CN103233069B - 滇型杂交粳稻滇杂31种子纯度的分子鉴定方法及其专用引物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了滇型杂交粳稻滇杂31种子纯度的分子鉴定方法及其专用引物，该方法包括扩增模板DNA为叶片，用序列表所示的四对引物对待鉴定水稻的叶片进行PCR扩增，依据电泳结果，即可鉴定出滇型杂交粳稻滇杂31种子中杂株数量，准确率为99%以上；还可对混杂株的真实性（基因型）进行了鉴定，确定杂株的混杂类型，能有效指导在生产过程中减少母本保持系、母本育性回复株、籼稻以及籼粳杂交种混杂发生，为制备高纯度的杂交种子提供理论支持。其中一对引物还可以用于水稻材料的籼粳分化鉴定。本发明方法简单易行，不受季节的限制，避免了田间形态鉴定的繁琐程序，鉴定成本低。
Description
技术领域本发明涉及水稻种子纯度的分子鉴定方法，属于农业生物技术领域，更具体地说属于分子辅助育种领域。
背景技术
种子是农业生产中最基本和最关键的生产资料，其纯度的高低是衡量种子质量优劣的重要指标，我国对不同作物种子纯度进行了严格的规定。我国是世界上最大的杂交水稻种子生产国和消费国，杂交水稻种植面积已占全国水稻种植总面积的60%以上，具有庞大的杂交水稻种子市场。杂交水稻种子的纯度，直接关系到杂种优势的发挥，纯度的下降将导致作物产量的明显降低，保证种子纯度，是确保杂交水稻增产的重要措施，也是杂交水稻种业的命脉。
种子纯度降低的主要原因：一是由于制种过程的种子生产、收获、脱粒、加工、运输等程序中的非人为因素造成的生物混杂和机械混杂，二是一些繁种单位或个人为了片面追求经济效益而忽视种子纯度，甚至掺杂使假，人为因素导致种子纯度降低。机械混杂指在良种繁育过程中的各环节中发生其它品种混杂。如：种、收、运、脱、晒、藏的过程中，造成繁育的品种内混有不同品种的种子；以及轮作的不合理和田间管理的不当，前作和杂草种子的自然脱落，以及使用了未经腐熟的厩肥和堆肥有可能混有作物种子和杂草种子等都会造成机械混杂。生物学混杂是指在良种繁育过程中，由于不同品种隔离不当，而使其发生了天然杂交造成品种纯度、典型性状以及产量和品质等降低，或是品种本身遗传性发生变化和自然突变等导致品种的混杂。因此在水稻杂交种子销售使用前，需对其纯度和真实性进行鉴定。
种子鉴定技术经历了由浅到深、由宏观到微观、由单一到多种技术相结合的过程。种子纯度鉴定的主要方法有常规鉴定法、电泳鉴定法、分子生物学技术鉴定法。伴随着现代农业技术的不断发展，鉴定杂交水稻种子纯度的方法由传统的形态标记逐步发展到集形态标记、生化标记和DNA(Deoxyribonucleic Acid)分子标记鉴定为一体的综合鉴定技术体系。DNA分子标记鉴定法与其它方法相比较，具有不受环境影响、多态性高、数量丰富、结果准确可靠等优点，主要应用的标记有RFLP(Restricted Fragment Length Polymorphisms)、RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)、SSR(Single Sequence Repeat)和AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)等，其中以SSR标记在水稻杂交种子鉴定中具有较强的利用优势，它操作简便、多态性高、重复性好、呈共显性遗传。利用SSR分子标记对水稻，玉米等杂交品种种子纯度鉴定的研究已有不少报道。栽培稻全基因组DNA序列测定的完成以及比较基因组学的深入研究，为水稻的理论研究和遗传育种提供了大量的生物信息。栽培稻全基因组DNA序列测定的完成以及比较基因组学的深入研究，为水稻的理论研究和遗传育种提供了大量的生物信息。Shen等(2004)利用粳稻Nipponbare和籼稻9311基因组序列构建了水稻基因组水平的DNA多态性数据库，其中包括了1 703 176个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)和479 406个插入/缺失多态性(insert/deletion,InDel)。Nipponbare 和9311序列间插入/缺失片段在25-75bp之间，易进行分子检测。冯芳君等比较了水稻InDel和SSR标记多态性，认为InDel标记具有数量多、稳定性强及易于检测的优点。卢宝荣等利用籼稻和粳稻特异InDel位点进行籼粳分化验证，确定了与籼粳遗传分化密切相关的34个InDel位点，构建了“InDel分子指数法”进行籼粳性鉴定。在玉米、黄瓜上也有利用InDel标记准确鉴定杂交种子纯度的报道。国家对杂交水稻DNA分子标记鉴定技术研究十分重视。2007年全国农技中心颁布GB/T20396-2006《三系杂交水稻及亲本真实性和品种纯度鉴定DNA分析方法》，同期颁布了NY/T1433-2007《水稻品种鉴定DNA指纹方法》，为杂交水稻种子纯度的分子检测提供了依据。
