CN105385699A - 三峡库区沿江口岸4种鼠类cytB特异序列及分子鉴定方法 - Google Patents

三峡库区沿江口岸4种鼠类cytB特异序列及分子鉴定方法 Download PDF

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张华荣
文海燕
骆星丹
王董
彭彦卿
郝玉通
刘启军
陈正明
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Abstract

本发明公开了三峡库区沿江口岸4种鼠类cytB特异序列及分子鉴定方法，包括DNA序列为SEQ？ID？NO.1的黄胸鼠cytB基因序列；DNA序列为SEQ？ID？NO.2的小家鼠cytB基因序列；DNA序列为SEQ？ID？NO.3的褐家鼠cytB基因序列；DNA序列为SEQ？ID？NO.4的黑线姬鼠cytB基因序列。以及利用上述基因序列鉴定黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠以及黑线姬鼠的方法，包括DNA模板的制备、PCR扩增、PCR产物检测、序列分析步骤。本方法能快速进行遗传分析以确定截获鼠类是否为本地鼠类，还能对种内不同地理种，不同个体进行区别。

Description

三峡库区沿江口岸4种鼠类cytB特异序列及分子鉴定方法
技术领域
本发明涉及DNA条形码领域，具体是三峡库区沿江口岸4种主要鼠类cytB特异序列及分子鉴定方法。
背景技术
Hebert等在2003年明确提出DNA条形码的概念，DNA条形码就是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析从而进行物种鉴定的方法。COI，cytB，16sRNA等基因均可以被选做条形码。
相较于传统形态学方式，DNA条形码拥有如下优势：①分子鉴定技术可以鉴定鼠体不完整的标本，理论上只需要提取足够PCR扩增反应的组织就可以鉴定种群；②技术简便，简捷快速，易于构建统一的DNA条形编码数据库。可以实现门、纲、目、科、属、种、亚种等不同分类水平物种的鉴定，且具有高度的可重复性；③DNA条形码技术不需要像形态学鉴定那样需要较多经验积累。传统的形态学鉴定依靠外形、头骨、牙齿等特征，十分依赖和模式标本的对比，专业性强。
目前文献显示，国内鼠类分子鉴定多选用COI基因作为条形码序列，通过保守通用引物从目标鼠DNA扩增获得COI基因，测序后对序列进行检索，比对，能成功地鉴定目标种类的种属情况。但是COI基因相对较保守，对于亚种，地理种等鉴定效果不佳，且进化速度较慢，不能对种内不同地理种，不同个体进行区别。
三峡库区是三峡工程建设后形成的特殊区域，生态环境及鼠类种群分布存在其特殊性。库区口岸主要鼠类有黄胸鼠，褐家鼠，小家鼠和黑线姬鼠等。随着库区口岸开放程度，截获入境鼠类数量越来越多。目前，鼠类鉴定仍以形态学鉴定为主，但不同区域的同一种鼠类存在遗传差异，明确其分子鉴定标签基因特征对鼠类快速鉴定十分必要，同时可弥补传统形态学鉴定的不足。了解本地主要鼠类分子鉴定特征十分重要。
发明内容
鉴于以上缺陷，本发明的第一目的是提供三峡库区沿江口岸4种鼠类cytB特异序列，第二目的是利用上述4种鼠类cytB特异序列鉴定黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠以及黑线姬鼠的分子鉴定方法。
为了实现上述第一目的本发明采用的技术方案是：三峡库区沿江口岸4种鼠类cytB特异序列，包括DNA序列为SEQIDNO.1的黄胸鼠cytB基因序列；DNA序列为SEQIDNO.2的小家鼠cytB基因序列；DNA序列为SEQIDNO.3的褐家鼠cytB基因序列；DNA序列为SEQIDNO.4的黑线姬鼠cytB基因序列。
为了实现上述第二目的本发明采用的技术方案是：上述4中基因序列在使用分子鉴定方法鉴定黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠以及黑线姬鼠中的应用，包括以下步骤：
(1)DNA模板的制备按照DNeasyBlood&Tissue试剂盒使用说明书提取待测标本的肝脏、肌肉、皮毛或骨骼DNA，获取模板DNA；或者采用酚-氯仿抽提法提取待测标本的肝脏、肌肉、皮毛或骨骼DNA，获取模板DNA；
