CN111334603A - 用于检测水稻OsNRAMP5基因的特异InDel分子标记及其应用 - Google Patents

用于检测水稻OsNRAMP5基因的特异InDel分子标记及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111334603A
CN111334603A CN202010239340.5A CN202010239340A CN111334603A CN 111334603 A CN111334603 A CN 111334603A CN 202010239340 A CN202010239340 A CN 202010239340A CN 111334603 A CN111334603 A CN 111334603A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rice
cadmium
molecular marker
fragment
marker
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010239340.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111334603B (zh
Inventor
袁定阳
吕启明
孙志忠
唐丽
黄志远
何强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan University WHU
Hunan Hybrid Rice Research Center
Original Assignee
Hunan Hybrid Rice Research Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hunan Hybrid Rice Research Center filed Critical Hunan Hybrid Rice Research Center
Priority to CN202010239340.5A priority Critical patent/CN111334603B/zh
Publication of CN111334603A publication Critical patent/CN111334603A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111334603B publication Critical patent/CN111334603B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于检测水稻OsNRAMP5基因的特异InDel分子标记及其在检测水稻OsNRAMP5基因镉积累性状中的应用，正向引物F：5’‑CAATCCAAGACCCGGCATGAT‑3’；反向引物R：5’‑GCGCCGCATAGGATTAGTTGA‑3’。该特异InDel分子标记及其检测应用方法可以快速、高效、准确、方便地鉴定水稻中是否存在OsNRAMP5基因缺失，并能判断缺失类型为纯合型还是杂合型。本发明还公开了该特异InDel分子标记在选育镉低积累水稻中的应用，最快可以在两代内选育得到镉低积累水稻材料，简单高效，准确性高，周期短，未采用人工转基因手段，有效缓解了当前水稻受镉污染问题。

