CN107190096B - 树木的通用分子标记引物及其联合开发方法和应用 - Google Patents

树木的通用分子标记引物及其联合开发方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种树木的通用分子标记引物及其联合开发方法和应用，其中，本发明采用三种分子标记联合开发的方法，规避了单一分子标记的局限性，如SSR序列两侧序列种间保守性较低，这大大限制了SSR标记在其他物种中的利用，ILP标记和IP仅存于染色体基因区段，对于其他非编码区间则不能使用该方法，多种分子标记方法的联合使用将每种标记的优势相结合，结果更加客观；采用本发明的方法获得的树木的SSR、ILP和PIP通用分子标记引物，不仅克服了目前树木分子标记较少、标记通用性较低、树木品种难以区分的问题，而且还可以提高树木品种鉴定结果的准确性。

Description

树木的通用分子标记引物及其联合开发方法和应用
技术领域
本发明涉及分子标记引物及其开发方法和应用，具体涉及树木的SSR、ILP和PIP通用分子标记引物、基于树木基因组联合开发前述通用分子标记引物的方法、以及前述通用分子标记引物在树木中的应用，属于分子标记开发与应用技术领域。
背景技术
树木是重要的自然资源，一方面树木为保护我们的自然生态环境发挥了巨大作用，另一方面树木是重要的家具原料和工业原料，具有重要的经济价值。
我国深林资源短缺，南北分布不均匀，经济效益较低，选育优良品种是解决以上问题的有效途径。
由于树木生长周期长，许多优良性状为多基因控制的数量性状，所以利用常规的育种手段往往会消耗大量的人力物力和时间。
分子生物学育种可以缩短育种年限，加速优良品种的选育，具有很大的发掘潜力。因此，研究人员寄希望于分子生物学技术方法，以克服常规育种中的育种周期冗长的问题。
相比于重要农作物，利用分子生物技术进行树木的遗传改良起步较晚，标记开发模式单一，仅用一种分子标记，结果可靠性较低。另外，基于某个基因组开发的分子标记应用范围较窄，在其他树木物种中应用受到限制。
近年来分子标记技术发展迅速，作为育种的辅助工具，分子标记具有高效、准确、不受环境影响等特点，其应用越来越受到重视。特别是SSR标记技术，具有结果可靠、重复性好、多态性丰富、操作简单、呈共显性遗传等特点，十分有利于树木品种的鉴定。然而，单一分子标记的使用范围和效力往往是有限的，结合其他分子标记联合开发和应用将会更大程度上发挥分子标记技术的优势。
ILP标记技术是一种基因标记，引物保守性高通用性好，相比于SSR标记更易于使用和记录，具有很好的应用前景。SSR标记和ILP标记具有各自的优点，联合开发使用两种标记，将它们应用于树木的育种、遗传多样性分析、核心种质资源的收集，将会获得更好的效果。
PIP标记适用于只有公布的基因组序列而没有具体的基因组结构信息的物种，由于没有详细的内含子位点信息，所以无法按照常规方法提取内含子序列。PIP分子标记为基因组信息不全的物种开发分子标记提供了可能。
SSR、ILP和PIP通用标记之所以可以联合开发，其原因在于它们的设计原理是一致的。每个SSR侧翼的DNA序列大多是相对保守的单拷贝序列，尤其是在亲缘关系近的物种间更为保守。根据SSR侧翼序列的保守性质，将引物设计在保守序列区域内，从而可以扩增出具有多态性的SSR位点。对于ILP标记和PIP标记而言，二者的设计原理依赖于基因上的内含子因为面对较小的进化压力而呈现出较高频率的插入和丢失，两侧外显子序列由于承担转录表达功能而具有较高保守性。这与SSR标记的开发原理是相通的。因此，SSR、ILP和PIP通用标记在树木中的联合开发，共同应用是可行的。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种基于树木基因组的树木的SSR、ILP和PIP通用分子标记引物的联合开发方法。
本发明的第二个目的在于提供通过上述方法获得的树木的通用分子标记引物。
为了实现上述两个目标，本发明采用如下的技术方案：