滇型杂交粳稻滇杂31(榆密15A×南34)是云南农业大学稻作研究所用育性稳定的滇Ⅰ型不育系榆密15A和优质抗病的恢复系南34配组育成的一个中熟三系杂交粳稻组合。该组合杂种优势强、丰产性好、高抗稻瘟病、米质优、食味好、适应性广，于2002年7月通过云南省农作物品种审定，目前在云南、四川、贵州、湖南、广西等省区广泛种植，获得了显著的经济和生态效益。
滇型杂交粳稻滇杂31种子不纯主要是由机械混杂和生物学混杂引起的，混杂的类型主要有不育系、保持系、异品种、不育系育性回复的可育株等。国内外对杂交籼稻种子利用分子标记技术进行纯度鉴定的研究较多，但在杂交粳稻种子纯度鉴定的报道甚少，主要采用的是我们目前普遍使用的田间种植鉴定方法(将当年生产的杂交种子送往中国海南省，从幼苗至成熟期间根据植株形态特征和生育特性的差异，鉴别杂株的方法。鉴定的主要性状有：株高、株型、茎粗和茎色、叶形和叶色、叶耳颜色和茸毛、穗形和穗色、芒的有无、芒的长短和颜色、粒形和粒色、抗病性和生长特性等)，该方 法需要等到成熟期才能看到结果，所需时间周期长、工作量大，易受环境因素影响，成本高。目前还没有一种分子纯度鉴定技术能准确、快速、经济的鉴定滇型杂交粳稻滇杂31种子纯度。
发明内容
本发明目的是提供一种能准确、快速、高效地对滇型杂交粳稻滇杂31种子纯度及杂株混杂类型进行分子鉴定的方法及其专用引物。
本发明的技术方案是：
1.滇型杂交粳稻滇杂31种子纯度的分子鉴定方法，包括以下步骤：
(1)以滇型杂交粳稻滇杂31杂交种子为对照材料，取对照材料和200粒以上的待鉴定水稻种子于20℃～35℃条件下发芽；
(2)发芽后水培7～10天，分别取所述的对照材料的叶片为对照样品和待鉴定水稻的叶片为待鉴定样品，每个样品分成4等份，4等份分别加入试剂1、试剂2、试剂3、试剂4后，按常规PCR反应程序进行PCR扩增；所述的试剂1、试剂2、试剂3和试剂4均是在相同的常规PCR反应体系分别加入不同的引物，试剂1为常规PCR反应体系加入DZ31-1引物，试剂2为常规PCR反应体系加入DZ31-2引物，试剂3为常规PCR反应体系加入DZ31-3引物，试剂4为常规PCR反应体系加入DZ31-4引物；
常规PCR反应体系是采用15μl反应体系，其中：ddH2O 10.86μl，扩增模板DNA为打取的样品叶片，10×PCR buffer 1.50μl，25mM MgCl2 1.14μl，2.5mM dNTP mixture 1.20μl，50μM上游引物0.10μl，50μM下游引物0.10μl，5U·μL-1Taq 0.10μl；
所述的常规PCR反应程序是预变性1：98℃2min，预变性2：96℃2min；变性94℃20s、退火56℃20s、延伸72℃30s，35个循环；延伸72℃7min；10℃保存。
(3)对PCR扩增产物用含EtBr 0.1μg/ml的2%琼脂糖凝胶电泳分离；
(4)在紫外透射仪上检测PCR扩增产物及电泳结果，依据电泳结果，按如下①至④步的鉴别即鉴定出滇型杂交粳稻滇杂31种子中杂株数量：
①用DZ31-1引物扩增后（图1A），滇型杂交粳稻滇杂31的杂交种分子量为442bp和521bp，基因型为杂合型（双带），其它类型分子量的为杂株；
②用DZ31-2引物扩增后（图1B和图2），滇型杂交粳稻滇杂31杂交种分子量为346bp，其它类型分子量的为杂株；
③用DZ31-3引物扩增后（图1C），滇型杂交粳稻滇杂31杂交种分子量为428bp， 其它类型分子量的为杂株；
④用DZ31-4引物扩增后（图1D），滇型杂交粳稻滇杂31杂交种分子量为350bp，其它类型分子量的为杂株；