Description

用于检测水稻OsNRAMP5基因的特异InDel分子标记及其应用
技术领域
本发明属于作物遗传育种领域，涉及一种用于检测水稻OsNRAMP5基因的特异InDel分子标记及其应用。
背景技术
重金属元素镉对植物和人类都具有高度的毒性，其半衰期长达几十年。土壤和水域中的镉主要通过食物链累积到人体内，在肾脏积累并在人体内不断富集。20世纪初在日本产生的“痛痛病”就是由于人体内镉富集所导致。由于镉半衰期长，即使低水平的长期摄入，也会对人体的呼吸系统和骨骼造成不可逆伤害，因此镉已经被世卫组织划为一级致癌物质。
水稻作为我国最重要的粮食作物之一，其在整个生长期内都会受到非必需元素镉的影响，高浓度的镉污染不仅会影响水稻正常生长发育，而且会严重影响稻米品质，摄入镉含量超标的大米会对人体产生重大危害。2013年5月，广东发现大量产自湖南的含镉毒大米事件，一度引起轰动，该事件对湖南稻米产业造成了巨大影响。实际上，镉大米事件不仅只在湖南，据统计，我国1.35亿公顷的耕地中，有20％左右都受到了不同程度的镉污染。因此，如何降低镉对水稻的影响，培育镉低积累水稻品种是当前急需解决的重大课题。
目前研究已经证实，OsNRAMP5蛋白是水稻根系吸收必需元素锰的主要通道，同时它也具有转运镉和铁的功能，其功能缺失突变体较正常水稻的籽粒镉含量降低了90％以上。目前已经有许多研究通过转基因手段对OsNRAMP5基因进行敲除，获得了产量以及品质不变，而镉含量大幅下降的水稻材料。但是，由于我国对转基因水稻的严格监管，导致这些材料不能在生产上快速利用。因此，发掘与利用OsNRAMP5基因的自然变异水稻材料，是解决当前水稻受镉污染问题的重要手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种用于检测水稻OsNRAMP5基因镉积累性状的特异InDel分子标记及其应用。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种用于检测水稻OsNRAMP5基因的特异InDel分子标记，所述分子标记法所采用的特异InDel分子标记包括以下序列的正向引物F(名称为P5-C8F)和下游引物(名称为P5-C8R)：
正向引物F：5’-CAATCCAAGACCCGGCATGAT-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
反向引物R：5’-GCGCCGCATAGGATTAGTTGA-3’(如SEQ ID NO.2所示)。
基于一个总的发明构思，本发明还提供一种上述特异InDel分子标记在检测水稻OsNRAMP5基因镉积累性状中的应用。
上述的应用，优选的，具体包括如下步骤：
S1、提取待测水稻样品基因组DNA；
S2、利用所述特异InDel分子标记对提取的水稻样品基因组DNA进行PCR扩增；
S3、取所述步骤S2后得到的PCR扩增产物进行电泳检测，读取其片段大小；若PCR扩增产物为一条单一的178bp标记片段，表示该水稻样品基因组存在纯合型OsNRAMP5基因缺失，则鉴定该水稻OsNRAMP5基因表现镉低积累性状；若PCR扩增产物为一条单一的163bp标记片段，表示该水稻样品基因组不存在OsNRAMP5基因缺失，则鉴定该水稻OsNRAMP5基因表现非镉低积累性状；若PCR扩增产物包含一条178bp标记片段和一条163bp标记片段，表示该水稻样品基因组存在杂合型OsNRAMP5基因缺失，则鉴定该水稻OsNRAMP5基因表现非镉低积累性状。
优选的，利用所述特异InDel分子标记对提取的水稻样品基因组DNA进行PCR扩增的具体操作包括如下步骤：将所述特异InDel分子标记稀释为10mM，配置PCR反应体系：20μLPCR反应体系包含50ng/μL基因组DNA2μL，5μM/mL前后引物各1μL，1.1×PCR Mix 16μL；PCR反应条件如下：95℃预变性4min；95℃20s，58℃20s，72℃20s，共35个循环；72℃延伸5min。
优选的，所述178bp标记片段的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，所述163bp标记片段的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。