一种树木的SSR、ILP和PIP通用分子标记引物的联合开发方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1：SSR位点和intron位点扫描
从公共数据平台下载全部树木基因组序列和基因组注释信息，扫描基因组序列中的SSR位点、intron位点和预测intron位点，获得相应的位点信息；
Step2：引物设计
基于上一步获得的位点信息，利用perl程序，提取出位点两侧长度为60bp的DNA序列做为引物前体，然后利用eprimer3软件进行引物设计，设计好的引物成对存在；
Step3：ePCR验证
结合所下载的树木基因组序列，利用Linux平台上的ePCR软件对设计好的引物进行电子模拟PCR，如果一对引物在所下载的全部物种电子模拟PCR中都扩增出了条带，则该对引物即为一个通用分子标记。
前述的树木的SSR、ILP和PIP通用分子标记引物的联合开发方法，其特征在于，在Step1中，前述基因组序列来自于十三个树木物种，分别为无油樟、油棕榈、麻风树、桑树、枣椰树、胡杨、欧洲大叶杨、桃树、卷柏、可可树、橡胶树、火炬松、柳树。
前述的树木的SSR、ILP和PIP通用分子标记引物的联合开发方法，其特征在于，在Step1中，前述SSR位点的最小长度为12bp。
根据前述的树木的SSR、ILP和PIP通用分子标记引物的联合开发方法，其特征在于，在Step2中，设计好的前引物和后引物的长度分别为15bp-25bp、15bp-25bp。
由前述方法获得的树木的通用分子标记引物，其特征在于，包括：2对SSR通用分子标记引物、2对ILP通用分子标记引物和2对PIP通用分子标记引物，具体如下：
Figure BDA0001360184110000041
本发明的有益之处在于：
(一)通用分子标记引物的联合开发方法
本发明采用三种分子标记联合开发的方法，规避了单一分子标记的局限性，如SSR序列两侧序列种间保守性较低，这大大限制了SSR标记在其他物种中的利用，ILP标记和IP仅存于染色体基因区段，对于其他非编码区间则不能使用该方法，多种分子标记方法的联合使用将每种标记的优势相结合，结果更加客观。
(二)获得的通用分子标记引物
采用本发明的方法获得的树木的SSR、ILP和PIP通用分子标记引物，不仅克服了目前树木分子标记较少、标记通用性较低、树木品种难以区分的问题，而且还可以提高树木品种鉴定结果的准确性。
附图说明
图1是本发明的树木的SSR、ILP和PIP通用分子标记引物的联合开发方法的流程图；
图2是采用本发明的方法获得的通用分子标记引物在4个树木品种中的PCR扩增检测片段图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
参照图1，本发明的树木的SSR、ILP和PIP通用分子标记引物的联合开发方法，包括以下步骤：
Step1：SSR位点和intron位点扫描
从公共数据平台下载全部树木基因组序列和基因组注释信息，扫描基因组序列中的SSR位点、intron位点和预测intron位点，获得相应的位点信息。
一般认为SSR位点的最小长度为12bp，即单核苷酸重复单元至少为12重复，二核苷酸重复单元至少6重复，三核苷酸重复单元至少为4此重复，四核苷酸重复单元至少为3重复，五核苷酸至少为3重复，六核苷酸重复单元至少为2重复，七核苷酸重复单元至少为2重复。
Step2：引物设计
基于上一步获得的位点信息，利用perl程序，提取出位点两侧长度为60bp的DNA序列做为引物前体，然后利用eprimer3软件进行引物设计，设计好的引物成对存在，其中，前引物的长度为20bp左右，一般为15bp-25bp，后引物的长度也为20bp左右，一般为15bp-25bp。
Step3：ePCR验证
结合所下载的树木基因组序列，利用Linux平台上的ePCR软件对设计好的引物进行电子模拟PCR，如果一对引物在所下载的全部物种电子模拟PCR中都扩增出了条带，则该对引物即为一个通用分子标记。