所述的DZ31-1引物由上游引物DA31-1-F和下游引物DA31-1-R组成，上游引物DA31-1-F的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，下游引物DA31-1-R的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；所述的DZ31-2引物由上游引物DZ31-2-F和下游引物DZ31-2-R组成，上游引物DZ31-2-F的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，下游引物DZ31-2-R的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：4所示；所述的DZ31-3引物由上游引物DZ31-3-F和下游引物DZ31-3-R组成，上游引物DZ31-3-F的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，下游引物DZ31-3-R的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：6所示；所述的DZ31-4引物由上游引物DZ31-4-F和下游引物DZ31-4-R组成，上游引物DZ31-4-F的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，下游引物DZ31-4-R的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：8所示。
2.一种滇型杂交粳稻滇杂31种子中杂株的混杂类型的分子鉴定方法：
按照滇型杂交粳稻滇杂31种子纯度的分子鉴定方法中所述的方法进行，并在步骤(1)增加4个对照材料于20℃～35℃发芽，水培7～10天，所述的4个对照分别为母本保持系榆密15B种子、父本恢复系南34种子、母本育性回复株榆密15A可育株种子、籼稻种子；以及在步骤(4)按如下①至④步的鉴别及相互对比即鉴定出滇型杂交粳稻滇杂31种子中杂株的混杂类型：
①DZ31-1引物用于鉴定保持系混杂（图1A），扩增后滇型杂交粳稻滇杂31杂交种分子量为442bp和521bp，基因型为杂合型（双带），PCR产物分子量为442bp是母本保持系榆密15B混杂，PCR产物分子量为521bp是父本恢复系南34、或母本育性回复株榆密15A可育株、或籼稻混杂，；
②DZ31-2引物用于鉴定除父母本以外的其它粳稻混杂（图1B和图2），扩增后滇型杂交粳稻滇杂31杂交种分子量为346bp，PCR产物分子量为425bp是其它粳稻材料混杂；
③DZ31-3引物用于鉴定籼稻或是籼粳杂交种子混杂（图1C），扩增后滇型杂交粳稻滇杂31杂交种分子量为428bp，PCR产物分子量为384bp为籼稻混杂，384bp和428bp均有的是籼粳杂交种混杂；
④DZ31-4引物用于在DZ31-1的基础上鉴定杂株中的母本育性回复的可育株和恢复系混杂（图1D），扩增后350bp是父本恢复系南34混杂，PCR产物分子量为780bp是母本育性回复株榆密15A可育株混杂。
本发明的有益效果：
本发明提供的一组专用引物：DZ31-1引物，DZ31-2引物，DZ31-3引物和DZ31-4引物，鉴定滇型杂交粳稻滇杂31种子纯度的准确性高，准确率为99%以上，而且鉴定一个杂交种群体用时不超过15天，鉴定材料只需发芽，PCR反应及电泳即可，达到了准确、快速、高效。
本发明方法简单易行，鉴定不受季节的限制，避免了田间形态鉴定的繁琐程序，鉴别方法经济，鉴定一粒种子是否为真杂种需人民币约1.0～2.0元，鉴定成本低。
本发明除了鉴定杂交种子纯度外，还对混杂株的真实性进行了鉴定，确定杂株的混杂类型，能有效指导在生产过程中减少母本保持系、母本育性回复株、籼稻以及籼粳杂交种混杂发生，为制备高纯度的杂交种子提供理论支持。
附图说明
图1是随机抽取的人为混杂样品种子纯度的琼脂糖凝胶电泳图。图1中图A、图B、图C、图D中：M:Marker；泳道1-5为对照材料；泳道1：母本保持系榆密15B；泳道2：父本恢复系南34；泳道3：母本育性回复株榆密15A可育株；泳道4：籼稻9311；泳道5：滇型杂交粳稻滇杂31杂交种子；泳道6-14是随机抽取的在滇型杂交粳稻滇杂31种子中人为混杂了母本保持系榆密15B种子、父本恢复系南34种子、母本育性回复株榆密15A可育株种子和籼粳杂交种种子的人为混杂样品种子单株。图A是用DZ31-1作引物，琼脂糖凝胶电泳所得到的电泳图谱；图B是用DZ31-2作引物，琼脂糖凝胶电泳所得到的电泳图谱；图C是用DZ31-3作引物，琼脂糖凝胶电泳所得到的电泳图谱；图D是用DZ31-4作引物，琼脂糖凝胶电泳所得到的电泳图谱。
