CN110878376A

CN110878376A - 用于鉴定霍山石斛的ssr分子标记引物及其应用

Info

Publication number: CN110878376A
Application number: CN201911422010.3A
Authority: CN
Inventors: 王晖; 时玲玲; 李暮淋; 张梦函; 陆颖; 周珏
Original assignee: Anhui Normal University
Current assignee: Anhui Longjianhu Biotechnology Co ltd; Xu Renfa
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2020-03-13
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN110878376B

Abstract

本发明提供了用于鉴定霍山石斛的SSR分子标记引物及其应用，与现有技术相比，本发明提供的10个多态性引物组合可将霍山石斛与铁皮石斛，铜皮石斛等区分开来，操作简单、重现性好、准确度高，可有效克服用表型鉴定难以准确区分的缺点。本发明还能用于石斛遗传多样性的研究、石斛遗传图谱的构建、石斛种群的亲缘关系及演化和石斛遗传育种中的应用等。

Description

用于鉴定霍山石斛的SSR分子标记引物及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及用于鉴定霍山石斛的SSR分子标记引物及其应用。

背景技术

霍山石斛(Dendrobium huoshanense CZ.Tang et S.J.Chen)又称米斛，是兰科石斛属多年生草本植物，主要分布于我国霍山大别山及邻近地区，具有极高的观赏和药用价值，自古以来被认为是药用石斛中的珍品，享有“中华仙草之最”的美誉，现代药理研究表明：霍山石斛具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等功效，在治疗白内障和降糖保肝方面有很好的作用。但由于其对生活环境的要求极为苛刻，且自身生长缓慢，加之遭到过度采挖，霍山石斛野生资源濒临灭绝。

关于霍山石斛的研究较多，如专利相关的有霍山石斛棚内栽培方法，霍山石斛组培苗培育及炼苗方法，一种霍山石斛枫斗加工方法，一种提高霍山石斛生物碱含量基质的制作方法等，大多停留在霍山石斛的栽培与加工方面。

但是，目前，霍山石斛产业存在种源混乱、质量混乱、名称使用混乱的情况，很多人认为只要是从霍山出来的石斛就是霍山石斛，这种状况是对霍山石斛的一种误解。霍山石斛的种源是霍山石斛产业发展的源头，如果种源质量无法保证，那么霍山石斛产业发展将被大大遏制，因此霍山石斛种质资源的鉴别尤为重要。

传统的霍山石斛鉴定主要根据花型、花色、叶型、叶色，茎等形态特征或农艺性状进行鉴定，主要测试品种的特异性、一致性和稳定性，这种表型鉴定方法一般只适用于那些表型差异较大的品种，而且极易受到环境影响，且霍山石斛加工成枫斗后与其他石斛类枫斗更难区分，通过形态特征鉴别常常因为主观原因产生误判，鉴定效率较低。

DNA分子标记技术具有遗传稳定、不受环境影响和检测迅速准确等优点，可以快速准确地鉴定一些外形很难区分的植物种群。近年来微卫星分子标记被广泛应用,是一种比较理想的分子标记技术。微卫星DNA(microsatelite DNA)又称为简单序列重复(simplesequence repeats,SSRs)或者短串联重复序列(short tandem repeats,STR)，是指以少数几个核苷酸(1-6个)为重复单位的简单串联重复序列,通常为2-3个核苷酸。微卫星由核心序列和侧翼序列组成,其核心序列呈串联重复排列,由于重复单元的数目不同,微卫星呈现出多态性,这也就是SSR成为分子标记的根本。侧翼序列DNA位于核心序列的两侧,为相对保守的特异的单拷贝序列，能使微卫星特异地定位于染色体常染色质区的特定部位,均匀地分布在整个真核生物基因组中。其特点有：(1)微卫星呈共显性遗传,符合孟德尔遗传规律,可以鉴别个体是杂合子还是纯合子,在植物个体鉴定方面具有特殊意义；(2)直接以DNA的形式表现,不受组织特异性、发育阶段、季节、环境等影响；(3)PCR技术进行检测，需要样品少,仅需微量组织,并且对质量要求也不高，即便部分DNA降解,也能有效地分析鉴定；(4)标记的带型简单,条带一致,客观明确；(5)SSR标记数量丰富,分布广,覆盖整个基因组,揭示的多态性高；(6)具有多个等位基因,信息量大,能够区分亲缘关系较近的个体；(7)实验重复性好,结果可靠性高。