(2)PCR扩增PCR反应扩增体积为25μL，其中10×缓冲液2.5μL，10mmol/LdNTP2μL，25μmol/L的DNA序列为SEQIDNO.5的正向引物和DNA序列为SEQIDNO.6的反向引物各1μL，5U/μLTaq酶0.2μL，模板DNA2μL，ddH2O16.3μL；
PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环，最后再72℃延伸10min；
(3)PCR产物检测取5μLPCR扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳(120V电压，电泳30min)，溴化乙锭或Goldview核酸染料染色，荧光成像系统检测，取电泳效果较好的PCR扩增产物送由生物公司纯化后测序；
(4)序列分析将步骤(3)测得的序列与DNA序列为SEQIDNO.1的黄胸鼠cytB基因序列，DNA序列为SEQIDNO.2的小家鼠cytB基因序列，DNA序列为SEQIDNO.3的褐家鼠cytB基因序列和DNA序列为SEQIDNO.4的黑线姬鼠cytB基因序列，进行对比分析，判断待测标本的种属情况。
本实发明具有以下有益技术效果：本发明获得三峡库区主要鼠类cytB特征序列，为入境截获鼠类种群分子鉴定提供了数据参考，能快速进行遗传分析以确定截获鼠类是否为本地鼠类。还能对种内不同地理种，不同个体进行区别。
本发明提高了鼠类组织DNA提取的效率。新鲜的鼠类肝脏和肌肉组织DNA提取效率较高，试剂盒法和酚-氯仿抽提法都能获得质量较高的DNA。对于腐烂标本，因杂质较多，试剂盒法提取效果较差，DNA量不能满足后续试验要求，采用酚-氯仿抽提法，可以在较大量的腐烂标本中提取足够的DNA用于后续试验，提取成功率大于80％。
附图说明
图1为鼠cytB基因电泳图；
图中：M：markerDL2000，1-6：鼠类cytB目标条带。
具体实施方式
1、标本采集与保存。采用鼠笼法或鼠夹法采集捕获鼠类标本，也可以收集毒饵法灭鼠后的死鼠，自然死鼠及腐败变干的死鼠残体等。将活鼠用氯仿或乙醚熏死，取约1-2克肝脏或肌肉组织冷冻保存。如果为已经腐败的死鼠，取相对完整的皮毛或骨骼冷冻保存，取样时避免污染。同时保存整体死鼠标本以做形态学鉴定。
2、DNA模板的制备。(1)试剂盒提取：取出收集的肝脏或肌肉标本，剪碎置于干净的2mL离心管中，皮毛或骨骼标本剪碎后加石英砂液氮冷冻研磨后置于干净的2mL离心管中，按照DNeasyBlood&Tissue试剂盒(Qiagen)使用说明书提取DNA，获得DNA模板，于-20℃保存备用。(2)酚-氯仿抽提法提取：液氮速冻收集的待测样本组织并研磨，转移至10mL的离心管，加入DNA提取液(Tris-HCl400mM(pH8.0)；NaCl150mM；EDTA60mM；SodiumDodecylSulfate(SDS)10g/L；提取DNA组织与DNA提取液比例约0.1g/2mL)，混匀，冰上放置；加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，剧烈的涡旋5min；8000rpm，4℃，5min离心，取上清液，再加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提；重复加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提步骤，取上清液至新离心管中；加入所取上清液2.5倍体积无水乙醇，轻柔混匀，-20℃沉淀30min；10000rpm，4℃，离心10min收集沉淀；75％乙醇漂洗沉淀，空气干燥后，用ddH2O溶解沉淀，即得模板DNA。
3、引物合成，以下为鼠类cytB通用引物，由华大生物技术有限公司合成。
DNA序列为SEQIDNO.5正向引物：
5’-ACCAATGACATGAAAAATCATCGTT-3’
DNA序列为SEQIDNO.6反向引物：
5’-TCTCCATTTCTGGTTTACAAGAC-3’。
4、PCR扩增