基于一个总的发明构思，本发明还提供一种上述特异InDel分子标记在选育镉低积累水稻中的应用，包括如下步骤：
(1)选取现有的镉低积累水稻品种作为供体，非镉低积累水稻品种为受体；
(2)将所述步骤(1)后得到的供体和受体材料杂交，获得杂交F1代种子，F1代种子自交获得F2代种子，或者F1代种子和受体材料回交获得BC1F1代种子；
(3)利用分子标记法检测所述步骤(2)后得到的F2代或者BC1F1代群体，在F2代群体中筛选出存在纯合型OsNRAMP5基因缺失的植株，即为镉低积累水稻材料；或在BC1F1群体中，筛选出存在杂合型OsNRAMP5基因缺失的植株再进一步自交，或与受体材料回交后得到的回交后代选择存在杂合型OsNRAMP5基因缺失的植株再自交，得到的回交和自交后代群体均利用所述分子标记法进行检测，直到自交分离出存在纯合型OsNRAMP5基因缺失的植株，即为镉低积累水稻材料。
上述的应用，优选的，所述步骤(1)中，镉低积累水稻品种为珞红3A或珞红4A。现有的其他报道OsNRAMP5基因丧失功能都是通过基因编辑造成的，由于涉及转基因，不能商业化应用。然而珞红3A或珞红4A是自然存在的因OsNRAMP5缺失而表现低镉的水稻材料，具有商业化应用前景。
优选的，所述步骤(1)中，非镉低积累水稻品种包括农艺性状优良的玉针香、湘晚籼13、雅恢2115、蜀恢527、福恢676、9311和R900中的一种或几种。
申请人前期通过对重测序水稻材料中OsNRAMP5基因编码区的变异分析，鉴定出OsNRAMP5基因在水稻品种珞红3A和珞红4A中完全缺失，从而导致两者镉含量极低。在此基础上进一步设计珞红3A和珞红4A中包含OsNRAMP5基因大片段缺失紧密连锁的特异分子标记，通过常规杂交和回交的方法，能够更高效、准确地选育镉低积累水稻新品种。
珞红3A和珞红4A在包含OsNRAMP5基因区存在大片段缺失，该缺失对应参考基因组蜀恢498位置为第7号染色体第8899016-9307728位碱基(序列长度约408kb)，该缺失片段包含了整个OsNRAMP5基因(OsNRAMP5位置为第7号染色体第8934799-8942223位)。在珞红3A和珞红4A大片段缺失附近约6kb位置第8892597位碱基处，找到珞红3A和珞红4A与农艺性状优良的一些非镉低积累水稻品种存在一段15bp的插入/缺失差异TTTCGGATGCTACAA(如图1所示)，基于该片段差异，设计了与包含OsNRAMP5基因在内的大片段缺失紧密连锁的特异InDel分子标记。
优选的，所述步骤(3)中，利用所述特异InDel分子标记检测的具体操作包括如下步骤：提取待测水稻样品基因组DNA，利用所述特异InDel分子标记对提取的水稻样品基因组DNA进行PCR扩增，取得到的PCR扩增产物进行电泳检测，读取其片段大小；若PCR扩增产物为一条单一的178bp标记片段，则鉴定该水稻样品基因组存在纯合型OsNRAMP5基因缺失；若PCR扩增产物为一条单一的163bp标记片段，则鉴定该水稻样品基因组不存在OsNRAMP5基因缺失；若PCR扩增产物包含一条178bp标记片段和一条163bp标记片段，则鉴定该水稻样品基因组存在杂合型OsNRAMP5基因缺失。
优选的，所述178bp标记片段的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，所述163bp标记片段的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的特异InDel分子标记，可以快速、高效、准确、方便地鉴定水稻中是否存在OsNRAMP5基因缺失，并能判断缺失类型为纯合型还是杂合型，为镉低积累水稻材料的鉴定和选育提供了一定依据。
2、本发明的特异InDel分子标记应用方法，在选育镉低积累水稻材料的过程中能够快速、准确、高效的鉴定水稻中是否存在OsNRAMP5基因缺失，并能够直接得出OsNRAMP5基因缺失的类型是纯合型还是杂合型，进而判断水稻镉积累性状是低积累还是高积累，操作简单，大大解放了劳动力，在选育镉低积累水稻材料提升以及种质资源创新上都具有重要意义。