我们针对现有的研究情况，基于已经发布基因组的十三个树木物种，进行了树木的通用分子标记的开发，具体的步骤如下：
Step1：SSR位点和intron位点扫描
(1)下载基因组序列
从NCBI公共数据平台下载全部树木基因组序列和基因组注释信息以预测染色图内含子结构等信息。
截至目前，该公共数据平台发布了十三个树木物种的基因组序列和相应的基因组注释信息，这十三个树木物种的信息下表：
Figure BDA0001360184110000071
(2)扫描位点
扫描基因组序列中的SSR位点、intron位点和预测intron位点，获得相应的位点信息。一般认为SSR位点的最小长度为12bp。
通过扫描，我们得到的相应的位点信息如下：
Figure BDA0001360184110000072
Figure BDA0001360184110000081
Step2：引物设计
(1)提取引物前体
基于上一步获得的位点信息，利用perl程序，提取出位点两侧长度为60bp的DNA序列做为引物前体。
我们得到的引物前体的信息如下：
Figure BDA0001360184110000082
Figure BDA0001360184110000091
(2)设计引物
利用eprimer3软件进行引物设计，设计好的引物成对存在，其中，前引物的长度为20bp左右，一般为15bp-25bp，后引物的长度也为20bp左右，一般为15bp-25bp。
我们设计得到的引物的信息如下：
Figure BDA0001360184110000092
Step3：ePCR验证
结合所下载的十三个树木基因组序列，利用Linux平台上的ePCR软件对设计好的引物进行电子模拟PCR，如果一对引物在所下载的全部十三个物种电子模拟PCR中都扩增出了条带，则该对引物即为一个通用分子标记。
Figure BDA0001360184110000101
经过ePCR验证，我们共计得到了2对SSR通用分子标记引物、2对ILP通用分子标记引物和2对PIP通用分子标记引物。
这6对通用分子标记引物的信息如下：
Figure BDA0001360184110000102
随后，我们从表1给出的十三个物种中随机选出了四个树木物种，分别为：柳树、杨树、桑树、柏树，依次编号为1、2、3、4，利用这四个树木物种对表2中的通用分子标记引物的通用性进行了验证。具体如下：
Step1：DNA提取
(1)从每个供试材料的单株上取一片嫩叶约0.2g，放到研钵中，倒入液氮并迅速研磨成粉，将粉末装入事先装有0.7ml 65℃预热的CTAB提取缓冲液的1.5ml离心管中，快速振荡混匀，65℃水浴1h，期间不定时摇匀。
(2)放置室温，加入等体积(0.7ml)的氯仿－异戊醇(v/v 24:1)，轻轻混匀，4℃，8000r，离心10min。
(3)取出上清，加入0.6体积(420μl)的异丙醇，室温下静置15min。
(4)8000r，4℃，离心10min，取沉淀，用75％的乙醇洗两次，无水乙醇洗一次，自由挥发。
(5)将沉淀溶解在200μl TE缓冲液中，置于-20℃冰箱保存。
Step2：PCR扩增
以上述树木DNA为模板，利用设计好的通用分子标记引物(上游引物和下游引物)进行PCR扩增。
PCR扩增总体积为15μl：
Figure BDA0001360184110000111
Figure BDA0001360184110000121
PCR扩增在MYCYCLE扩增仪上进行，扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃复性1min，35个循环；72℃延伸10min；最后扩增产物4℃保存。
Step3：电泳分离与染色
扩增产物采用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离(丙烯酰胺：甲叉＝19：1，1×TBE)，电泳缓冲液为1×TBE，电压120V，跑2小时30分钟。