PCR反应扩增体积为25μL，其中10×缓冲液2.5μL，10mmol/LdNTP2μL，25μmol/L的DNA序列为SEQIDNO.5的正向引物和DNA序列为SEQIDNO.6的反向引物各1μL，5U/μLTaq酶0.2μL，模板DNA2μL，ddH2O16.3μL；PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环，最后再72℃延伸10min。
5、PCR产物检测
取5μLPCR扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳(120V电压，电泳30min)。溴化乙锭或Goldview核酸染料染色，荧光成像系统检测，检测结果见附图1。
6、基因序列测定
选取1到2个效果较好的PCR扩增产物送由生物公司纯化后测序(测序所用引物与PCR所用引物相同)，所得基因序列经拼接校正后即为目标鼠cytB序列。
7、序列分析
将目标鼠cytB序列在GenBank中与其他鼠cytB基因序列进行Blast比对确定目标鼠种属情况。将同类目标鼠cytB序列进行比对分析，确定三峡库区主要鼠类cytB特征序列。
以下是三峡库区4种主要鼠类cytB特征序列
黄胸鼠cytB基因序列，SEQIDNO.1：
ATGACAACATCCGAAAATCTCACCCCCTATTCAAAATCATCAACCACTCCTTTATCGACCTCCCCGCCCCATCTAACATCTCATCATGATGAAACTTCGGTTCTCTACTAGGAGTATGCCTCATAGTACAAATCCTCACAGGCTTATTCCTAGCAATACACTACACGTCTGATACCATAACAGCATTTTCATCAGTCACCCACATCTGCCGAGACGTAAACTACGGCTGACTAATCCGATACCTACACGCCAACGGCGCCTCAATATTTTTCATCTGCCTATTCCTCCATGTGGGACGAGGACTATACTATGGATCCTACACTTTCCTAGAAACCTGAAACATTGGGATCATTCTACTATTTGCAGTCATAGCAACTGCATTCATGGGCTATGTACTCCCATGAGGACAAATATCATTCTGAGGAGCTACAGTAATTACAAACCTATTATCAGCTATCCCTTACATTGGAACTACCCTAGTCGAATGAATCTGAGGAGGCTTCTCAGTAGACAAAGCAACCCTAACACGCTTCTTCGCATTCCACTTCATCCTCCCATTCATTATCGCCGCCCTTGCAATTGTACATCTTCTTTTCCTCCACGAAACAGGATCAAATAACCCCACAGGATTAAACTCCGACGCAGACAAAATCCCATTCCATCCATATTATACAATTAAAGACCTCCTAGGTGTATTTATATTACTATTATTCCTAATAACCCTAGTACTATTCTTCCCAGACCTACTAGGAGACCCAGACAATTATACACCCGCTAACCCCCTCAACACCCCACCCCACATCAAACCAGAATGATATTTTCTCTTTGCCTACGCTATTCTACGCTCCATTCCCAACAAACTAGGAGGAGTCATAGCCCTAATCTTATCAATCCTAATCTTAGCCTTCCTACCATTCCTGCATACTTCAAAACAACGCAGCTTAACATTCCGCCCAATCACCCAAATCCTTTACTGAATCCTAGTAGCCAACCTCCTAGTCTTAACATGAATCGGAGGCCAACCAGTAGAACACCCATTTATCATTATTGGCCAACTAGCCTCCATCAGCTACTTTTCAATTATCCTCATTCTCATACCAATCTCTGGAATTGTTGAAGACAAAATGTTAAAATGAAAT
小家鼠cytB基因序列，SEQIDNO.2：