3、本发明的特异InDel分子标记在选育镉低积累水稻中的应用，以现有的镉低积累水稻品种作为供体，非镉低积累水稻品种为受体，经过常规杂交、自交或回交等方法，在后代群体经过特异InDel分子标记筛选出存在纯合型OsNRAMP5基因缺失的镉低积累水稻，最快可以在两代内选育得到镉低积累水稻材料，该方法简单高效，准确性高，周期短，成本较低，未采用人工转基因手段，有效缓解了当前水稻受镉污染问题。
4、本发明选育得到的镉低积累水稻材料是自然变异水稻材料，未采用人工转基因手段，品质安全，产量以及品质不变，镉含量极低，且镉低积累特性遗传稳定，为镉低积累水稻新材料的选育提供了新的思路，具有十分重要的意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1中珞红3A、珞红4A与其他水稻材料15bp的差异对比图；
图2是实施例1中珞红3A、珞红4A和其他水稻品种利用所述特异InDel分子标记PCR扩增的电泳差异图(1-10分别是marker、珞红3A、珞红4A、玉针香、湘晚籼13、雅恢2115、蜀恢527、福恢676、9311、R900)；
图3是实施例2中珞红3A与9311杂交后代自交分离群体利用所述特异InDel分子标记鉴定得到的结果(1-9为分离群体，10为珞红3A，11为9311，12为marker)；
图4是实施例3中珞红4A与玉针香杂交-回交-自交后代分离群体利用所述特异InDel分子标记鉴定得到的结果(1为marker，2为珞红4A，3为玉针香，4-12为分离后代群体)；
图5是实施例4中珞红4A与玉针香杂交-回交-回交-自交后代分离群体利用所述特异InDel分子标记鉴定得到的结果(1为marker，2为珞红4A，3为玉针香，4-13为分离后代群体)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
一种用于检测水稻OsNRAMP5基因镉积累性状的特异InDel分子标记，包括下表1所示的正向引物F(名称为P5-C8F)和反向引物R(名称为P5-C8R)。
表1：用于选育镉低积累水稻的特异InDel分子标记
名称 碱基序列
P5-C8F CAATCCAAGACCCGGCATGAT(如SEQ ID NO.1所示)
P5-C8R GCGCCGCATAGGATTAGTTGA(如SEQ ID NO.2所示)
通过对重测序水稻材料中OsNRAMP5基因编码区的变异分析，我们发现珞红3A和珞红4A在包含OsNRAMP5基因区存在大片段缺失变异，该大片段缺失变异对应参考基因组蜀恢498位置为第7号染色体第8899016-9307728位碱基(序列长度约408kb)，该大片段缺失变异包含了整个OsNRAMP5基因(OsNRAMP5位置为第7号染色体第8934799-8942223位)。
为了进一步鉴定珞红3A和珞红4A的镉含量，将珞红3A和珞红4A以及对照水稻材料日本晴、9311浸种、催芽后，置人工气候室中，用国际水稻所的水稻营养液配方培养14天，再用0.5uM CdCl2处理14天，去离子水冲洗，将地上部分和根系分开，剪碎，称重，用HNO3:HClO4混合酸(体积比为6:1)消煮，1％HNO3定容，ICP-MS测定各个材料茎叶的镉含量，结果如表2所示。
表2：珞红3A和珞红4A茎叶镉含量测定
样品名称 称样质量(g) 检测结果(mg/Kg)
珞红3A 0.3376 12.5
珞红4A 0.4731 8.45
日本晴 0.2418 48
9311 0.3976 54.4
由表2可知，珞红3A和珞红4A中镉含量明显低于日本晴和9311水稻品种，证明本实施例筛选到了镉低积累水稻材料。
在珞红3A和珞红4A的大片段缺失变异附近约6kb位置第8892597位碱基处，找到珞红3A和珞红4A与农艺性状优良的一些非镉低积累水稻品种存在一段15bp的插入/缺失片段差异TTTCGGATGCTACAA(如图1所示)，基于该片段差异，设计了与包含OsNRAMP5基因在内的大片段缺失变异紧密连锁的特异InDel分子标记。
利用该特异InDel分子标记检测水稻OsNRAMP5基因镉积累性状的方法，具体包括如下步骤：
