CN106011257A - 一种芜菁与萝卜属间远缘杂交后代的分子鉴定方法 - Google Patents

一种芜菁与萝卜属间远缘杂交后代的分子鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种芜菁与萝卜属间远缘杂交后代的分子鉴定方法，属于植物杂交鉴定技术领域。该方法包括以下步骤：(1)提取待鉴别的芜菁与萝卜属间远缘杂交后代的基因组DNA；(2)以芸薹属B.rapa基因组标记：BRMS042(R3)或萝卜基因组SSR标记：RSS0173的核苷酸序列为引物，步骤(1)得到杂种后代基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物；(3)利用凝胶电泳检测步骤(2)得到的扩增产物；(4)分析凝胶电泳结果。本发明用于鉴定芜菁和萝卜属间杂种苗的真实性，大大提高了杂种苗的鉴定效率。

Description

一种芜菁与萝卜属间远缘杂交后代的分子鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种芜菁与萝卜属间远缘杂交后代的分子鉴定方法，属于植物杂交鉴定技术领域。
背景技术
远缘杂交是指不同种或亚种间以及种以上亲缘关系更远的个体间的杂交，包括有性杂交和体细胞杂交。远缘杂交是植物遗传研究和遗传改良的重要技术之一，杂交可以综合亲本种的适应性或创造出新的适应性，丰富基因库，拓宽生境，进而促进基因组进化和新种形成，被广泛用来研究物种间的亲缘关系，创建供遗传分析的材料(如异源染色体附加系、代换系和易位系等)，以及转移有利性状和基因，创建新的育种种质资源。
芜菁(Brassica campestris L.spp.rapifera Sinsk,syn B.rapa L.ssp.rapifera,2n＝20,AA)是十字花科芸薹属芸薹种芜菁亚种，原产欧洲，现欧洲、亚洲和美洲均有栽培。以其肥大肉质根供食用。由于对环境的适应性很强，产量较高，汁多味甜可食，是具有较长食用历史的传统蔬菜之一。萝卜(Raphanus sativus L.,2n＝18，RR)又名莱菔，十字花科、萝卜属。原产于我国，是主要的根茎类蔬菜之一，其营养丰富、管理简便、产量高、成本低，供应期长，产品耐贮运，用途广，可以做菜用、生食水果用、加工腌渍和干制，而且还具较高的食疗作用。萝卜属中存在着许多对芸薹属栽培作物有利的性状和基因，如细胞质雄性不育及恢复基因、自交不亲和基因和多种抗逆基因。芜菁和萝卜的杂种后代，作为一种新型的遗传材料，有助于探明物种间的种属进化关系；促进芸薹属和萝卜属间的基因交流。
早期，人们主要采用形态学、细胞学以及同工酶的方法对杂种后代进行鉴别。形态学鉴定，主要是通过田间种植鉴定，整个过程耗时长，工作量大，并且容易受季节和环境的影响；细胞学和同工酶鉴定，容易受到环境和所取材料部位的影响，有时难以进行纯度检测与鉴定，且同工酶检测的准确度不高。
随着分子生物学技术的迅猛发展，从DNA分子的水平上对杂种进行基因鉴定，确定杂种真实性成为可能，以PCR为基础的分子标记技术，由于其快速简便，客观准确、稳定可靠，成本相对较低等优点，成为杂种真实性鉴定的首选技术之一，已在多种作物中得到应用。
发明内容
本发明解决的技术问题是：提出一种操作简便，费用低，准确度高且通用性好用于鉴定芜菁和萝卜属间杂种苗的真实性的芜菁与萝卜属间远缘杂交后代的分子鉴定方法。
为了解决上述技术问题，本发明提出的技术方案是：一种芜菁与萝卜属间远缘杂交后代的分子鉴定方法，包括以下步骤：
(1)提取待鉴别的芜菁与萝卜属间远缘杂交后代的基因组DNA；
(2)以芸薹属B.rapa基因组标记：BRMS042(R3)或萝卜基因组SSR标记：RSS0173的核苷酸序列为引物，步骤(1)得到杂种后代基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3)利用凝胶电泳检测步骤(2)得到的扩增产物；
(4)分析凝胶电泳结果。
优选的，步骤(2)中，所述的PCR扩增，其反应体系为20ul，其中DNA 10ng，正反向引物各0.5μmol·L-1。
优选的，步骤(1)中，取杂种后代的新鲜叶片0.2g，于液氮中研磨，在65℃水浴中预热提取缓冲液，研磨成均匀粉状后，加入900ul提取缓冲液以及0.2％v/v的β-巯基乙醇，震荡混匀，于65℃水浴30min。
优选的，所述提取缓冲液为2％SDS，1mol/L NaCl，50m mol/L EDTA，2％PVP40，100mmol/L Tris-HCl，pH＝8.0。
