CN105368940B - 一种滇一型三系杂交粳稻不育系的分子鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种滇一型三系杂交粳稻不育系的分子鉴定方法，该方法根据滇一型粳稻不育系细胞质中线粒体基因组中不育基因和细胞核中的恢复基因序列，分别设计了两对引物(csSPF与csSPR1)和(RFSPF2与RFSPR21)，利用这两对引物，进行PCR扩增，根据两对引物的扩增结果，可准确的判定滇一型粳稻不育系，并将之与保持系、恢复系及杂交种区分开，达到高效、快速、准确鉴定不育系的效果。相比于传统技术，本发明设计独到，方法简单，准确率高，能够充分满足目前的发展要求，使得育性基因分子定位更加精确，推动了基因分子鉴定领域的发展。

Description

一种滇一型三系杂交粳稻不育系的分子鉴定方法
技术领域
本发明专利属于农业生物技术领域中的育种领域，特别涉及一种滇一型三系杂交粳稻不育系的分子鉴定方法。
技术背景
水稻是我国重要的粮食作物之一，杂交水稻的育成为我国粮食生产和温饱问题的解决做出了巨大贡献，有效利用水稻杂种优势的基础是雄性不育系的选育应用。其中一类是核基因与细胞质基因互作控制的细胞质雄性不育，另一类是由遗传和环境互作控制的核雄性不育，包括光敏感及温敏感雄性不育。目前粳稻上主要是利用核质基因互作的细胞质雄性不育系，雄性不育系的细胞质类型有包台型(BT型)和滇一型两种。近20年来，分子标记技术的迅猛发展，加快了水稻育性恢复基因的定位和作图的研究步伐。不同学者采用不同的分子标记技术对不同质源的育性恢复基因进行了定位研究，其中以野败型、BT型、滇一型研究较多。
育性恢复基因分子定位的日趋精确，为恢复基因的分子鉴别提供了可能。但分子标记辅助选择时，首先应考虑前景选择的可靠性。而前景选择的可靠性主要取决于标记与目标基因间的连锁程度，只有连锁非常紧密，才能够达到较高的准确率。选择的准确率随重组率的增加迅速下降，在分子辅助选择育种中，若要求选择的准确率达到90％以上，则标记与目标基因的重组率必须小于5％,当重组率达到10％时，选择的准确率已降到80％。
另一方面，由于对不育基因的研究相对滞后，就目前的分子鉴别发展技术来看，还缺乏一种能够快速、有效、准确地检测滇一型粳稻不育系的方法和手段。
发明内容
本发明根据滇一型粳稻不育系细胞质中线粒体基因组中不育基因和细胞核中的恢复基因序列，分别设计了两对引物来进行PCR扩增，根据两对引物的扩增结果，可准确的判定滇一型粳稻不育系，并将之与保持系、恢复系及杂交种区分开，达到高效、快速、准确鉴定不育系的效果。
本发明的技术方案是：提出一种滇一型三系杂交粳稻不育系的分子鉴定方法，该方法包括以下步骤：
(1)将待鉴别的水稻材料叶片提取总DNA；
(2)分别设计了两对引物(csSPF与csSPR1)和(RFSPF2与RFSPR21)，利用这两对引物，分别进行PCR反应；
(3)根据两对引物的扩增结果，判定滇一型粳稻不育系，并将之与保持系、恢复系及杂交种区分开。
以上所述的引物csSPF与csSPR1序列分别为AACCAACGCCGACCCCAAACA和GGCCGCCCTCCCACCTT。
以上所述的引物RFSPF2与RFSPR21序列分别为CCTAATTCATGGTTTGTGCACCTGTA和GCCAAGCAATATCCATTGATAAGAGTATTG。
以上所述的两个PCR反应液的总体积均为15ul，含2×Taq PCR Master Mix(博迈德生物)7.5μL，2个引物(10μmol/L)各0.3μL，模板DNA(15ng/μl)1μl，ddH2O 5.9μl。
以上所述的引物csSPF/csSPR1扩增程序为：
(1)反应液在94℃下预变性5min；
(2)之后反应液分别在94℃变性45s、68.5℃复性45s、72℃延伸30s，并将上述步骤重复28个循环；
(3)最后反应液在72℃温度下延伸7min。
以上所述的引物RFSPF2/RFSPR21扩增程序为：
(1)反应液在94℃下预变性5min；
(2)之后反应液分别在94℃变性45s、65℃复性45s、72℃延伸60s，并将上述步骤重复30个循环；
(3)最后反应液在72℃温度下延伸7min。
本发明相比于现有技术独创性的设计了两对引物来对滇一型三系杂交粳稻不育系的DNA进行PCR扩增，根据两对引物的扩增结果，可准确的判定滇一型粳稻不育系，并将之与保持系、恢复系及杂交种区分开，达到高效、快速、准确鉴定不育系的效果。相比于传统的利用稻穗套袋结实率鉴别不育系的方法，本发明设计独到，方法简单，准确率高，能够充分满足目前的发展要求，使得育性基因分子定位更加精确，推动了基因的分子鉴定领域的发展。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明专利内容作进一步详细的说明。
图1滇一型三系杂交粳稻不育系的分子鉴定方法步骤。
具体实施方式
为进一步说明本发明对滇一型三系杂交粳稻不育系的分子鉴定方法，下面结合附图和实施例，进一步详细说明本发明的的具体实施方式。
首先为了保证能够更加准确的定位滇一型三系杂交粳稻不育系的分子特征，并将之与保持系、恢复系及杂交种区分开，本发明专利设计合成利用两对引物共同对该体系的分子进行PCR扩增并直接测序。这两对引物中csSPF与csSPR1序列分别为AACCAACGCCGACCCCAAACA和GGCCGCCCTCCCACCTT；另外一对引物RFSPF2与RFSPR21的序列分别为CCTAATTCATGGTTTGTGCACCTGTA和GCCAAGCAATATCCATTGATAAGAGTATTG。
为了对滇一型三系杂交粳稻不育系的分子进行标定，首先提取水稻的DNA。具体提取的方法参照SDS法(Dellaporta S L,et al,.PlantMol B iol Rep,1983,1(1):19221.).具体步骤为：取粳稻苗期叶片，在-20℃预冷的研钵中用液氮研磨并装入1.5ml离心管中。之后加入600ul提取液(20％SDS,1M Tris-HCl,0.5M EDTA,5M NaCl,65℃预热)，摇匀，65℃温浴30min，中间震荡3-4次，加入1/4体积5M KAC，摇匀后置冰上30min；加入氯仿-异丙醇(24:1)300-400ul，在摇床上充分震荡，120rpm 30min。之后用8000-10000rpm离心15分钟，液面分层，下面颜色较深，上面微带黄绿色，取上清液至另一离心管，加入等体积的氯仿-异丙醇(24:1)，摇床上充分震荡80-90rpm 30min，然后8000rpm离心15分钟。在将400ul的上清液转移至新的离心管，加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，轻轻摇匀直到有絮状物产生，然后12000rpm离心6min；去掉上面的无水乙醇，再加入4℃70％乙醇，放置10min，弃掉上清液，在超净工作台上风干1h，之后加入100-200ul的TE，在-20℃下保存。
之后利用两对引物对获得的DNA进行PCR扩增。这里所述的两个PCR反应液的总体积均为15ul，含2×Taq PCR Master Mix(博迈德生物)7.5μL，2个引物(10μmol/L)各0.3μL，模板DNA(15ng/μl)1μl，ddH2O 5.9μl。
对于第一对引物csSPF与csSPR1所采用的PCR反应程序包括：反应液在94℃下预变5min；之后反应液分别在94℃变性45s、68.5℃复性45s、72℃延伸30s，并将上述步骤重复28个循环；最后反应液在72℃温度下延伸7min。10℃冷却10min后，将扩增产物加上缓冲液终止反应。
对于第二对引物RFSPF2与RFSPR21所采用的PCR反应程序包括：反应液在94℃下预变5min；之后反应液分别在94℃变性45s、65℃复性45s、72℃延伸1min，并将上述步骤重复30个循环；最后反应液在72℃温度下延伸7min。10℃冷却10min后，将扩增产物加上缓冲液终止反应。
将上述PCR扩增获得的扩增片段用质量分数为1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳的缓冲体系为1倍的TAE溶液，在100V恒压下，电泳50min，紫外光下拍照并保存。其步骤如图1所示。
上述实施例不以任何方式限制本发明专利，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明专利的保护范围内。