因此，利用分子标记鉴别霍山石斛及其混伪种是十分必要的，与其他的分子标记相比，SSR分子标记检测具有灵敏度高、数量丰富、多态性高、共显性、重复性好和操作简单等特点，是用来鉴定霍山石斛种质资源的理想标记。

现有技术关于霍山石斛的分子标记技术的研究，采用的方法较为传统，使用磁珠富集法筛选多态性引物，筛选的引物多态性不高，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果并不能准确的将霍山石斛与其混伪种进行区分。

发明内容

本发明的目的在于提供用于鉴定霍山石斛的SSR分子标记引物，包括10个引物组合，能够准确快速的将霍山石斛与其近缘种、混伪品区别开来。尤其可以用来准确鉴定霍山石斛与铁皮石斛，铜皮石斛。

本发明的另一目的在于提供用于鉴定霍山石斛的SSR分子标记引物的应用，用于石斛种植资源的鉴定、石斛遗传多样性的研究、石斛遗传图谱的构建、石斛种群的亲缘关系及演化和石斛遗传育种。

本发明具体技术方案如下：

用于鉴定霍山石斛的SSR分子标记引物，包括10个引物组合，为：

HS10 F：5’-GAACTTCTAATCTTCACCGTCCA-3’；HS10 R：5^’-TATAAGGATCCAATGCCTTCTCG-3’；

HS12 F:5’-AACTTCACTTAACGTCCAGCAAC-3’；HS12 R:5’-CAATATATTCGAGTGCTCTAGCCA-3’；

HS20 F:5’-CACGTAACCAGCTCTTCTGAGTT-3’；HS20 R:5’-GAATTCACCGGAGGATTAACAAT-3’；

HS23 F:5’-TTAAGAGAAGCAGAAGCAGAAGC-3’；HS23 R:5’-GTCTCACCCCTCGATTTCATAAT-3’；

HS48 F:5’-GACATTGTTGCAATCAGAACTCA-3’；HS48 R:5’-AACATCTATCAGGTTTGGAACGA-3’；

HS51 F:5’-AAGCTGAATATGAACTCTGCCAC-3’；HS51 R:5’-AGTTTTGCGTACTGAACACATCA-3’；

HS102 F:5’-GAGTTGATCCATCAGAATCATCC-3’；HS102 R:5’-TGAGCAATTACAGCATCAACATC-3’；

HS115 F:5’-AACAGATGCATCCTGATCACTAAC-3’；HS115 R:5’-CCCGTTCACTGACGAAGAAT-3’；

HS21 F:5’-TCCACTACAGACCGAGGAAGATA-3’；HS21 R:5’-TTAAGTACAACTCCACCGCAAGT-3’；

HS59 F:5’-AGAACAGCTATCACAGCGAGAAC-3’；HS59 R:5’-TGTCTCTTCAACAGCAGCTTTAC-3’。

上述10对引物，核苷酸序列如SEQUENCE LISTING NO.1-20。

用于鉴定霍山石斛的SSR分子标记引物的应用，具体用于石斛种植资源的鉴定、石斛遗传多样性的研究、石斛遗传图谱的构建、石斛种群的亲缘关系及演化和石斛遗传育种。研究结果表明10个SSR引物中多态性最高的为HS12，PIC(多态信息含量)为0.794，多态性最低的为HS20，PIC为0,253，引物数据分析信息见表1。霍山石斛每个位点的基因多样性介于0.2189～0.7291之间，每个居群的基因多样性介于0.3417～0.6541之间，铁皮石斛居群的基因多样性为0.4641，铜皮石斛居群的遗传多样为0.5546，引物和不同居群数据分析信息见表2。霍山石斛居群Fis(近交系数)在-0.01～0,118之间，多数居群的Fis<0,不同居群近交系数信息见表3，结果表明霍山石斛组培居群种质资源来源较为复杂，霍山石斛野生居群的形成可能受到外源基因流的影响，基于本发明提供的10个SSR构建的系统发育树结果表明，霍山石斛居群采集地点较近的居群聚类在一起，此外铜皮石斛较铁皮石斛与霍山石斛的亲缘关系更近。