图2是用DZ31-2作引物，区分滇型杂交粳稻滇杂31亲本材料与其它粳稻材料的琼脂糖凝胶电泳图。M:Marker；泳道1：粳稻材料黎榆B；泳道2：滇型杂交粳稻滇杂31母本榆密15B，泳道3：粳稻材料合系42B；泳道4：滇型杂交粳稻滇杂31的父本南34；泳道5：粳稻材料C418；泳道6：粳稻材料安山稻。滇型杂交粳稻滇杂31母本和父本经DZ31-2作引物PCR扩增后分子量为346bp，其它粳稻材料黎榆B、合系42B、C418和安山稻PCR产物分子量为425bp，利用父母本材料与其它粳稻材料经PCR扩 增后分子量的差异，因此用DZ31-2作引物可以用于滇型杂交粳稻滇杂31混杂类型中其它粳稻混杂鉴定。
具体实施方式
以下实施例采用人为混杂样品用以证明本发明方法及其专用引物对滇型杂交粳稻滇杂31杂交种子纯度鉴定的准确性。用大田制种的滇型杂交粳稻滇杂31杂交种子为样品，分别采用常规的田间形态鉴定方法和本发明方法鉴定种子纯度，比较两种方法鉴定结果，进一步考察本发明方法的快速、经济和准确性。
实施例1人为混杂样品种子纯度试验
(1)人为混杂种子的发芽：母本保持系榆密15B(Yumi15B)种子5粒，父本恢复系南34(N34)种子5粒，母本育性回复株榆密15A可育株种子(Yumi15A-Rf)5粒，籼粳杂交种种子5粒，以上材料人为混入套袋杂交制种的滇型杂交粳稻滇杂31种子80粒中，共计100粒种子作为待鉴定水稻材料即人为混杂样品，人为混杂样品中各种材料于20-35℃发芽。
(2)5个对照材料的发芽：分别取母本保持系榆密15B(Yumi15B)种子5粒为对照1，父本恢复系南34(N34)种子5粒为对照2，母本育性回复株榆密15A可育株种子(Yumi15A-Rf)5粒为对照3，籼稻9311种子5粒为对照4，套袋杂交制种的滇型杂交粳稻滇杂31种子5粒为对照5，各种对照材料于20-35℃发芽。
(3)发芽后水培7～10天采用一种叶片PCR快速取样装置(所述的一种叶片PCR快速取样装置的专利号为ZL200920111961.4，公开日：2010.06.23，公开号：CN201512535U)分别对步骤(2)所述的5个对照各1株和步骤(1)所述的人为混杂样品100株的叶片打取大小一致的新鲜叶片(也可用其它常规取叶片的方法取大小一致的新鲜叶片)，5种对照的叶片为5个对照样品，人为混杂样品的叶片为待鉴定样品，每个样品分成4等份样品，每个样品的4份样品分别放入冰上放置的空的PCR离心管底部，每个样品的4份样品分别加入试剂1、试剂2、试剂3、试剂4后，进行PCR扩增；所述的试剂1、试剂2、试剂3和试剂4均是在相同的PCR反应体系中分别加入不同的引物。试剂1：在PCR反应体系加入DZ31-1引物，试剂2：在PCR反应体系加入DZ31-2引物，试剂：在PCR反应体系加入DZ31-3引物，试剂4：在PCR反应体系加入DZ31-4引物。
PCR反应体系：
总体积为15.0μl，其中：ddH2O 10.86μl，扩增模板DNA为打取的样品叶片，10×PCR buffer 1.50μl，25mM MgCl2 1.14μl，2.5mM dNTP mixture 1.20μl，50μM上游引物0.10μl，50μM下游引物0.10μl，5U·μL-1Taq 0.10μl。
PCR反应程序是：
预变性1：98℃2min；
预变性2：96℃2min；
变性94℃20s、退火56℃20s、延伸72℃30s，35个循环；
延伸72℃7min；
保存10℃。
注：扩增模板DNA为叶片因此增加一个高温98℃的预变性步骤。
(3)对PCR扩增产物用含EtBr 0.1μg/ml的2%琼脂糖凝胶电泳分离：
扩增产物加入3μl上样缓冲液(6X loading buffer)混合均匀后用含EtBr0.1μg/ml的2%的琼脂糖凝胶电泳分离。
(4)在紫外透射仪上检测PCR扩增产物及电泳结果，依据电泳结果，按如下①至④步的鉴别及相互对比即鉴定出滇型杂交粳稻滇杂31种子的种子纯度及其杂株的混杂类型(详见图1)：