GTAGCTACTGACAACATCCGAAAAACTCACCCCCTATTTAAAATCATTAACCACTCTTTCATCGACCTCCCTGCCCCATCTAACATCTCATCCTGATGAAACTTTGGCTCCCTCCTAGGTCTATGCCTCGTAATTCAAATTCTTACAGGCTTATTCCTAGCCATACACTACACATCAGACACAATAACAGCATTTTCATCAGTTACACACATTTGCCGAGACGTAAACTATGGATGACTAATTCGATATATACACGCTAACGGAGCTTCAATATTTTTTATCTGCTTATTTCTCCATGTAGGACGAGGAATGTACTACGGATCCTATGCATTTATAGAAACATGAAATATCGGAGTAGTCCTATTATTTGCAGTAATAGCTACAGCATTCATAGGCTATGTACTTCCATGAGGACAAATATCCTTCTGAGGGGCAACAGTAATTACAAATCTCCTCTCAGCCATCCCATATATCGGCACTACCCTGGTAGAATGAATTTGAGGAGGATTCTCAGTAGATAAAGCCACTTTAACACGTTTCTTCGCATTCCATTTTATTCTCCCATTCATTATCGCAGCCCTGGTAATCGTCCATCTCCTATTTCTCCACGAAACAGGCTCAAACAACCCAACAGGTTTAAACTCAGACGCCGATAAAATCCCATTTCACCCATACTACACAATTAAAGATATTCTAGGCATTTTCATTATAATTATATTCCTAATAACCCTAGTCCTATTCTTCCCGGACCTACTTGGAGACCCAGATAATTACACACCAGCAAATCCACTTAATACACCACCACATATCAAACCAGAATGATACTTTCTATTTGCATATGCAATCCTACGCTCTATTCCAAACAAACTAAGGAGGAGTCCTAGCTCTAGTCCTATCCATCCTTATCCTAGCCTTACTGCCACTTCTTCACACTTCAAAACAACGAAGCCTAATATTCCGTCCTATTACTCAAATACTCTACTGAATCCTAGTAGCTAACCTTCTCGTCTTACCTGAATCGGCGGACAACCAGTTGAATATCCATTCGGAATCA
褐家鼠cytB基因序列，SEQIDNO.3：
TTCAACATCGGGAATTAATTTCATTTTAACATTTTGTCTTCAACAATTCCAGAGATTGGTATGAGAATGAGGATAATtGAAAAGTAGCTGATGGAGGCTAGTtGGCCAATAAtGATAAATGGGTGTTCTACTGGtTGGCCTCCGATTCATGTTAAGACTAGGAGGTTGGCTACTAGGATTCAGTAAAGGGTTTGGGTGATTGGGCGGAATGTTAAGCTGCGTTGTTTTGAAGTATGCAGGAATGGTAGGAAGGCTAAGATTAGGATTGATAAGATTAGGGCTACGACTCCTCCtTAGTTTGTTGGGAATGGAGCGTAGAATAGCGTAGGCAAAGAGAAAATATCATTCTGGTTTGATGTGGGGTGGGGTGTTGAGGGGGTTAGCGGGTGTATAATTGTCTGGGTCTCCTAGTAGGTCTGGGAAGAATAGTACTAGGGTTATTAGGAATAATAGTAATATAAATATACCTAGGAGGTCTTTAATTGTATAATATGGATGGAATGGGATTTTGTCTGCGTCGGAGTTTAATCCTGTGGGGTTATTTGATCCTGTTTCGTGGAGGAAAAGGAGATGTACAATTGCAAGGGCGGCGATAATGAATGGGAGGATGAAGTGGAATGCGAAGAAGCGTGTTAGGGTTGCTTTGTCTACTGAGAAGCCTCCTCAGATTCATTCGACTAGGGTAGTCCCAATGTAAGGGATAGCTGATAATAGGTTTGTAATTACTGTAGCTCCTCAGAATGATATTTGTCCTCATGGGAGTACATAGCCCATGAATGCAGTTGCTATGACTGCAAATAGTAGAATGATCCCAATGTTTCAGGTTTCTAGGAAAGTGTAGGATCCATAGTATAGTCCTCGTCCCACATGGAGGAATAGGCAGATGAAAAATATTGAGGCGCCGTTGGCGTGTAGGTATCGGATTAGTCAGCCGTAGTTTACGTCTCGGCAGATGTGGGTGACTGATGAAAATGCTGTTATGGTATCAGACGTGTAGTGTATTGCTAGGAATAAGCCTGTGAGGATTTGTACTATGAGGCATACTCCTAGTAGAGAACCGAAGTTTCATCATGATGAGATGTTAGATGGGGCGGGGAGGTCGATAAAGGAGTGGTTGATGATTTTGAATAGGGGGTGAGATTTTCGGATGTTGTCATAGAGTGC
黑线姬鼠cytB基因序列，SEQIDNO.4：
GCTCAACATCGGGCATAGGTTTCATTTTAGTATATTATTTTCAATGATGCCTGAGATTGGCATAAGGATTAGGATAATTGAGAAGTAGCTGATGGAGGCGAGTTGGCCGATGATTACGAATGGATATTCAACTGGTTGTCCGCCGATTCAGGTAAGGACGAGAAGGTTAGCTACTAGGATTCAGTAGAGTATTTGAGTAATAGGACGGAATATTAGGCTTCGTTGTTTTGAAGTGTGAAGAAGTGGCAGTAAGGCTAGGATAAGGATGGATAGGACTAGAGCTAGGACTCCTCCTAGTTTGTTTGGAATAGAGCGTAGGATTGCATATGCAAATAGAAAGTATCATTCTGGTTTGATATGTGGTGGTGTATTAAGTGGATTTGCTGGTGTGTAATTATCTGGGTCTCCAAGTAGGTCCGGGAAGAATAGGACTAGGGTTATTAGGAATATAATTATAATGAAAATGCCTAGAATATCTTTAATTGTGTAGTATGGGTGAAATGGGATTTTATCGGCGTCTGAGTTTAAACCTGTTGGGTTGTTTGAGCCTGTTTCGTGGAGAAATAGGAGATGGACGATTACCAGGGCTGCGATAATGAATGGGAGAATAAAATGGAATGCGAAGAAACGTGTTAAAGTGGCTTTATCTACTGAGAATCCTCCTCAAATTCATTCTACCAGGGTAGTGCCGATATATGGGATGGCTGAGAGGAGATTTGTAATTACTGTTGCCCCTCAGAAGGATATTTGTCCTCATGGAAGTACATAGCCTATGAATGCTGTAGCTATTACTGCAAATAATAGGACTACTCCGATATTTCATGTTTCTATAAATGCATAGGATCCGTAGTACATTCCTCGTCCTACATGGAGAAATAAGCAGATAAAAAATATTGAAGCTCCGTTAGCGTGTATATATCGAATTAGTCATCCATAGTTTACGTCTCGGCAAATGTGTGTAACTGATGAAAATGCTGTTATTGKGTCTGATGTGWAGTGTATGGCTAGGAATAAGCCTGTAAGAATTTGAATTACGAGGCATAGACCTAGGAGGGAGCCAAAGTTTCATCAGGATGAGATGTTAGATGGGGCAGGGAGGTCGATGAAAGAGTGGTTAATGATTTTAAATAGGGGGTGAGTTTTTCGGATGTTGTCATAGTT
在对待测样本采用分子鉴定方法鉴定是否为黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠以及黑线姬鼠时，重复2到4的过程获得PCR扩增产物，送由生物公司纯化后测序；将测得的序列结果与黄胸鼠cytB基因序列，小家鼠cytB基因序列，褐家鼠cytB基因序列和黑线姬鼠cytB基因序列，进行对比分析，序列相似度大于98％的即可判定判断待测标本为以上四种鼠。
验证实验：通过本方法鉴定为黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠以及黑线姬鼠的鼠标本与形态学鉴定结果完全一致。