表1 10个多态性引物数据分析

表2 引物和不同居群数据分析信息

表3 不同居群近交系数信息

进一步的，用于鉴定霍山石斛的SSR分子标记引物用于石斛种植资源的鉴定的方法具体为：

1)提取待鉴定石斛的基因组DNA；

2)以提取的DNA为模板，利用上述用于鉴定霍山石斛的SSR分子标记引物进行PCR扩增；

3)PCR扩增产物进行测序，构建NJ系统进化树和/或UPGMA系统树和/或聚类图，用于鉴定。

进一步的，步骤1)中所述提取待鉴定石斛的基因组DNA的方法为：

称取干燥的待鉴定石斛叶片0.020g,放入标记好的EP管内，加入已经灭菌好的钢珠一颗，使用核酸提取仪震荡研磨60s,取出钢珠；加入1.4ml CTABfree液，恒温摇床摇匀30min,离心机10000rpm离心15min,去除上清液；再向EP管中加入经65℃预热的2％CTAB液700μl，混合均匀，65℃水浴1h,每10min手动摇匀一次；水浴结束待溶液冷却至室温，进行离心，10000rpm条件下离心15min,小心吸取上清液700μl,转移到另一1.5ml离心管中，并加入70μl的提前预热的10％CTAB，摇匀；再加入氯仿/异戊醇溶液混匀，将离心管放入摇床中摇匀10min,取出后进行12000rpm离心洗脱15min，取上清液至另一离心管，使用氯仿/异戊醇溶液按照同样的方法重复洗脱两次；向获得的上清液中加入200μlNaCl溶液以及400μl-20℃预冷的异戊醇，混匀，放置于-20℃冰箱内冷冻2h；取出，12000rpm条件下进行离心15min，弃上清，向离心管中加入1000μl75％无水乙醇清洗沉淀物两次，再用1000μl无水乙醇清洗一次，自然风干；加入100μl的TE缓冲液，室温静置2h,将获得的DNA原液在1.0％琼脂糖凝胶电泳中检测是否具有明亮、清晰的条带，再用分光光度计检测DNA浓度，并稀释至20-30ng/μl,放置于-20℃冰箱内备用。

其中，核酸提取仪型号为FastprepFP120。

提取过程中，传统方法使用液氮将叶片迅速研磨成粉末，本发明使用FastprepFP120快速核酸提取仪处理叶片，此样品处理系统与目前已有的其它样品制备方法相比，此方法可同时处理24个样品。它采用快速8字形振荡方式，配合钢珠，可以高效充分地破碎样品，具有通用性广、高效灵活的优点。本发明先加入CTABfree液，提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏，同时抑制DNA酶的活性。本发明加入预热的10％CTAB溶液，能够使DNA在高盐溶液中与CTAB结合形成复合物并且溶解于高盐溶液中，为下一步DNA的完全洗脱做准备。

步骤2)中PCR扩增具体为：采用15μL反应体系：7.5μl 2×TSINGKE Master Mix,1.5μl10μmol/L的上下游引物，2μlDNA模板，ddH₂O补足至15μl；PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性45s，57℃退火35s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸8min；4℃保存。

2×TSINGKE Master Mix购自北京擎科新业生物技术有限公司。

步骤3)具体为：PCR扩增产物送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序分析，获得的毛细管电泳图，结果采用软件GeneMarkerV1.97对毛细管电泳图结果进行数据分析，使用软件popTree构建NJ系统进化树和UPGMA系统树，No.of Bootstrap Replications为1000，Model采用Kimura 2-parameter model，构建的NJ系统进化树和UPGMA系统树用于鉴定。

在以往的技术手段中，通过一个SSR引物扩增霍山石斛及其混伪品，将扩增产物在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中进行粗略读数，进而确定石斛的分类关系，此技术中使用的石斛种群的样品个数较少，并不具有通用性，且实际品种鉴别中，同一引物在同一石斛种群中扩增的目的条带长度有差异，差异在几个碱基长度甚至几十个碱基长度不等，且亲缘关系较近的石斛种群目的条带长度的差异较小，或目的条带长度相同，在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中无法进行鉴别，因此仅仅通过以往技术中的方法鉴别霍山石斛及其近源种，混伪种远不能达到准确鉴定霍山石斛的目的。

与现有技术相比，本发明通过大量筛选确定了能够用于霍山石斛品种鉴定的最优10个SSR分子标记组合。利用本发明提供的引物组合进行霍山石斛的品种鉴定，具有扩增片段清晰、分辨力高、灵敏度好、结果可靠准确、高效快速等优点，能够将霍山石斛及其近缘种进行鉴定。