S1、采用CTAB法，对水稻新鲜幼嫩叶片提取DNA样本：取适量新鲜水稻叶片装入2mL离心管中并加入钢珠，于液氮中速冻，放入高通量组织研磨器(宁波新芝Scientz-48)破碎组织，立即加入65℃预热的2×CTAB溶液650μL，置于65℃水浴锅中恒温45min，每10min上下均匀颠倒一次，45min结束并待DNA样品冷却到室温后置于通风橱中加入650μL氯仿﹕异丙醇(24﹕1)的溶液，上下颠倒混匀，12000rmp离心10min，将500μl上清液转移到1.5mL的离心管中，加入500μl异丙醇溶液混匀并于-20℃沉淀2h，12000rmp离心10min，弃上清，加入1mL70％乙醇溶液洗除杂质，12000rmp离心5min后倒出上清，加入200μl ddH2O于4℃冰箱中过夜溶解，得到提取的水稻样品DNA模板；
S2、将合成的引物CCJ-CF、CCJ-CR稀释为10mM；配置PCR反应体系：20μL PCR反应体系包含基因组DNA 2μL(50ng/μL)，前后引物各1μL(5μM/mL)，1.1×PCR Mix(擎科生物技术有限公司)16μL。PCR反应条件如下：95℃预变性4min；95℃20s，58℃20s，72℃20s，共35个循环；72℃延伸5min；
S3、取上述步骤S2后得到的PCR扩增产物进行电泳检测，读取其片段大小；若PCR扩增产物为一条单一的178bp标记片段，则鉴定该水稻样品基因组存在纯合型OsNRAMP5基因缺失；若PCR扩增产物为一条单一的163bp标记片段，则鉴定该水稻样品基因组不存在OsNRAMP5基因缺失；若PCR扩增产物包含一条178bp标记片段和一条163bp标记片段，则鉴定该水稻样品基因组存在杂合型OsNRAMP5基因缺失。
上述178bp标记片段的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，上述163bp标记片段的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。
将珞红3A、珞红4A和其他非镉低积累水稻品种通过上述方法进行鉴定，得到的电泳检测结果如图2所示，其中1-10分别是marker、珞红3A、珞红4A、玉针香、湘晚籼13、雅恢2115、蜀恢527、福恢676、9311、R900。
由图2可知，珞红3A、珞红4A的电泳检测结果仅有一条单一的178bp标记片段，而其他水稻品种的电泳检测结果仅有一条单一的163bp标记片段，说明本发明的特异InDel分子标记及鉴定方法可以快速、高效、准确、方便地鉴定水稻中是否存在OsNRAMP5基因缺失，并能判断缺失类型为纯合型还是杂合型以及水稻OsNRAMP5基因的镉积累性状，为镉低积累水稻材料的鉴定和选育提供了一定依据。
实施例2：
一种实施例1的特异InDel分子标记在选育镉低积累水稻中的应用，包括如下步骤：
(1)以珞红3A作为供体，9311水稻为受体；
(2)将供体和受体材料杂交，获得杂交F1代种子，F1代种子自交获得F2代种子；
(3)在F2代群体中利用特异InDel分子标记进行检测，检测方法与实施例1相同，在F2代群体中筛选出存在纯合型OsNRAMP5基因缺失的植株，即为镉低积累水稻材料。
对于步骤(3)中自交产生的分离后代，采用特异InDel分子标记进行了检测，并对分离个体进行了苗期茎叶镉含量测定，结果如表3和图3所示(编号1-9为分离群体，10为珞红3A，11为9311，12为marker)。
表3：珞红3A与9311杂交后代自交F2分离群体苗期茎叶镉含量测定结果
Figure BDA0002432036490000071
结果发现，步骤(3)中自交产生的分离后代中，编号1、7、9三个单株存在纯合型OsNRAMP5基因缺失，且这三个单株的镉含量相较于其他样品明显降低，其中编号9的镉含量仅有9.6mg/kg，明显低于低镉亲本珞红3A的镉含量，证明本发明将特异InDel分子标记应用于选育镉低积累水稻，能够快速、准确、高效的选育出镉低积累水稻新材料。
实施例3：
一种实施例1的特异InDel分子标记在选育镉低积累水稻中的应用，包括如下步骤：
(1)以珞红4A作为供体，非镉低积累水稻品种玉针香为受体；
(2)将供体和受体材料杂交，获得杂交F1代种子，F1代种子和受体材料回交获得BC1F1代种子；