①DZ31-1引物用于鉴定保持系混杂，扩增后滇型杂交粳稻滇杂31杂交种分子量为442bp和521bp，基因型为杂合型（双带），PCR产物分子量为442bp是母本保持系榆密15B(Yumi15B)混杂,PCR产物分子量为521bp父本恢复系南34（N34）、或母本育性回复株榆密15A可育株种子(Yumi15A-Rf)或籼稻混杂；
②DZ31-2引物用于鉴定除父母本以外的其它粳稻混杂，扩增后滇型杂交粳稻滇杂31杂交种分子量为346bp，PCR产物分子量为425bp是其它粳稻材料混杂；
③DZ31-3引物用于鉴定籼稻或是籼粳杂交种子混杂，扩增后滇型杂交粳稻滇杂31杂交种分子量为428bp，PCR产物分子量为384bp为籼稻混杂，384bp和428bp均有的是籼粳杂交种混杂；
④DZ31-4引物用于在DZ31-1的基础上鉴定杂株中的母本育性回复的可育株和恢复系混杂，扩增后PCR产物分子量为350bp是父本恢复系南34混杂，780bp是母本育性回复株榆密15A可育株混杂；
图1的详细分析：
图1中图A是用DZ31-1作引物，琼脂糖凝胶电泳所得到的电泳图谱。其中M:Marker；泳道1-5为对照材料；泳道1：母本保持系榆密15B；泳道2：父本恢复系南34；泳道3：母本育性回复株榆密15A可育株；泳道4：籼稻9311；泳道5：滇型杂交粳稻滇杂31杂交种子；泳道6-14是随机抽取的步骤(1)所述的人为混杂样品种子单株。图A表明：DZ31-1引物用于鉴定保持系，扩增后，滇型杂交粳稻滇杂31的杂交种分子量为442bp和521bp(泳道5)，PCR产物分子量为442bp是母本保持系榆密15B混杂，PCR产物分子量为521bp可能是父本N34、或母本育性回复株榆密15A可育株或籼稻9311混杂；其中，泳道6、9、11、12、13、14的分子量与泳道5的分子量一致，初步可定为滇型杂交粳稻滇杂31的杂交种，而泳道7、8和10为混杂株，泳道7的分子量与泳道1一致，确定泳道7为母本保持系榆密15B混杂。
图1中图B是用DZ31-2作引物，琼脂糖凝胶电泳所得到的电泳图谱。其中M:Marker；泳道1-5为对照材料；泳道1：母本保持系榆密15B；泳道2：父本恢复系南34；泳道3：母本育性回复株榆密15A可育株；泳道4：籼稻9311；泳道5：滇型杂交粳稻滇杂31杂交种子；泳道6-14是随机抽取的步骤(1)所述的人为混杂样品种子单株。图B表明：DZ31-2引物用于鉴定除母本保持系榆密15B和父本恢复系南34以外的其它粳稻混杂，扩增后滇杂31的杂交种分子量为346bp(泳道5)；PCR产物分子量为425bp是其它粳稻材料混杂(图2)；泳道6-14与泳道5的分子量一致，表明无其它粳稻混杂。
图1中图C是用DZ31-3作引物，琼脂糖凝胶电泳所得到的电泳图谱。其中M:Marker；泳道1-5为对照材料；泳道1：母本保持系榆密15B；泳道2：父本恢复系南34；泳道3：母本育性回复株榆密15A可育株；泳道4：籼稻9311；泳道5：滇型杂交粳稻滇杂31杂交种子；泳道6-14是随机抽取的步骤(1)所述的人为混杂样品种子单株。图C表明：DZ31-3引物用于鉴定籼稻和籼粳杂种混杂，扩增后滇杂31的杂交种分子量为428bp(泳道5)；PCR产物分子量为384bp为籼稻混杂，PCR产物分子量为384bp和428bp均有是籼粳杂交种子混杂；其中，泳道6-13与泳道5的分子量一致，泳道14分子量出现384bp和428bp，结果表明泳道14为籼粳杂种混杂。
图1中图D是用DZ31-4作引物，琼脂糖凝胶电泳所得到的电泳图谱。其中M:Marker；泳道1-5为对照材料；泳道1：母本保持系榆密15B；泳道2：父本恢复系南34；泳道3：母本育性回复株榆密15A可育株；泳道4：籼稻9311；泳道5：滇型杂交粳稻滇杂31杂交种子；泳道6-14是随机抽取的步骤(1)所述的人为混杂样品种子单株。 图D表明：DZ31-4引物用于在DZ31-1的基础上鉴定杂株中的母本育性回复的可育株和恢复系混杂，扩增后PCR产物分子量为780bp是母本保持系榆密15B或母本育性回复株榆密15A可育株混杂，PCR产物分子量为350bp是父本恢复系南34混杂，其中，泳道6、9、11、12、13、14与泳道5分子量一致，泳道14在此前的DZ31-3作引物时鉴定出为籼粳杂种混杂，所以泳道6、9、11、12和13确定为滇型杂交粳稻滇杂31的杂交种；泳道7、8为混杂株与泳道3相同，泳道7在此和DZ31-1作引物时鉴定出为母本保持系榆密15B，因此泳道8确定为母本育性回复株榆密15A可育株混杂，泳道10与泳道2相同，泳道10确定为父本恢复系南34混杂。
