇法，单株取嫩叶提取基因组DNA。各取DNA样品原液2μL并稀释至100μL，用ddH2O作为空白对照，校正零点，于核酸蛋白分析仪上测定OD260、OD280、OD260/280的值。OD260/280值在1.8左右，表明提取的DNA纯度较好，可用于后续的分析，若大于1.9说明含有RNA，小于1.6则表示有蛋白质和酚等杂质的存在。
实施例2、SRAP引物筛选
本发明在前期的研究(刘小飞,廖飞雄,李冬梅,刘晓荣.基于SRAP标记的白鹤芋属资源鉴定与亲缘关系分析[J].广东农业科学，2017，44(11):26-31.)基础上，对30对SRAP引物组合进行筛选，从中获得具有扩增条带清晰、丰富的父本特征性条带的14对引物组合，用于杂交后代的真实性鉴定，每一个引物组合重复实验一次，SRAP引物设计合成序列如表3所示。获得具有父本特征的14对引物如下：1、me1em1；2、me1em6；3、me2em1；4、me2em4；5、me2em6；6、me3em3；7、me3em5；8、me4em1；9、me4em2；10、me4em3；11、me4em4；12、me4em5；13、me5em4和14、me5em6。
表3引物的序列
实施例3、DNA扩增和检测
在25μL SRAP-PCR体系中含2.5mM的dNTPs 2.5 2，2.5U Taq DNA聚合酶，上下游引物(浓度为10mM)各0.75游引，模板DNA10 ng，用dd H2O调整体系使终体积为25使终。
反应程序为94℃预变性5min；94℃l min，35℃40s，72℃2min，6个循环，随后的32个循环复性温度提高到46℃，最后72℃延伸5min，10℃保存。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例4白掌杂交后代鉴定
应用以上筛选获得的具有父本特征带的14对有多态性的引物组合对10份杂交后代进行真假杂种鉴定，以清晰稳定的父本特征带为判断依据，每一特征引物组合重复试验一次，此外还同时用多个引物进行鉴定，最后依据父本特征带对试验结果进行统计。结果发现02杂交组合编号为8的株系具有父本条带，表明8株系为真杂交后代其他的为假杂交后代(图1)。这些假杂交后代可以作为选育时的真杂交后代的对照系。
实施例5优良杂交后代选育
基于本发明建立的杂交后代真假杂交鉴定方法，我们开展了在不同的杂交组合，其中以S.‘Coddy’s Color’(scc)做母本进行杂交，所获种子萌发后生长势旺盛，从该组合中筛选出优良杂交后代，经过SRAP分子标记鉴定为真杂种，构建无性系群体，对比亲本的性状分析，观察其在大田中的表现，选育出优良品系1个。通过SRAP分子标记组合鉴定杂交后代，可以快速准确的鉴别出真假杂种，减少育种的相关步骤，缩短育种周期，提高育种效率。
以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。
Claims (3)
1.一种快速鉴定白掌杂交后代的方法，其特征在于，采用以下步骤：
提取白掌属杂交后代DNA，利用具有父本特征带的SRAP引物组合进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，最后依据父本特征带对试验结果进行统计；
设计合成具有父本特征带的SRAP引物序列如下：
正向引物me1：5'-TGAGTCCAAACCGGATA-3'
正向引物me2：5'-TGAGTCCAAACCGGAGC-3'
正向引物me3：5'-TGAGTCCAAACCGGAAT-3'
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具有父本特征带的SRAP引物组合为如下组合：
me1em1、me1em6、me2em1、me2em4、me2em6、me3em3、me3em5、me4em1、me4em2、me4em3、me4em4、me4em5、me5em4、me5em6。
2.根据权利要求1所述的快速鉴定白掌杂交后代的方法，其特征在于，利用具有父本特征带的SRAP引物进行PCR扩增的体系如下：
在25μL SRAP-PCR体系中含2.5mM的dNTPs 2.5μL，2.5U Taq DNA聚合酶，浓度为10mM的上下游引物各0.75μL，模板DNA10 ng，用dd H2O调整体系使终体积为25μL。
3.根据权利要求2所述的快速鉴定白掌杂交后代的方法，其特征在于，利用具有父本特征带的SRAP引物进行PCR扩增的反应程序为94℃预变性5min；94℃l min，35℃40s，72℃2min，6个循环，随后的32个循环复性温度提高到46℃，最后72℃延伸5min，10℃保存。
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