(3)在BC1F1代群体中利用特异InDel分子标记进行检测，检测方法与实施例1相同，在BC1F1群体中，筛选出存在杂合型OsNRAMP5基因缺失的植株再进一步自交，得到的后代群体利用特异InDel分子标记进行检测，筛选出存在纯合型OsNRAMP5基因缺失的植株，即为镉低积累水稻材料。
对于步骤(3)中自交产生的分离后代，采用特异InDel分子标记进行了检测，并对分离个体进行了苗期茎叶镉含量测定，结果如表4和图4所示(1为marker，2为珞红4A，3为玉针香，4-12为分离后代群体)。
表4：珞红4A与玉针香杂交-回交-自交得到的后代分离群体苗期茎叶镉含量测定结果
Figure BDA0002432036490000081
结果发现，步骤(3)中自交产生的分离后代中，编号5、8、9三个单株存在纯合型OsNRAMP5基因缺失，且这三个单株的镉含量相较于其他样品明显降低，其中编号5的镉含量仅有9.8mg/Kg，证明本发明的选育方法与特异InDel分子标记能够快速、准确、高效的选育出镉低积累水稻新材料。
实施例4：
一种实施例1的特异InDel分子标记在选育镉低积累水稻中的应用，包括如下步骤：
(1)以珞红4A作为供体，非镉低积累水稻品种玉针香为受体；
(2)将供体和受体材料杂交，获得杂交F1代种子，F1代种子和受体材料回交获得BC1F1代种子；
(3)在BC1F1代群体中利用特异InDel分子标记进行检测，检测方法与实施例1相同，在BC1F1群体中，筛选出存在杂合型OsNRAMP5基因缺失的植株再与受体材料回交，在得到的回交后代中选择存在杂合型OsNRAMP5基因缺失的植株进一步自交，回交和自交的后代群体均利用特异InDel分子标记进行检测，最后自交分离出存在纯合型OsNRAMP5基因缺失的植株，即为镉低积累水稻材料。
对于步骤(3)中自交产生的分离后代，采用特异InDel分子标记进行了检测，并对分离个体进行了苗期茎叶镉含量测定，结果如表5和图5所示(1为marker，2为珞红4A，3为玉针香，4-13为分离群体)。
表5：珞红4A与玉针香杂交-回交-回交-自交得到的后代分离群体苗期茎叶镉含量测定结果
Figure BDA0002432036490000091
结果发现，步骤(3)中自交产生的分离后代中，编号5、8、12三个单株存在纯合型OsNRAMP5基因缺失，且这三个单株的镉含量相较于其他样品明显降低，其中编号8的镉含量仅有9.8mg/Kg，证明本发明的选育方法与特异InDel分子标记能够快速、准确、高效的选育出镉低积累水稻新材料。
序列表
<110> 湖南杂交水稻研究中心
<120> 用于检测水稻OsNRAMP5基因的特异InDel分子标记及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caatccaaga cccggcatga t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgccgcata ggattagttg a 21
<210> 3
<211> 178
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 3
caatccaaga cccggcatga tgcaaaataa tgcataaggt ttttttttgg aaggcgaatt 60
ttaattgacg gattttagtt agcgaatttt cggatgctac aattttcgga tgctacaatt 120
gcccctctct ctttccttac ttcttttatc cacctcatca actaatccta tgcggcgc 178
<210> 4
<211> 163
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 4
caatccaaga cccggcatga tgcaaaataa tgcataaggt ttttttttgg aaggcgaatt 60
ttaattgacg gattttagtt agcgaatttt tcggatgcta caattgcccc tctctctttc 120
cttacttctt ttatccacct catcaactaa tcctatgcgg cgc 163