Claims (4)

1.一种滇一型三系杂交粳稻不育系的分子鉴定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将待鉴别的粳稻材料叶片提取总DNA；
(2)分别设计了两对引物csSPF与csSPR1和RFSPF2与RFSPR21，利用这两对引物，分别进行PCR反应；
所述的引物csSPF与csSPR1序列分别为AACCAACGCCGACCCCAAACA和GGCCGCCCTCCCACCTT；
所述的引物RFSPF2与RFSPR21序列分别为CCTAATTCATGGTTTGTGCACCTGTA和GCCAAGCAATATCCATTGATAAGAGTATTG；
(3)根据两对引物的扩增结果，判定滇一型粳稻不育系，并将之与保持系、恢复系及杂交种区分开。
2.如权利要求1所述的一种滇一型三系杂交粳稻不育系的分子鉴定方法，其特征在于所述的两个PCR反应液的总体积均为15ul，包含2×Taq PCR MasterMix 7.5μL，2个引物 各0.3μL，模板DNA 1μL，ddH2O 5.9μL。
3.如权利要求1所述的一种滇一型三系杂交粳稻不育系的分子鉴定方法，其特征在于所述的引物对csSPF/csSPR1扩增程序为：
(1)反应液在94℃下预变性5min；
(2)之后反应液分别在94℃变性45s、68.5℃复性45s、72℃延伸30s，并将上述步骤重复28个循环；
(3)最后反应液在72℃温度下延伸7min。
4.如权利要求1所述的一种滇一型三系杂交粳稻不育系的分子鉴定方法，其特征在于所述的引物RFSPF2/RFSPR21扩增程序为：
（1）反应液在94℃ 下预变性5min；
（2）之后反应液分别在94℃变性45s、65℃复性45s、72℃延伸1min，并将上述步骤重复30个循环；
（3）最后反应液在72℃温度下延伸7min。
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CN103146807A (zh) * 2011-12-07 2013-06-12 中国农业科学院棉花研究所 含哈克尼西棉不育胞质的棉花三系杂交种的分子鉴定方法
CN102605074B (zh) * 2012-03-23 2013-09-11 江苏省农业科学院 一种鉴别粳稻BT型细胞质雄性不育恢复基因Rf1a的分子标记方法
CN103233069B (zh) * 2013-04-19 2014-11-19 云南农业大学 滇型杂交粳稻滇杂31种子纯度的分子鉴定方法及其专用引物
CN103931483B (zh) * 2014-04-03 2015-10-07 上海市农业科学院 高抗性淀粉含量杂交粳稻三系不育系和恢复系的选育方法及应用

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