优选的，步骤(2)中，所述的PCR扩增，其PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，40个循环；72℃保温5min，4℃保存。
优选的，所述PCR扩增产物采用非变性聚丙烯胺凝胶电泳，70.54ml凝胶中含有：10×TBE6.75ml、Arc：Bis(19:1，质量比)6.75ml、TEMED 90ul、10％APS 350ul；PCR产物在7.2％的聚丙烯酰胺凝胶上分离，5ul PCR产物上样，220V，电泳1～2h；凝胶采用5％冰醋酸、10％无水乙醇固定液，固定15min；0.2％AgNO3溶液染色15min；后加去离子水冲洗30秒；1％Na2S2O3溶液进行漂洗30秒～1min；显影液1.5％NaOH，1％甲醛中显影；拍照。
优选的，利用BRMS042(R3)引物，对芜菁与萝卜的属间杂种后代进行PCR扩增，在杂种后代中同时产生大小为135bp和100bp～96bp的杂种株为真正的芜菁与萝卜属间杂种株。
优选的，利用RSS0173引物，对芜菁-萝卜的属间杂种后代进行PCR扩增，在杂种后代中同时产生大小为159bp和130～133bp的杂种株为真正的芜菁与萝卜属间杂种株。
有益效果:
本发明筛选出能够在属间杂种苗中产生具备父母本特异标记条带且不受环境影响的分子标记，用于鉴定芜菁和萝卜属间杂种苗的真实性，大大提高了杂种苗的鉴定效率。该检测方法具有标记稳定，准确性高，不受被测样品生长阶段和环境影响，在整个生长季节均可使用，操作简便，费用低，准确度高且通用性好，可以用于快速鉴定芜菁和萝卜属间杂交种的真实性。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明。
图1是实施2的BRMS042(R3)引物扩增产物电泳图
图2是实施3的RSS0173引物扩增产物电泳图
具体实施方式
实施例1
芜菁与萝卜属间远缘杂交后代的分子鉴定方法，包括如下步骤：
(1)提取芜菁、萝卜亲本，以及通过形态学和细胞学鉴定为真实性属间杂种的基因组DNA；
(2)以芸薹属B.rapa基因组标记：BRMS042(R3)以及萝卜基因组SSR标记：RSS0173的核苷酸序列为引物，步骤(1)得到的亲本及杂种后代基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3)利用非变性聚丙烯胺凝胶电泳检测步骤(2)得到的扩增产物；
(4)分析凝胶电泳结果，若属间杂种后代均拥有双亲特征性条带，则认为该标记对属间杂种的鉴定是准确、可靠的。
步骤(1)中，芜菁、萝卜亲本以及杂种后代基因组DNA的提取方法如下：
(a)取植物叶片约0.2g，于液氮中研磨，在65℃水浴中预热提取缓冲液，研磨成均匀粉状后，加入900ul提取缓冲液以及0.2％v/v的β-巯基乙醇，震荡混匀，于65℃水浴30min；
所述的CTAB裂解液的组成如下：2％SDS，1mol/L NaCl，50m mol/L EDTA，2％PVP40，100m mol/L Tris-HCl，pH＝8.0；
(b)加入1/3体积5mol/L KAC(300ul)，冰浴30min–1hr，4℃，12000rpm，离心10min；
(c)取上清，加入1/5体积的5％CTAB Buffer，上下颠倒充分混匀，65℃水浴约20min；
(d)待冷却至室温后，加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1)，抽提2次，室温，11000rpm，离心5min，如果界面浑浊再抽提一至两次；
(e)取上清，加2/3体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温放置10min，12000rpm，离心10min；
(f)弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀两次，抽干沉淀，加500ul灭菌水溶解；加入1/10体积RNase(10mg/ml)处理DNA样品，37℃，30min；
(g)加入1/10体积3mol/L NaAc(PH:5.2)，2倍体积无水乙醇混匀，-20℃放置10min，4℃，6000rpm，离心5min，用70％乙醇洗涤沉淀两次，抽干沉淀，加适量TE buffer溶解，取2ul于0.8％琼脂糖凝胶中，100V，电泳30min，检测DNA质量，其余置于4℃或者-20℃保存。