Claims (10)

1.一种用于检测水稻OsNRAMP5基因的特异InDel分子标记，其特征在于，所述特异InDel分子标记包括以下序列的正向引物F和反向引物R：
正向引物F：5’-CAATCCAAGACCCGGCATGAT-3’；
反向引物R：5’-GCGCCGCATAGGATTAGTTGA-3’。
2.一种如权利要求1所述的特异InDel分子标记在检测水稻OsNRAMP5基因镉积累性状中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1、提取待测水稻样品基因组DNA；
S2、利用所述特异InDel分子标记对提取的水稻样品基因组DNA进行PCR扩增；
S3、取所述步骤S2后得到的PCR扩增产物进行电泳检测，读取其片段大小；若PCR扩增产物为一条单一的178bp标记片段，表示该水稻样品基因组存在纯合型OsNRAMP5基因缺失，则鉴定该水稻OsNRAMP5基因表现镉低积累性状；若PCR扩增产物为一条单一的163bp标记片段，表示该水稻样品基因组不存在OsNRAMP5基因缺失，则鉴定该水稻OsNRAMP5基因表现非镉低积累性状；若PCR扩增产物包含一条178bp标记片段和一条163bp标记片段，表示该水稻样品基因组存在杂合型OsNRAMP5基因缺失，则鉴定该水稻OsNRAMP5基因表现非镉低积累性状。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用所述特异InDel分子标记对提取的水稻样品基因组DNA进行PCR扩增的具体操作包括如下步骤：将所述特异InDel分子标记稀释为10mM，配置PCR反应体系：20μLPCR反应体系包含50ng/μL基因组DNA2μL，5μM/mL前后引物各1μL，1.1×PCRMix16μL；PCR反应条件如下：95℃预变性4min；95℃20s，58℃20s，72℃20s，共35个循环；72℃延伸5min。
5.根据权利要求3-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述178bp标记片段的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，所述163bp标记片段的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。
6.一种如权利要求1所述的特异InDel分子标记在选育镉低积累水稻中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)选取现有的镉低积累水稻品种作为供体，非镉低积累水稻品种为受体；
(2)将所述步骤(1)后得到的供体和受体材料杂交，获得杂交F1代种子，F1代种子自交获得F2代种子，或者F1代种子和受体材料回交获得BC1F1代种子；
(3)利用所述的特异InDel分子标记检测所述步骤(2)后得到的F2代或者BC1F1代群体，在F2代群体中筛选出存在纯合型OsNRAMP5基因缺失的植株，即为镉低积累水稻材料；或在BC1F1群体中，筛选出存在杂合型OsNRAMP5基因缺失的植株再进一步自交，或与受体材料回交后得到的回交后代选择存在杂合型OsNRAMP5基因缺失的植株再自交，得到的回交和自交后代群体均利用所述特异InDel分子标记进行检测，直到自交分离出存在纯合型OsNRAMP5基因缺失的植株，即为镉低积累水稻材料。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，镉低积累水稻品种为珞红3A或珞红4A。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，非镉低积累水稻品种包括玉针香、湘晚籼13、雅恢2115、蜀恢527、福恢676、9311和R900中的一种或几种。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，利用所述特异InDel分子标记检测的具体操作包括如下步骤：提取待测水稻样品基因组DNA，利用所述特异InDel分子标记对提取的水稻样品基因组DNA进行PCR扩增，取得到的PCR扩增产物进行电泳检测，读取其片段大小；若PCR扩增产物为一条单一的178bp标记片段，则鉴定该水稻样品基因组存在纯合型OsNRAMP5基因缺失；若PCR扩增产物为一条单一的163bp标记片段，则鉴定该水稻样品基因组不存在OsNRAMP5基因缺失；若PCR扩增产物包含一条178bp标记片段和一条163bp标记片段，则鉴定该水稻样品基因组存在杂合型OsNRAMP5基因缺失。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述178bp标记片段的碱基序列如SEQ IDNO.3所示，所述163bp标记片段的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。
CN202010239340.5A 2020-03-30 2020-03-30 用于检测水稻OsNRAMP5基因的特异InDel分子标记引物及其应用 Active CN111334603B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010239340.5A CN111334603B (zh) 2020-03-30 2020-03-30 用于检测水稻OsNRAMP5基因的特异InDel分子标记引物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010239340.5A CN111334603B (zh) 2020-03-30 2020-03-30 用于检测水稻OsNRAMP5基因的特异InDel分子标记引物及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111334603A true CN111334603A (zh) 2020-06-26
CN111334603B CN111334603B (zh) 2021-07-23