附图说明

图1为本发明实施例1提取的霍山石斛基因组DNA的电泳结果；

图2为本发明实施例1提取的铁皮石斛和铜皮石斛基因组DNA的电泳结果；

图3为本发明实施例1中部分石斛PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果；

图4为本发明实施例1中6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染法结果；

图5为本发明构建的系统进化NJ树；

图6为本发明构建的系统进化UPGMA树；

图7为本发明获得的霍山石斛与铜皮石斛聚类图；

图8为本发明获得的霍山石斛与铁皮石斛聚类图。

具体实施方式

实施例1

用于鉴定霍山石斛的SSR分子标记引物，包括10个引物组合，通过以下方法获得：

1、石斛转录组信息采集

将从霍山采集的1个霍山石斛样品送至深圳华大基因科技服务有限公司进行转录组信息采集与分析，用于后续引物设计，根据上述信息采集和分析，筛选出的SSR分子标记位点要求二核苷酸重复数≥6，三核苷酸重复数≥5，四核苷酸重复数≥4，五，六核苷酸重复数≥3。

2、石斛基因组DNA提取

霍山石斛，铁皮石斛，铜皮石斛主要采自安徽大别山，霍山石斛样品154个，铁皮石斛样品12个(其中6个样品采自浙江)，铜皮石斛样品16个，共采集样品182个，具体采集样品信息见表4。将采集的样品及时用硅胶干燥，干燥后使用CTAB法提取基因组DNA。

首先进行试剂配制：

Tris-HCL溶液(pH8.0):Tris(12.11g),浓盐酸(4.2ml),添加，添加蒸馏水定容至100ml。

NaCl溶液:NaCl(23.376g),用蒸馏水定容至100ml。

EDTA溶液(pH 8.0):EDTA(18.61g)NaOH(2g左右),蒸馏水定容至100ml。

CTAB free溶液：β-巯基乙醇(2ml),100μmol/L Tris-HCL溶液(10ml),20mmol/L

EDTA(10ml),NaCL(1.46g),PVP(2g),蒸馏水定容至100ml。

2％CTAB溶液：CTAB(2g),Tris-HCL溶液(10ml),EDTA(4ml),NaCL(8.19g),PVP(2g),β-巯基乙醇(2ml),蒸馏水定容至100ml。

10％CTAB溶液：CTAB(10g),NaCL(4.10g)，蒸馏水定容至100ml。

TE缓冲液：Tris-HCL溶液(1ml)，EDTA(0.2ml)，蒸馏水定容至100ml。

氯仿/异戊醇：氯仿、异戊醇按照24：1的比例混合，存储于棕色瓶中。

以上溶液混匀灭菌后使用，其中CTAB free溶液，2％CTAB溶液，混匀灭菌后再加入巯基乙醇。

具体操作步骤如下：

1)称取干燥的待鉴定石斛叶片0.020g,放入标记好的EP管内，加入已经灭菌好的钢珠一颗，使用核酸提取仪震荡研磨60s,取出钢珠；

2)向上述EP管内加入1.4ml CTABfree液，37℃摇床摇匀30min,离心机10000rpm离心15min,去除上清液；

3)再向上述EP管中加入经65℃预热的2％CTAB液700μl，混合均匀，65℃水浴1h,每10min手动摇匀一次；

4)水浴结束待溶液冷却至室温，进行常温离心，10000rpm条件下离心15min,小心吸取上清液700μl,转移到另一1.5ml离心管中，并加入70μl的提前预热的10％CTAB，摇匀；

5)再向上述1.5ml离心管中加入氯仿/异戊醇溶液混匀，将离心管放入摇床中摇匀10min,取出后进行12000rpm离心15min，取上清液至另一1.5ml离心管；