综合4个引物的鉴定结果：泳道6-14中6、9、11、12和13泳道为滇杂31杂交种；其7泳道为母本保持系榆密15B混杂；其8泳道为母本育性回复株榆密15A可育株混杂；其10泳道为父本恢复系南34混杂；其14泳道为籼粳杂交种混杂。
本实施例用本发明方法共鉴定100粒滇杂31杂交种子人为混合样品，其种子纯度鉴定为80%。鉴定混杂母本保持系5%，父本恢复系5%，母本育性回复株5%，籼粳杂交5%，与人为混入结果100%一致(结果见表1)。
所述的DZ31-1引物由上游引物DA31-1-F和下游引物DA31-1-R组成，上游引物DA31-1-F的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，下游引物DA31-1-R的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；所述的DZ31-2引物由上游引物DZ31-2-F和下游引物DZ31-2-R组成，上游引物DZ31-2-F的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，下游引物DZ31-2-R的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：4所示；所述的DZ31-3引物由上游引物DZ31-3-F和下游引物DZ31-3-R组成，上游引物DZ31-3-F的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，下游引物DZ31-3-R的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：6所示；所述的DZ31-4引物由上游引物DZ31-4-F和下游引物DZ31-4-R组成，上游引物DZ31-4-F的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，下游引物DZ31-4-R的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：8所示。
表1实施例1滇型杂交粳稻滇杂31杂交种子人为混杂样品鉴定结果比较
实施例2以大田制种的滇型杂交粳稻滇杂31杂交种子为材料，采用本发明方法和常规的田间形态鉴定
实施例2除以下操作不同外，其余操作步骤、分析鉴别与实施例1相同，不再赘述。
待鉴定样品1：来自云南省景谷县永平田心组滇杂31(样品1)
待鉴定样品2：来自云南省景谷县永平镇迁美滇杂31(样品2)
大田制种的滇型杂交粳稻滇杂31杂交种子为样品，分别用田间种植形态鉴定和本发明方法鉴定种子纯度，比较两种方法鉴别结果，考察本发明方法的可靠性。
本发明方法鉴定时，分别取待鉴定样品1种子204粒、待鉴定样品2种子200粒，对照1：母本保持系榆密15B；对照2：父本恢复系南34、对照3：母本育性回复株榆密15A可育株，对照4：籼稻9311，对照5：滇型杂交粳稻滇杂31杂交种子；各对照材料10粒，于20-35℃发芽后水培。
试验结果见表2，用本发明方法共鉴定待鉴定样品1种子204粒，主要有保持系、恢复系、不育系育性回复株、其它粳稻材料及籼粳杂交种混杂，其种子纯度鉴定为92.65%。与田间形态鉴定结果92.80%的一致性为99.84%。
鉴定待鉴定样品2种子共200粒，主要有保持系、恢复系和其它粳稻材料混杂，其种子纯度鉴定为94.00%。与田间形态鉴定结果94.40%的一致性为99.57%。
田间形态鉴定中，保持系和不育系回复的可育株在形态上非常相似，无法区分，均归类为保持系混杂，样品中的其它粳稻混杂可能是在收获、晾晒过程中的其它粳稻种子混入。两种鉴定方法相比，本发明方法鉴定不仅能准确鉴定出混杂比例，还能鉴定杂交种的真实性。
表2实施例2两种鉴定方法对大田制种滇型杂交粳稻滇杂31杂交种子样品
种子纯度鉴定比较
表3实施例2不同鉴定方法所需要的成本比较
由表2～表3可看出，用本发明所述的DZ31-1、DZ31-2、DZ31-3和DZ31-4四对引物鉴定滇型杂交粳稻滇杂31的种子纯度，准确率为99％以上，且本发明方法鉴定比常规田间形态鉴定的成本低(表3)，本发明方法在进行纯度鉴定的同时可进行杂交种真实性鉴定，还极大的提高种子纯度鉴定速率。