Claims (6)

1.三峡库区沿江口岸4种鼠类cytB特异序列，其特征在于：包括DNA序列为SEQIDNO.1的黄胸鼠cytB基因序列；DNA序列为SEQIDNO.2的小家鼠cytB基因序列；DNA序列为SEQIDNO.3的褐家鼠cytB基因序列；DNA序列为SEQIDNO.4的黑线姬鼠cytB基因序列。
2.权利要求1所述基因序列在使用分子鉴定方法鉴定黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠以及黑线姬鼠中的应用。
3.根据权利要求2所述鉴定黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠以及黑线姬鼠的分子鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)DNA模板的制备按照DNeasyBlood&Tissue试剂盒使用说明书提取待测标本的肝脏、肌肉、皮毛或骨骼DNA，获取模板DNA；或者采用酚-氯仿抽提法提取待测标本的肝脏、肌肉、皮毛或骨骼DNA，获取模板DNA；
(2)PCR扩增PCR反应扩增体积为25μL，其中10×缓冲液2.5μL，10mmol/LdNTP2μL，25μmol/L的DNA序列为SEQIDNO.5的正向引物和DNA序列为SEQIDNO.6的反向引物各1μL，5U/μLTaq酶0.2μL，模板DNA2μL，ddH2O16.3μL；
PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环，最后再72℃延伸10min；
(3)PCR产物检测取5μLPCR扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳，120V电压，电泳30min，溴化乙锭或Goldview核酸染料染色，荧光成像系统检测，取电泳效果较好的PCR扩增产物送由生物公司纯化后测序；
(4)序列分析将步骤(3)测得的序列与DNA序列为SEQIDNO.1的黄胸鼠cytB基因序列，DNA序列为SEQIDNO.2的小家鼠cytB基因序列，DNA序列为SEQIDNO.3的褐家鼠cytB基因序列和DNA序列为SEQIDNO.4的黑线姬鼠cytB基因序列，进行对比分析，判断待测标本的种属情况。
4.根据权利要求3所述鉴定黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠以及黑线姬鼠的分子鉴定方法，其特征在于：所述酚-氯仿抽提法提取待测标本的肝脏、肌肉、皮毛或骨骼DNA的具体过程为：液氮速冻肝脏、肌肉、皮毛或骨骼样本并研磨，转移至10mL的离心管，加入DNA提取液，混匀，冰上放置；加入等体积的酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1，涡旋5min；8000rpm，4℃，5min离心，取上清液，再加入等体积的氯仿:异戊醇＝24:1抽提；重复加入等体积的氯仿:异戊醇＝24:1抽提，取上清液至新离心管中；加入所取上清液2.5倍体积无水乙醇，轻柔混匀，-20℃沉淀30min；10000rpm，4℃，离心10min收集沉淀；75％乙醇漂洗沉淀，空气干燥后，用ddH2O溶解沉淀，即得模板DNA。
5.根据权利要求4所述鉴定黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠以及黑线姬鼠的分子鉴定方法，其特征在于：所述DNA提取液包括Tris-HCl400mMpH8.0；NaCl150mM；EDTA60mM；SodiumDodecylSulfate10g/L。
6.根据权利要求3所述鉴定黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠以及黑线姬鼠的分子鉴定方法，其特征在于：步骤(3)所述测序所用引物为DNA序列为SEQIDNO.5的正向引物和DNA序列为SEQIDNO.6的反向引物。
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