6)向含有上清液的离心管中加入氯仿/异戊醇溶液，重复步骤5的操作两次；取上清液至另一1.5ml离心管；

7)向离心管中加入200μlNaCl溶液以及400μl-20℃预冷的异戊醇，混匀，放置于-20℃冰箱内冷冻2h；

8)取出离心管，12000rpm条件下离心15min，弃上清，75％无水乙醇清洗沉淀物两次，再用1000μl无水乙醇清洗一次，自然风干；

9)加入100μl的TE缓冲液，室温静置2h,将获得的DNA原液在1.0％琼脂糖凝胶电泳中检测是否具有明亮、清晰的条带，再用分光光度计检测DNA浓度，并稀释至20-30ng/μl,放置于-20℃冰箱内备用。部分电泳检测结果见图1，图2，图1为部分霍山石斛基因组提取的电泳结果，标号1-12为霍山石斛TZ居群12个个体的电泳结果，标号13-19为DJL1-DJL7个体的电泳结果，其中M为MarKⅢ,图2中1-12为铁皮石斛Fe1-Fe12基因组提取的电泳图，图2中13-24为铜皮石斛编号To1-To12个体基因组提取的电泳图，其中M为MarKerⅢ(天根生化科技(北京)有限公司)。

表4 石斛样品采集信息

3、PCR扩增与引物筛选：

对霍山石斛转录组信息进行采集与分析，使用Primer5对检测到的SSR进行引物设计，共设计合成120对EST-SSR引物，分别从霍山石斛WJD，DJL，TZ这3个居群中各随机选取四个个体，分别为WJD1，WJD3，WJD5，WJD9；DJL3，DJL4，DJL7，DJL9；TZ1,TZ5,TZ8，TZ9，共12个个体进行PCR扩增，PCR扩增采用15μL反应体系：7.5μl2×TSINGKE Master Mix(北京擎科新业生物技术有限公司),1.5μl的10μmol/L上下游引物，2μlDNA模板，ddH₂O补足至15μl。PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性45s，57℃退火35s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸8min；4℃保存。

将PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，共筛选出90对扩增条带清晰明亮，条带长度在100-300bp的通用性引物，将90对通用引物在霍山石斛WJD，DJL，TZ，KS，JXZ，YK，HSD，JZ8个居群中分别随机选取3个个体，分别是WJD1-WJD3,DJL1-DJL3，TZ1-TZ3，KS1-KS3，JXZ1-JXZ3，YK1-YK3，HSD1-HSD3，JZ1-JZ3共24个个体进行PCR扩增，与上述同样反应体系和扩增程序，扩增产物使用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染法进行检测，图4为引物HS20和引物HS51在霍山石斛居群中扩增的聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳图，图中引物HS20扩增产物的电泳图中，1-3为WJD1-WJD3,4-6为DJL1-DJL3，7-9为TZ1-TZ3，10-12为KS1-KS3，引物HS51扩增产物的电泳图中，编号13-15为WJD1-WJD3，16-19为DJL1-DJL4,20-23为KS1-KS4,编号24为PR1。筛选出多态性丰富的10对EST-SSR引物。采用不同颜色的FAM、HEX、TAMRA、ROX荧光素进行标记，10个EST-SSR引物信息及荧光标记如表5。

表5 10个EST-SSR引物信息及荧光标记信息

用于鉴定霍山石斛的SSR分子标记引物用于石斛种植资源的鉴定，具体用于鉴定霍山石斛与铁皮石斛，铜皮石斛，方法如下：

使用上述表2中10个荧光标记SSR引物对上述表1采集的3个石斛种群(霍山石斛与铁皮石斛，铜皮石斛)182个个体进行PCR扩增，PCR扩增反应体系与扩增程序：PCR扩增采用15μL反应体系：7.5μl2×TSINGKE Master Mix(北京擎科新业生物技术有限公司),1.5μl的10μmol/L上下游引物，2μlDNA模板，ddH₂O补足至15μl。PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性45s，57℃退火35s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸8min；4℃保存。将PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，保证目的产物有清晰明亮的条带。PCR扩增产物部分电泳检测结果见图3，图3为引物HS51在霍山石斛，铁皮石斛和铜皮石斛扩增的电泳检测图，其中M为MarkerⅡ(天根生化科技(北京)有限公司)，1-8分别为霍山石斛PYT5-PYT12，9-16为铁皮石斛Fe1-Fe8，17-24为铜皮石斛To1-To8。

上述获得的PCR扩增产物送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，获得的毛细管电泳图结果采用软件GeneMarkerV1.97对毛细管电泳图结果进行数据分析，使用软件Structure2.3构建石斛种群的聚类图，Length of Burnin Period设置为10000，Numberof MCMC Reps after Burnin设置为10000,使用Admixture Model。使用软件popTree构建NJ系统进化树和UPGMA系统树，No.of Bootstrap Replications为1000，Model采用Kimura2-parameter model。如图5-图8所示，霍山石斛与铁皮石斛，铜皮石斛在Structure,NJ树，UPGMA树中能够准确的鉴别。