在滇型杂交粳稻滇杂31种子纯度及杂株混杂类型进行分子鉴定专用引物中DZ31-3能有效的从分子量上区分籼稻和粳稻材料，DZ31-3作引物扩增后粳稻PCR产物分子量为428bp，籼稻PCR产物分子量为384bp。因此DZ31-3引物除了用于鉴定滇型杂交粳稻滇杂31种子纯度或鉴定滇型杂交粳稻滇杂31种子中杂株的籼稻或是籼粳杂种混杂外，还可以用于水稻材料的籼粳分化鉴定。
Claims (6)
1.滇型杂交粳稻滇杂31种子纯度的分子鉴定方法，包括以下步骤：
(1) 以滇型杂交粳稻滇杂31杂交种子为对照材料，取对照材料和200粒以上的待鉴定水稻种子于20℃～35℃条件下发芽；
(2) 发芽后水培7～10天，分别取所述的对照材料的叶片为对照样品和待鉴定水稻的叶片为待鉴定样品，每个样品分成4等份，4等份分别加入试剂1、试剂2、试剂3、试剂4后，按常规PCR反应程序进行PCR扩增；所述的试剂1、试剂2、试剂3和试剂4均是在相同的常规PCR反应体系分别加入不同的引物，试剂1为常规PCR反应体系加入DZ31-1引物，试剂2为常规PCR反应体系加入DZ31-2引物，试剂3为常规PCR反应体系加入DZ31-3引物，试剂4为常规PCR反应体系加入DZ31-4引物；
(3) 对PCR扩增产物用含EtBr 0.1μg/ml的2%琼脂糖凝胶电泳分离；
(4) 在紫外透射仪上检测PCR扩增产物及电泳结果，依据电泳结果，按如下①至④步的鉴别即鉴定出滇型杂交粳稻滇杂31种子中杂株数量：
①用DZ31-1引物扩增后，滇型杂交粳稻滇杂31的杂交种分子量为442bp和521bp，基因型为杂合型，其它类型分子量的为杂株；
②用DZ31-2引物扩增后，滇型杂交粳稻滇杂31杂交种分子量为346bp，其它类型分子量的为杂株；
③用DZ31-3引物扩增后，滇型杂交粳稻滇杂31杂交种分子量为428bp，其它类型分子量的为杂株；
④用DZ31-4 引物扩增后，滇型杂交粳稻滇杂31杂交种分子量为350bp，其它类型分子量的为杂株；
所述的DZ31-1引物由上游引物DA31-1-F和下游引物DA31-1-R组成，上游引物DA31-1-F的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，下游引物DA31-1-R的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；所述的DZ31-2引物由上游引物DZ31-2-F和下游引物DZ31-2-R组成，上游引物DZ31-2-F的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，下游引物DZ31-2-R的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：4所示；所述的DZ31-3引物由上游引物DZ31-3-F和下游引物DZ31-3-R组成，上游引物DZ31-3-F的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，下游引物DZ31-3-R的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：6所示；所述的DZ31-4引物由上游引物DZ31-4-F和下游引物DZ31-4-R组成，上游引物DZ31-4-F的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，下游引物DZ31-4-R的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：8所示。
2.如权利要求1所述的滇型杂交粳稻滇杂31种子纯度的分子鉴定方法，步骤(2)所述的常规PCR反应体系是采用15μl反应体系，其中：ddH2O 10.86μl，扩增模板DNA为取的样品叶片，10×PCR buffer1.50μl，25mM MgCl2 1.14μl，2.5mM dNTP mixture 1.20μl，50 μM 上游引物0.10μl，50 μM 下游引物0.10μl，5U?μL -1Taq 0.10μl；所述的常规PCR反应程序是预变性1：98℃ 2min，预变性2：96℃ 2min；变性94℃ 20s、退火56℃ 20s、延伸72℃ 30s，35个循环；延伸72℃ 7min；10℃ 保存。