步骤(2)中，所述的PCR扩增，其反应体系为20ul，其中，DNA 10ng，superTaq mix(上海浦迪生物科技有限公司)10ul，正反向引物各0.5μmol·L-1。
步骤(2)中，所述的PCR扩增，其PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，40个循环；72℃保温5min，4℃保存。
实施例2
(1)DNA提取
(a)取母本芜菁13W7、父本萝卜14R5，以及杂种后代7株的新鲜叶片约0.2g，于液氮中研磨。在65℃水浴中预热提取缓冲液(2％SDS，1mol/L NaCl，50m mol/L EDTA，2％PVP40，100m mol/L Tris-HCl，pH＝8.0)，研磨成均匀粉状后，加入900ul提取缓冲液以及0.2％v/v的β-巯基乙醇，震荡混匀，于65℃水浴30min；
(b)加入1/3体积5mol/L KAC(300ul)，冰浴30min–1hr，4℃，12000rpm，离心10min；
(c)取上清，加入1/5体积的5％CTAB Buffer，上下颠倒充分混匀，65℃水浴约20min；
(d)待冷却至室温后，加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1)，抽提2次，室温，11000rpm，离心5min，如果界面浑浊再抽提一至两次；
(e)取上清，加2/3体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温放置10min，12000rpm，离心10min；
(f)弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀两次，抽干沉淀，加500ul灭菌水溶解；加入1/10体积RNase(10mg/ml)处理DNA样品，37℃，30min；
(g)加入1/10体积3mol/LNaAc(PH:5.2),2倍体积无水乙醇混匀，-20℃放置10min，4℃，6000rpm，离心5min，用70％乙醇洗涤沉淀两次，抽干沉淀，加适量TE buffer溶解，取2ul于0.8％琼脂糖凝胶中，100V，电泳30min，检测DNA质量，其余置于4℃或者-20℃保存。
(2)分子标记分析
利用分子标记对芜菁和萝卜亲本及属间杂种进行PCR扩增，筛选出具有双亲共同特征条带的特征引物：芸薹属B.rapa基因组标记:BRMS042(R3)(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示)。利用获得的有效特征引物对芜菁(13W7)、萝卜(14R5)及其属间杂种后代(Z1～Z7)叶片基因组DNA进行PCR扩增，标记扩增反应体系与扩增程序为：反应体系20ul含10ng基因组DNA，superTaq mix 10ul，正反向引物各0.5μmol·L-1；PCR扩增程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，40个循环；72℃5min，延伸，4℃保存。
(3)扩增产物检测
PCR扩增产物采用非变性聚丙烯胺凝胶电泳(PAGE)。70.54ml凝胶中含有：10×TBE6.75ml、Arc：Bis(19:1，质量比)6.75ml、TEMED 90ul、10％APS 350ul；PCR产物在7.2％的聚丙烯酰胺凝胶上分离。5ul PCR产物上样，220V，电泳1～2h；凝胶采用5％冰醋酸、10％无水乙醇固定液，固定15min；0.2％AgNO3溶液染色15min；后加去离子水冲洗30秒；1％Na2S2O3溶液进行漂洗30秒～1min；显影液(1.5％NaOH，1％甲醛)中显影；拍照。
(4)芜菁萝卜属间杂种苗真实性鉴定
对属间杂种后代基因组DNA扩增产物进行电泳分析。根据BRMS042(R3)特异引物产生的目的标记条带来判别杂种后代的真实性。
只有同时具备父，母本特异性标记条带的幼苗单株被判定为真正的属间杂种苗。
本实验用20对芸薹和萝卜基因组引物对亲本及杂种后代进行基因组DNA扩增，经过多次重复，证实芸薹属B.rapa基因组标记:BRMS042(R3)，扩增条带表现为稳定的共显性，即杂种表现为父母本互补的带型，且条带清晰、重复性好。利用共显现BRMS042(R3)引物组合，对7株芜菁-萝卜的属间杂种后代进行PCR扩增，在杂种后代中同时产生大小为135bp的母本芜菁的特异性标记条带BRMS042(R3)135与100bp或者96bp的父本萝卜的特异性标记条带BRMS042(R3)100(Z2～Z7)和BRMS042(R3)96(Z1)的杂种株为真正的芜菁-萝卜属间杂种株。