电泳结束后，凝胶显色采用银染方法：
(1)固定：量取10ml乙醇和0.5ml冰醋酸，加蒸馏水到100ml，配制得到固定液，将配好的固定液倒入盘中，摇匀后将凝胶浸入固定液中，平行摇动4min。
(2)染色：向盘中加入1ml 20％AgNO3定影液，然后平行摇动6min。
(3)水洗：倒掉定影液，加入蒸馏水清洗3次，每次清洗的时间为2min，洗净后倒掉蒸馏水。
(4)显影：在盘中加入100ml 3％NaOH溶液和0.5ml甲醛，迅速震荡，使显影液均匀作用，然后平行摇动直至显影，清楚显影后，倒掉显影液，加入蒸馏水清洗2次，最后在凝胶成像系统中照相保存，凝胶成像结果见图2。
从图2我们可以看到，每个标记在四个物种中均可扩增出多个长度不同的序列片段，每个标记表现出良好的多态性。
由此可见，采用本发明的方法获得的树木的SSR、ILP和PIP通用分子标记引物，具有较高的多态性和通用性，克服了目前树木标记通用性较低的问题。
由于标记表现出的良好的多态性和通用性，所以采用本发明的方法获得的树木的SSR、ILP和PIP通用分子标记引物不仅可以克服树木品种难以区分的问题，而且还可以提高树木品种鉴定结果的准确性，从而可以应用在树木遗传多样性分析、遗传图谱构建、分子标记辅助育种等方面。
以树木遗传多样性分析为例，利用分子标记技术有助于从本质上揭示树木遗传变异及其变异规律，研究树木品种间的遗传多样性水平和等位基因频率以及统计分析树木种群的遗传结构等。
以遗传图谱构建为例，通过将多态性表现好的不同的分子标记牟定在染色体上，分析其在染色体上的相对位置和排列情况，从而构建分子标记的遗传连锁图谱。利用分子标记构建的遗传图谱可以对树木的重要性状进行遗传分析与基因定位。
以分子标记辅助育种为例，利用分子标记与目标性状基因紧密连锁的特点，通过大量开发与检测分子标记，从而达到选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境影响的优点。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.树木的SSR、ILP和PIP通用分子标记引物的联合开发方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1：SSR位点和intron位点扫描
从公共数据平台下载全部树木基因组序列和基因组注释信息，扫描基因组序列中的SSR位点、intron位点和预测intron位点，获得相应的位点信息，所述SSR位点的最小长度为12bp，其中，所述基因组序列来自于十三个树木物种，分别为无油樟、油棕榈、麻风树、桑树、枣椰树、胡杨、欧洲大叶杨、桃树、卷柏、可可树、橡胶树、火炬松、柳树；
Step2：引物设计
基于上一步获得的位点信息，利用perl程序，提取出位点两侧长度为60bp的DNA序列做为引物前体，然后利用eprimer3软件进行引物设计，设计好的引物成对存在；
Step3：ePCR验证
结合所下载的树木基因组序列，利用Linux平台上的ePCR软件对设计好的引物进行电子模拟PCR，如果一对引物在所下载的全部物种电子模拟PCR中都扩增出了条带，则该对引物即为一个通用分子标记，其中：
由上述方法获得的树木的通用分子标记引物，包括：2对SSR通用分子标记引物、2对ILP通用分子标记引物和2对PIP通用分子标记引物，具体如下：
Figure FDA0003007059110000021
2.根据权利要求1所述的树木的SSR、ILP和PIP通用分子标记引物的联合开发方法，其特征在于，在Step2中，设计好的前引物和后引物的长度分别为15bp-25bp、15bp-25bp。
3.树木的通用分子标记引物在树木遗传多样性分析、遗传图谱构建和分子标记辅助育种中的应用，所述的树木的通用分子标记引物为:
Figure FDA0003007059110000022
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