3.一种滇型杂交粳稻滇杂31种子中杂株的混杂类型的分子鉴定方法，按照权利要求1或2所述的方法进行，并在步骤(1)增加4个对照材料于20℃～35℃发芽，水培7～10天，所述的4个对照分别为母本保持系榆密15B种子、父本恢复系南34种子、母本育性回复株榆密15A可育株种子、籼稻种子；以及在步骤(4)按如下①至④步的鉴别及相互对比即鉴定出滇型杂交粳稻滇杂31种子中杂株的混杂类型：
①DZ31-1引物用于鉴定保持系混杂，扩增后滇型杂交粳稻滇杂31杂交种分子量为442bp和521bp，基因型为杂合型，PCR产物分子量为442bp是母本保持系榆密15B混杂，PCR产物分子量为521bp是父本恢复系南34、或母本育性回复株榆密15A可育株、或籼稻混杂；
②DZ31-2引物用于鉴定除父母本以外的其它粳稻混杂，扩增后滇型杂交粳稻滇杂31杂交种分子量为346bp，PCR产物分子量为425bp是其它粳稻材料混杂；
③DZ31-3引物用于鉴定籼稻或是籼粳杂交种子混杂，扩增后滇型杂交粳稻滇杂31杂交种分子量为428bp，PCR产物分子量为384bp为籼稻混杂，384bp和428bp均有的是籼粳杂交种混杂；
④DZ31-4 引物用于在DZ31-1的基础上鉴定杂株中的母本育性回复的可育株和恢复系混杂，扩增后PCR产物分子量为350bp是父本恢复系南34混杂，780bp是母本育性回复株榆密15A可育株混杂。
4.鉴定滇型杂交粳稻滇杂31种子纯度或鉴定滇型杂交粳稻滇杂31种子中杂株的混杂类型的专用引物，所述的专用引物由DZ31-1引物、DZ31-2引物、DZ31-3引物和DZ31-4 引物组成，所述的DZ31-1引物由上游引物DA31-1-F和下游引物DA31-1-R组成，上游引物DA31-1-F的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，下游引物DA31-1-R的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；所述的DZ31-2引物由上游引物DZ31-2-F和下游引物DZ31-2-R组成，上游引物DZ31-2-F的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，下游引物DZ31-2-R的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：4所示；所述的DZ31-3引物由上游引物DZ31-3-F和下游引物DZ31-3-R组成，上游引物DZ31-3-F的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，下游引物DZ31-3-R的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：6所示；所述的DZ31-4引物由上游引物DZ31-4-F和下游引物DZ31-4-R组成，上游引物DZ31-4-F的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，下游引物DZ31-4-R的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：8所示。
5.权利要求书4所述的鉴定滇型杂交粳稻滇杂31种子纯度或鉴定滇型杂交粳稻滇杂31种子中杂株的混杂类型的专用引物在鉴定滇型杂交粳稻滇杂31种子纯度或鉴定滇型杂交粳稻滇杂31种子中杂株的混杂类型的应用。
6.DZ31-3引物在水稻材料的籼粳分化鉴定中的应用，所述的DZ31-3引物由上游引物DZ31-3-F和下游引物DZ31-3-R组成，上游引物DZ31-3-F的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，下游引物DZ31-3-R的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：6所示。
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