实施例3
本实施例中用到的提取基因组的方法、PCR方法及扩增产物检测方法与实施例2相同，所不同的是，本实施例所用引物为萝卜基因组SSR标记：RSS0173的核苷酸序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示)，对芜菁、萝卜亲本及其属间杂种的植株进行鉴定，PCR结果(图2)显示：在杂种后代中同时产生大小为159bp的父本萝卜的特异性标记条带RSS0173159与130～133bp的母本芜菁的特异性标记条带RSS0173130(Z2，Z4～Z6)和RSS0173133(Z3、Z7)的杂种株为真正的芜菁-萝卜属间杂种株。
本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。

Claims (8)

1.一种芜菁与萝卜属间远缘杂交后代的分子鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)提取待鉴别的芜菁与萝卜属间远缘杂交后代的基因组DNA；
(2)以芸薹属B.rapa基因组标记：BRMS042(R3)或萝卜基因组SSR标记：RSS0173的核苷酸序列为引物，步骤(1)得到杂种后代基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3)利用凝胶电泳检测步骤(2)得到的扩增产物；
(4)分析凝胶电泳结果。
2.根据权利要求1所述的芜菁与萝卜属间远缘杂交后代的分子鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的PCR扩增，其反应体系为20ul，其中DNA 10ng，正反向引物各0.5μmol·L-1。
3.根据权利要求1所述的芜菁与萝卜属间远缘杂交后代的分子鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中，取杂种后代的新鲜叶片0.2g，于液氮中研磨，在65℃水浴中预热提取缓冲液，研磨成均匀粉状后，加入900ul提取缓冲液以及0.2％v/v的β-巯基乙醇，震荡混匀，于65℃水浴30min。
4.根据权利要求3所述的芜菁与萝卜属间远缘杂交后代的分子鉴定方法，其特征在于：所述提取缓冲液为2％SDS，1mol/L NaCl，50m mol/L EDTA，2％PVP40，100m mol/LTris-HCl，pH＝8.0。
5.根据权利要求1所述的芜菁与萝卜属间远缘杂交后代的分子鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的PCR扩增，其PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，40个循环；72℃保温5min，4℃保存。
6.根据权利要求1所述的芜菁与萝卜属间远缘杂交后代的分子鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增产物采用非变性聚丙烯胺凝胶电泳，70.54ml凝胶中含有：10×TBE 6.75ml、Arc：Bis(19:1，质量比)6.75ml、TEMED 90ul、10％APS 350ul；PCR产物在7.2％的聚丙烯酰胺凝胶上分离，5ul PCR产物上样，220V，电泳1～2h；凝胶采用5％冰醋酸、10％无水乙醇固定液，固定15min；0.2％AgNO3溶液染色15min；后加去离子水冲洗30秒；1％Na2S2O3溶液进行漂洗30秒～1min；显影液1.5％NaOH，1％甲醛中显影；拍照。
7.根据权利要求1所述的芜菁与萝卜属间远缘杂交后代的分子鉴定方法，其特征在于：利用BRMS042(R3)引物，对芜菁与萝卜的属间杂种后代进行PCR扩增，在杂种后代中同时产生大小为135bp和96bp～100bp的杂种株为真正的芜菁与萝卜属间杂种株。
8.根据权利要求1所述的芜菁与萝卜属间远缘杂交后代的分子鉴定方法，其特征在于：利用RSS0173引物，对芜菁-萝卜的属间杂种后代进行PCR扩增，在杂种后代中同时产生大小为159bp和130～133bp的杂种株为真正的芜菁与萝卜属间杂种株。
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