从表1、表2和表3给出的数据可见筛选的引物多态性较高。从构建的系统进化树图可见此引物组合能较好的区分霍山石斛和混伪种。通过转录组筛选出的120对引物可见采集的霍山石斛信息较为全面。

本发明克服了传统品种鉴别技术手段的缺点，本发明使用的石斛样品数较多，且采集了霍山石斛野生资源和栽培资源，通过霍山石斛转录组信息设计并筛选特异性引物，基于表达序列开发的SSR标记效率更高，采集的霍山石斛基因组信息较为全面，筛选的引物多态性更高，利用本发明提供SSR引物组合能够较好的将霍山石斛与其近缘种、混伪品区别开来。而且基于表达数据的SSR标记是基于某一时期的基因表达序列，与基因功能和性状表型直接相关，在珍稀濒危动植物种质资源和遗传多样性评估等方面有着重要的研究价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽师范大学

<120> 用于鉴定霍山石斛的SSR分子标记引物及其应用

<130> 1

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> HS10上游引物F

<400> 1

5'-gaacttctaa tcttcaccgt cca-3' 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> HS10下游引物R

<400> 2

5'-tataaggatc caatgccttc tcg-3' 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> HS12上游引物F

<400> 3

5'-aacttcactt aacgtccagc aac-3' 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> HS12下游引物R

<400> 4

5'-caatatattc gagtgctcta gcca-3' 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> HS20上游引物F

<400> 5

5'-cacgtaacca gctcttctga gtt-3' 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> HS20下游引物R

<400> 6

5'-gaattcaccg gaggattaac aat-3' 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> HS23上游引物F

<400> 7

5'-ttaagagaag cagaagcaga agc-3' 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> HS23上游引物F

<400> 8

5'-gtctcacccc tcgatttcat aat-3' 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> HS48上游引物F

<400> 9

5'-gacattgttg caatcagaac tca-3' 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> HS48下游引物R

<400> 10

5'-aacatctatc aggtttggaa cga-3' 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> HS51上游引物F

<400> 11

5'-aagctgaata tgaactctgc cac-3' 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> HS51下游引物R

<400> 12

5'-agttttgcgt actgaacaca tca-3' 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> HS102上游引物F

<400> 13

5'-gagttgatcc atcagaatca tcc-3' 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> HS102下游引物R

<400> 14

5'-tgagcaatta cagcatcaac atc-3' 23

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> HS115上游引物F

<400> 15

5'-aacagatgca tcctgatcac taac-3' 24

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> HS115下游引物R

<400> 16

5'-cccgttcact gacgaagaat-3' 20

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> HS21上游引物F

<400> 17

5'-tccactacag accgaggaag ata-3' 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> HS21下游引物R

<400> 18

5'-ttaagtacaa ctccaccgca agt-3' 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> HS59上游引物F

<400> 19

5'-agaacagcta tcacagcgag aac-3' 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> HS59下游引物R

<400> 20

5'-tgtctcttca acagcagctt tac-3' 23

Claims

1.用于鉴定霍山石斛的SSR分子标记引物，其特征在于，所述用于鉴定霍山石斛的SSR分子标记引物包括10个引物组合，为：

HS10 F：5’-GAACTTCTAATCTTCACCGTCCA-3’；HS10 R：5’-TATAAGGATCCAATGCCTTCTCG-3’；

2.一种权利要求1所述的用于鉴定霍山石斛的SSR分子标记引物的应用，其特征在于，用于石斛种植资源的鉴定、石斛遗传多样性的研究、石斛遗传图谱的构建、石斛种群的亲缘关系及演化或石斛遗传育种。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用于石斛种植资源的鉴定的方法为：

1)提取待鉴定石斛的基因组DNA；

2)以提取的DNA为模板，利用所述用于鉴定霍山石斛的SSR分子标记引物进行PCR扩增；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤1)中所述提取待鉴定石斛的基因组DNA的方法为：

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR扩增具体为：采用15μL反应体系：7.5μl 2×TSINGKE Master Mix,1.5μl 10μmol/L的上下游引物，2μlDNA模板，ddH₂O补足至15μl；PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性45s，57℃退火35s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸8min。