Family

ID=71182672

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010239340.5A Active CN111334603B (zh) 2020-03-30 2020-03-30 用于检测水稻OsNRAMP5基因的特异InDel分子标记引物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111334603B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112011639A (zh) * 2020-09-04 2020-12-01 湖南杂交水稻研究中心 水稻镉积累分子标记及其在改良水稻籽粒镉积累上的应用
CN112176086A (zh) * 2020-09-30 2021-01-05 浙江师范大学 调控水稻镉积累量主效QTL位点qRCd-5的分子标记及其应用
CN112626258A (zh) * 2020-12-30 2021-04-09 袁隆平农业高科技股份有限公司 一种与水稻镉低吸收基因OsNramp5相关的SNP位点及其应用
CN113684302A (zh) * 2021-09-09 2021-11-23 中国检验检疫科学研究院 低镉水稻的特异性pcr检测引物、检测方法和试剂盒
CN113897451A (zh) * 2021-10-18 2022-01-07 湖南杂交水稻研究中心 一种水稻镉低积累分子标记、突变型基因、检测试剂盒及其快速鉴定方法和应用、分型引物
CN114908186A (zh) * 2022-05-18 2022-08-16 西南科技大学 一种水稻氮高效利用基因OsTCP19的分子标记及其鉴定方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110804676A (zh) * 2019-12-03 2020-02-18 湖南杂交水稻研究中心 水稻OsNramp5-18突变型基因及其鉴定方法、鉴定用KASP分型引物及应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110804676A (zh) * 2019-12-03 2020-02-18 湖南杂交水稻研究中心 水稻OsNramp5-18突变型基因及其鉴定方法、鉴定用KASP分型引物及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SATORU ISHIKAWA: "Mechanisms of cadmium accumulation in rice grains and molecular breeding for its reduction", 《SOIL SCIENCE AND PLANT NUTRITION》 *
唐伟等: "水稻镉积累的生理学和分子生物学机理研究进展", 《安徽农业科学》 *
陈彩艳等: "筛选和培育镉低积累水稻品种的进展和问题探讨", 《农业现代化研究》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112011639A (zh) * 2020-09-04 2020-12-01 湖南杂交水稻研究中心 水稻镉积累分子标记及其在改良水稻籽粒镉积累上的应用
CN112011639B (zh) * 2020-09-04 2021-12-28 湖南杂交水稻研究中心 水稻镉积累分子标记及其在改良水稻籽粒镉积累上的应用
WO2022048070A1 (zh) * 2020-09-04 2022-03-10 湖南杂交水稻研究中心 水稻镉积累分子标记及其在改良水稻籽粒镉积累上的应用
CN112176086A (zh) * 2020-09-30 2021-01-05 浙江师范大学 调控水稻镉积累量主效QTL位点qRCd-5的分子标记及其应用
CN112626258A (zh) * 2020-12-30 2021-04-09 袁隆平农业高科技股份有限公司 一种与水稻镉低吸收基因OsNramp5相关的SNP位点及其应用
CN113684302A (zh) * 2021-09-09 2021-11-23 中国检验检疫科学研究院 低镉水稻的特异性pcr检测引物、检测方法和试剂盒
CN113897451A (zh) * 2021-10-18 2022-01-07 湖南杂交水稻研究中心 一种水稻镉低积累分子标记、突变型基因、检测试剂盒及其快速鉴定方法和应用、分型引物
CN113897451B (zh) * 2021-10-18 2024-03-12 湖南杂交水稻研究中心 一种水稻镉低积累分子标记、突变型基因、检测试剂盒及其快速鉴定方法和应用、分型引物
CN114908186A (zh) * 2022-05-18 2022-08-16 西南科技大学 一种水稻氮高效利用基因OsTCP19的分子标记及其鉴定方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111334603B (zh) 2021-07-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111334603B (zh) 用于检测水稻OsNRAMP5基因的特异InDel分子标记引物及其应用
CN111466291B (zh) 一种镉低积累水稻的选育方法
CN111763755B (zh) 水稻镉吸收相关基因OsNRAMP5的SNP分子标记及其应用
CN109055395B (zh) 一种光周期钝感Hd1等位基因及其分子标记和应用
CN112795692B (zh) 与玉米株高连锁的分子标记及其应用
CN110512025A (zh) 一种与小麦抗白粉病基因PmJM23紧密连锁的分子标记及其应用
CN102703438A (zh) 一种甘蓝型油菜粒重性状的分子标记及制备方法与应用
CN108476970B (zh) 分子标记辅助快速缩小玉米叶夹角改良京农科728株型的方法
CN108220467B (zh) 分子标记及其应用
CN110468229B (zh) 水稻广谱高抗白叶枯病基因Xa45(t)的共分离分子标记Hxjy-1
CN116769955A (zh) 一种快速转育转基因玉米自交系的方法及应用
CN110358861A (zh) 与水稻广谱高抗白叶枯病基因Xa45(t)紧密连锁分子标记R13I14
CN111073996A (zh) 与玉米抗粗缩病主效QtL紧密连锁的分子标记及其应用
CN111341384A (zh) 一组大豆数量性状qtl位点及其筛选方法
CN114752702B (zh) 一种与油菜钙含量性状QTL紧密连锁的分子标记BnCa-2C2及其应用
CN103233069B (zh) 滇型杂交粳稻滇杂31种子纯度的分子鉴定方法及其专用引物
CN112029886B (zh) 一种水稻低直链淀粉含量调控基因的单引物分子鉴定方法
CN111394502B (zh) 鉴定大豆RN型CMS恢复基因的InDel标记及方法
CN110358862B (zh) 与水稻广谱高抗白叶枯病基因Xa45(t)紧密连锁的分子标记Hxjy-14
CN110257553B (zh) 一种鉴定水稻稻瘟病抗性基因Pigm的KASP分子标记方法
CN112575101B (zh) 与西葫芦prsv-w病毒病抗性相关的分子标记及其应用
CN108165649B (zh) 水稻抗褐飞虱主效基因qBph4(t)的分子标记及其应用
CN112011637A (zh) 一种与小麦抗白粉病基因Pm68紧密连锁的分子标记及其应用
CN106636425B (zh) 水稻紫叶基因pl1的分子标记及其鉴定方法和应用
CN116904638B (zh) 与藜麦早雌性状连锁的kasp标记及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Yuan Dingyang

Inventor after: Lv Qiming

Inventor after: Zhu Renshan

Inventor after: Wu Xianting

Inventor after: Sun Zhizhong

Inventor after: Tang Li

Inventor after: Huang Zhiyuan

Inventor after: He Qiang

Inventor before: Yuan Dingyang

Inventor before: Lv Qiming

Inventor before: Sun Zhizhong

Inventor before: Tang Li

Inventor before: Huang Zhiyuan

Inventor before: He Qiang

TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20210308

Address after: 410000 Ma Poling, Furong District, Changsha City, Hunan Province

Applicant after: HUNAN HYBRID RICE RESEARCH CENTER

Applicant after: WUHAN University

Address before: 410000 Ma Poling, Furong District, Changsha City, Hunan Province

Applicant before: HUNAN HYBRID RICE RESEARCH CENTER

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant