CN105296648A

CN105296648A - 狐源性成分鉴定及动物制品中狐、兔、狗成分的多重pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN105296648A
Application number: CN201510815231.2A
Authority: CN
Inventors: 刘榜; 王文君; 向胜男; 赵金艳; 甄月然; 张庆德
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2015-11-20
Filing date: 2015-11-20
Publication date: 2016-02-03
Anticipated expiration: 2035-11-20
Also published as: CN105296648B

Abstract

本发明提供了一种狐源性成分鉴定及动物制品中狐、兔、狗成分的多重PCR检测试剂盒，属于动物源性成分分子检测技术领域。本发明试剂盒包括狐、兔、狗各物种特异性引物，反应试剂以及阳性和空白对照。狐狸特异性引物是能特异性扩增SEQ？ID？No.1所示的核苷酸序列的引物对。采用本发明的引物扩增样品DNA，对PCR扩增产物进行分析，可判定样品中是否含有狐狸种源性成分；同时，能鉴别是否掺有兔源或狗源成分，为毛皮制品的分子鉴定提供手段；另外，通过多重PCR检测，可一次性鉴别狐源、兔源和狗源成分。建立肉类掺假、毛皮和饲料成分鉴别的有效方法。该方法和试剂盒具有简便、快速、全面、特异性强的特点，且成本较低，适用性广。

Description

狐源性成分鉴定及动物制品中狐、兔、狗成分的多重PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及动物分子生物学领域，具体涉及狐源性成分鉴定及动物制品中狐、兔、狗成分的多重PCR检测试剂盒。

背景技术

我国是毛皮生产和消费大国，毛皮通常来自于狐狸、水貂、羊、兔、狗等，比较名贵的毛皮来源是狐狸、海獭、貂、海狸鼠、海豹等。随着经济的发展和社会的进步，皮草虽已不再是上流社会的专属品，但其价格昂贵，对于大众消费者来说仍属奢侈品。一些不法经营者为牟取暴利，便用人造毛皮代替天然动物毛皮，獭兔毛皮、貉子毛皮等也成为了貂和狐狸毛皮的替代品。

狐狸在动物分类学上属于哺乳纲、食肉目、犬科、狐属，主要经济价值在于皮毛，保暖性好，华贵美观，更是高贵、档次和时尚的象征，深受国内外消费者的喜爱。狐皮富有光泽，长而柔软，板质柔韧，毛绒丰厚，属高级毛皮，分红狐皮、蓝狐皮、白狐皮、银狐皮几种，是名贵的裘皮之一，其制品被誉为世界三大裘皮支柱之一，也是我国出口创汇佳品，经济效益十分可观。一些不法商贩为获得更多利润，便在狐狸毛皮中掺入其他动物毛皮，甚至直接取而代之。兔子和狗的毛皮均可用于制作毛皮服装，但价格较狐狸毛皮低，因此兔子或狗的毛皮冒充狐狸毛皮的现象常有发生。另外，也有报道用狐狸毛皮冒充更加高档价高的貂鼠毛皮的现象。曾经的国际知名时装品牌康金勇(KANGJINYONG)于2012年被爆造假，以狐狸毛皮冒充貂鼠毛皮，或在狐狸毛皮中掺杂皮革夹条。此外，也有许多不法商贩将狐狸胴体、内脏或骨等经过加工，制作或掺入到食用肉制品和饲料中，欺诈消费者，破坏市场秩序。

采用传统的形态学方法鉴别毛皮、肉类或饲料成分来源，人为误差较大，容易误判，准确率较低；而国内尚未出现一种简便快捷的方法，能准确区分狐狸制品与其他动物性制品。因此，如何有效、准确地判别出动物性制品是否属于狐狸制品，并建立一种简单易行的检测方法十分必要。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可用于狐狸源性成分特异性检测的引物；

本发明的第二个目的在于提供用于狐狸源性成分检测的检测试剂盒；

本发明的目的还在于提供狐狸源性成分鉴定及动物性制品中兔源、狗源成分的鉴定方法。

为实现上述目的，本发明从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面进行狐狸基因组特异序列基因的筛选，通过对非狐狸物种及不同的狐狸种属中的检测筛选，选取狐狸中特异的基因片段作为检测分子并设计特异性引物，利用PCR电泳技术对其种间特异性、种内保守性和灵敏度等结果进行检测。经过大量分析和实验工作，最终获得可供检测使用的特异DNA分子，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示。

基于此，本发明首先提供一种狐狸特异性引物，其特异性扩增SEQIDNo.1所示的核苷酸序列或该序列的特异性片段。

优选地，引物长度为18～27bp。引物的设计需要考虑是否容易发生错配、扩增片段长度、反应温度等多方面。

优选地，该引物序列如下：

VULPES-F：5′-ACAGGGGAGAAAACGCTGTTC-3′

VULPES-R：5′-GGCCTCCCCGAGATGAATC-3′；

或该引物向5’、3’端延伸或修饰得到的仍能特异性扩增SEQIDNo.1所示序列(长度408bp)的引物。

进一步，本发明提供含有上述特异性引物的检测试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括下述兔和狗特异性引物：

(1)对狗基因组DNA进行扩增生成狗特异性扩增片段(长度317bp)的引物对Ⅰ：

CANIS-F：5’-GCGGCAAAGTTAACGGCAGT-3’

CANIS-R：5’-GGATGGGAAGCAAACTCCGA-3’；

(2)对兔基因组DNA进行扩增生成兔特异性扩增片段(长度209bp)的引物对Ⅱ：

OCU-F：5′-TAGCAGTAGGGATGACAGGGTTT-3’

OCU-R：5′-GCCTTAGAGTAGGGTCTTTTTGG-3’。

优选地，所述试剂盒还包括下述试剂中的一种或多种：Taq酶、dNTPs、MgCl₂、PCR缓冲液、阳性对照DNA模板、双蒸水；或者还包括下述试剂中的一种或多种：TaqDNAMasterMix、阳性对照DNA模板、双蒸水。

所述阳性对照DNA模板为犬科狐属的狐狸DNA模板。

优选地，所述阳性对照DNA模板还包括兔、狗DNA模板中的一种或多种。

进一步，本发明提供上述的狐狸特异性引物或检测试剂盒在狐狸源性成分鉴定或在肉类、饲料或皮毛制品分子鉴定中的应用。可对动物制品中狐、兔、狗成分进行多重PCR检测。

本发明还提供狐源性成分鉴定及其制品中掺入兔、狗成分的检测方法，其步骤如下所述：

1)提取样品基因组DNA；

2)PCR扩增：

A)用上所述的引物进行PCR扩增，并以狐狸DNA模板为阳性对照，以双蒸水为空白对照；

B)用所述的试剂盒或用所述的狐狸特异性、兔和/或狗特异性引物分别进行PCR扩增，以狐狸DNA模板为阳性对照，同时兔、狗DNA模板中的一种或多种为阳性对照，以双蒸水为空白对照；

C)用所述的试剂盒或用所述的特异性引物，进行多重PCR扩增，以狐狸、兔、狗等比例混合的DNA模板为阳性对照，以双蒸水为空白对照；

3)对PCR扩增产物进行检测和结果判定。

具体地，一种狐狸源性成分及动物制品中狐、兔、狗成分的普通PCR检测方法，其步骤如下所述：

1)提取样品基因组DNA；

2)用上述的狐狸特异性引物进行PCR扩增，并以犬科狐属的狐狸DNA模板为阳性对照，以双蒸水为空白对照；

3)对PCR扩增产物进行电泳检测和结果判定。

优选地，其中步骤2)普通PCR扩增的反应试剂如表1：

表1本发明普通PCR扩增的反应体系

步骤2)的PCR反应程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸15s，30次循环；4℃降温2min；

结果判定方法是：当PCR反应产物与阳性对照扩增产物相符，且空白对照无扩增产物时，判定样品中检测出狐狸源性成分；当PCR反应无扩增产物或产物与阳性对照扩增产物不符，且空白对照无扩增产物时，判定样品中未检测出狐狸成分；如果阳性样品未检测预期片段，说明试剂失效或操作失误；若空白对照与阳性样品均检出，说明试剂污染或操作失误。

此外，以兔或狗基因组DNA为阳性对照，利用上述引物或试剂盒还可以进一步判断其是否含有兔或狗源性成分。

此外，本发明还提供动物制品中狐、狗、兔成分的多重PCR检测方法，将上述的狐狸特异性引物SEQIDNo.2&3和引物对Ⅰ～Ⅱ按2:2:1的比例混合，可进行多重PCR扩增，以狐狸、狗、兔等比例混合DNA模板为阳性对照，以双蒸水为空白对照；利用上述引物或试剂盒还可以进一步进行狐狸、狗、兔的快速检测，方便混合样品的检测。

优选地，其中多重PCR扩增的反应试剂如表2：

表2本发明多重PCR扩增的反应体系

本发明中检测结果可用琼脂糖凝胶电泳呈现，也可用测序或其他有效方法检测；提取样品DNA的方法可用苯酚-氯仿提取法，也可使用公认的、具有相同效力的其他提取方法。

本发明提供了有效的、精准的、可靠的狐狸源性成分分子鉴定方法，所组装的试剂盒能快速鉴定样品是否含狐狸种源性成分；同时，能鉴别是否掺有兔源或狗源成分，为毛皮制品的分子鉴定提供手段；另外，通过多重PCR检测，可一次性鉴别狐源、兔源和狗源成分，建立肉类掺假、毛皮和饲料成分鉴别的有效方法。基于此，本发明试剂盒及检测方法具有简便、快速、全面、特异性强的特点，且成本较低，适用性广。

附图说明

图1是SEQIDNo.1所示的特异序列在狐狸中具有物种特异性的检测结果。以犬科狐属的银狐、蓝狐，犬科非狐属哺乳动物(狗、貉子)，非犬科哺乳动物(普通牛、水牛、绵羊、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、猪、马、驴、兔、水貂)以及非哺乳动物(鸡、鸭、鹅)的基因组DNA为模板，扩增所述的特异片段，所有测试样品中仅在狐狸中得到扩增产物，非狐狸均无扩增产物。结果表明所扩增片段在狐狸中具有特异性。泳道中编号说明如下：M：为DL2000PlusDNAMarker；1-3：空白对照；4-6：狐；7-9：小鼠；10-12：大鼠；13-15：仓鼠；16-18：豚鼠；19-21：普通牛；22-24：水牛；25-27：绵羊；28-30：山羊；31-33：猪；34-36：马；37-39：驴；40-42：鸡；43-45：鸭；46-48：鹅；49-51：兔；52-54：狗；55-57：水貂；58-60：貉子。

图2是SEQIDNo.1所示的特异序列在狐不同DNA模板浓度中的灵敏度检测结果。分别以1ng/μL、5ng/μL、10ng/μL、25ng/μL、50ng/μL、100ng/μL的狐狸DNA为模板，扩增所述的特异片段，5ng/μL的模板浓度即有扩增，表明特异性引物所扩增片段具有较好的灵敏性。泳道中编号说明如下：M：为DL2000PlusDNAMarker；1-3：空白对照；4-6：1ng/μL的模板浓度；7-9：5ng/μL的模板浓度；10-12：10ng/μL的模板浓度；13-15：25ng/μL的模板浓度；16-18：50ng/μL的模板浓度；19-21：100ng/μL的模板浓度。

图3是SEQIDNo.1所示的特异性序列在狐狸不同种属的多个体中的保守性检测结果。以银狐、蓝狐的DNA为模板，扩增所述的特异片段，所有测试样品即所有狐属不同个体都得到特异性扩增，且一致性良好，表明所扩增片段在狐属中具有保守性。泳道中编号说明如下：M：为BM2000DNAMarker；E：空白对照；N：多物种混合的阴性对照(无狐狸DNA)；1-5：蓝狐基因组DNA；6-44：银狐基因组DNA。

图4是狐、狗、兔引物组特异性检测结果。分别用狐、狗、兔的特异性引物在该3个物种中进行扩增，结果各引物只在本物种中有效扩增，表明各特异性引物的特异性良好。M：为BM2000DNAMarker；E：空白对照；1：狐的特异性引物在狐DNA中的扩增结果；2：狐的特异性引物在狗DNA中的扩增结果；3：狐的特异性引物在兔DNA中的扩增结果；4：狗的特异性引物在狗DNA中的扩增结果；5：狗的特异性引物在狐DNA中的扩增结果；6：兔的特异性引物在兔DNA中的扩增结果；7：兔的特异性引物在狐DNA中的扩增结果。

图5是狐、狗、兔引物组多重PCR检测结果。取狐狸、狗、兔以及三者等比例混合的基因组DNA，用狐、狗、兔混合引物(2:2:1)进行检验，结果表明各引物特异性良好，多重PCR检测可有效区分各物种条带。泳道中编号说明如下：M：为BM2000DNAMarker；E：空白对照；H：狐阳性对照；T：兔阳性对照；G：狗阳性对照；X：为狐、兔、狗DNA等比例混合样三重PCR结果。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的修改或润色均属于本发明的范围。

实施例1样品中狐源性成分特异性检测

1.试样的制备与保存

1.1取样

采集狐狸样品1g，于-20℃下保存备用。

1.2DNA模板制备

DNA模板制备采用常用的苯酚-氯仿粗提法(萨姆布鲁克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M].第2版.金冬雁,黎孟枫.北京:科学出版社,1999.465-467)或者公认的、具有相同效力的其他提取方法，这些方法都是报道的常用方法。

2.引物设计

本实施例的引物序列如表3和序列表SEQIDNO：2和3所示。

表3本发明设计的PCR扩增引物

引物名称	引物序列
		VULPES-F	5′-ACAGGGGAGAAAACGCTGTTC-3′
VULPES-R	5′-GGCCTCCCCGAGATGAATC-3′

预期扩增片段大小为408bp，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。

实验表明，该引物特异性强，在狐狸中均能有效扩增，而在其他非狐属物种中都无目的片段扩增；且引物的灵敏度较高，在模板DNA浓度为5ng/μL时即可扩增。以上述引物分别向3′、5′延伸一个碱基和两个碱基或修饰形成的引物对进行实验，实验表明仍能进行特异性扩增，从经济型和综合效果来看以表3中的引物最佳。

3.PCR检测

3.1试样PCR反应

3.1.1在PCR反应管中依次加入反应试剂(如表1所示)，混匀，再加25μL石蜡油(有热盖设备的PCR仪可不加)。

3.1.2将PCR管在离心机上500g～3000g离心10s，然后取出PCR管，放入PCR仪中。

3.1.3进行PCR反应。程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸15s，30次循环；4℃降温2min。

3.1.4反应结束后取出PCR管，对PCR反应产物进行电泳检测。

3.2对照PCR反应

3.2.1在试样PCR反应的同时，设置阴性对照、阳性对照、空白对照。各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与3.1相同，且阴性、阳性对照DNA模板浓度也应达到试样DNA模板浓度要求。

3.2.2以犬科非狐属哺乳动物(狗、貉子)，非犬科哺乳动物(普通牛、水牛、绵羊、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、猪、马、驴、兔、水貂)以及非哺乳动物(鸡、鸭、鹅)的基因组DNA作为PCR反应体系的阴性对照模板。

3.2.3以犬科狐属的狐狸基因组DNA作为PCR反应体系的阳性对照模板。

3.2.4以双蒸水作为PCR反应体系的空白对照模板。

4.PCR扩增产物的检测及结果判定

按30g/L的质量浓度称量琼脂糖，加入1×TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100mL琼脂糖溶液中加入5μLEB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，置于1×TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取5μLPCR产物与1μL加样缓冲液(称取250.0mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12h；称取250.0mg二甲苯腈蓝FF，加10mL水溶解；称取50.0g蔗糖，加30mL水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至100mL，在4℃下保存)混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2V/cm～5V/cm条件下电泳15～30min后检测。

电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准判断扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。

5结果分析与表述

5.1对照检测结果分析

如图1所示，阳性对照的PCR反应中，狐狸SEQIDNo.1所示的特异性序列得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而阴性对照及空白对照中除引物二聚体外没有任何扩增片段，表明PCR反应体系工作正常。

5.2样品检测结果分析和表述

5.2.1若狐狸SEQIDNo.1所示的特异性序列得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明样品中检测出狐狸所述的特异性序列，表述为“样品中检测出狐狸源性成分”。

5.2.2若狐狸SEQIDNo.1所示的特异性序列未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明样品中未检测出狐狸所述的特异性序列，表述为“样品中未检测出狐狸源性成分”。

实施例2灵敏度试验

分别以1ng/μL、5ng/μL、10ng/μL、25ng/μL、50ng/μL、100ng/μL的狐狸DNA为模板，按照实施例1的条件，扩增SEQIDNO.1核苷酸特异片段。结果如图2所示，5ng/μL的模板浓度即有扩增，表明特异性引物所扩增片段具有较好的灵敏性。

实施例3检测狐狸源性制品中掺入非狐狸源性成分的引物组

本发明是对于动物制品来源的检测，通过各物种相应引物PCR扩增的情况，判断是否为或含有某物种的DNA，进而判定是否有某物种的动物源性成分掺假。

1样品中DNA的提取

各物种DNA的提取及保存方法同前实施例1中所述。

2引物的设计和筛选

为了寻找各物种特异的检测序列，我们从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面进行特异序列的筛选，通过与非本物种及本物种不同种属的核酸序列比对，筛选种内较保守、物种间特异的核苷酸序列作为检测分子。通过大量分析工作，选取其中结果较好的序列设计各自物种引物序列，并通过实验进一步筛选特异性较好的引物用于后续试验。

一组狐、狗、兔的PCR鉴定用引物体系，由下列引物对组成：

(1)对狐基因组DNA进行扩增生成狐特异性扩增片段(408bp)的引物对：

VULPES-F：5′-ACAGGGGAGAAAACGCTGTTC-3′

VULPES-R：5′-GGCCTCCCCGAGATGAATC-3′；

(2)对狗基因组DNA进行扩增生成狗特异性扩增片段(317bp)的引物对：

CANIS-F：5’-GCGGCAAAGTTAACGGCAGT-3’

CANIS-R：5’-GGATGGGAAGCAAACTCCGA-3’；

(3)对兔基因组DNA进行扩增生成兔特异性扩增片段(209bp)的引物对：

OCU-F：5′-TAGCAGTAGGGATGACAGGGTTT-3’

OCU-R：5′-GCCTTAGAGTAGGGTCTTTTTGG-3’；

3PCR检测

3.1为了确保所选用引物可准确、有效地鉴定出狐属样品及其中是否掺入狗或兔的样品成分，我们对各引物进行了特异性检测，反应体系如上述表1。

3.2进行PCR反应的程序为：

3.3在试样PCR反应的同时，设置空白对照、阴性对照、阳性对照。

3.4反应结束后取出PCR管，对PCR反应产物进行电泳检测：该电泳过程及条件同实施例1中的电泳。

所得凝胶成像结果如图4所示。分别用狐、兔、狗特异性引物以该3个物种的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，很好的验证了各物种特异性引物的有效性和特异性。由图4可以看出，兔、狗特异性引物均能很好的扩增出各自对应物种的特异性大小的条带，而在狐狸中均未扩增出目的条带。

实施例4多重PCR

为了方便快速地检测，我们在保证各引物有效扩增且特异性良好的情况下，同时考虑各引物的扩增效率，将狐、狗、兔的引物量按照2:2:1的比例混合后备用：

4.1反应体系同表2。

4.2DNA样品：取浓度为25ng/μL的狐、兔、狗基因组DNA等比例混合作为反应所需模板。

4.3反应程序及电泳检测同实施例1。

所得凝胶成像结果如图5所示。实验结果表明上述各引物特异性良好，可方便、有效地将狐狸与兔、狗区分开。

实施例5试剂盒的组装

该试剂盒的组成包括：

引物(各物种引物对SEQIDNo.2&3和Ⅰ～II各一份)；

2×TaqDNAMasterMix；

阳性对照DNA模板(狐狸、兔、狗DNA模板各一份)；

双蒸水。

本试剂盒-20℃储存12个月不影响使用效果。

试剂盒的应用方法：

1.依据需要，按照上述各实施例1或实施例3或实施例4的PCR反应体系加样。

其中，2×TaqDNAMasterMix(购自北京艾德莱生物科技有限公司)是将PCR反应所需的Taq酶、dNTP混合物、MgCl₂以及反应缓冲液预先配置成2倍浓度的混合物。

2.依据实施例1或实施例3或实施例4的PCR扩增条件上样。

3.反应结束后取5μLPCR扩增产物，3.0％的琼脂糖凝胶电泳(技术参数：2V/cm～5V/cm，电泳15min～30min)，用溴化乙锭染色，凝胶成像系统检测结果。每个反应需设置空白对照和阳性对照，反应体系及扩增条件同受测样品。

Claims

1.狐狸特异性引物，其特异性扩增SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的特异性引物，其特征在于，该引物序列如下：

VULPES-F：5'-ACAGGGGAGAAAACGCTGTTC-3'

VULPES-R：5'-GGCCTCCCCGAGATGAATC-3'；

或该引物向5’、3’端延伸或修饰得到的仍能特异性扩增SEQIDNo.1所示序列的引物。

3.含有权利要求1或2所述特异性引物的检测试剂盒。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括下述兔和/或狗特异性引物：

(1)对狗基因组DNA进行扩增生成狗特异性扩增片段的引物对：

CANIS-F：5’-GCGGCAAAGTTAACGGCAGT-3’

CANIS-R：5’-GGATGGGAAGCAAACTCCGA-3’；

(2)对兔基因组DNA进行扩增生成兔特异性扩增片段的引物对：

OCU-F：5'-TAGCAGTAGGGATGACAGGGTTT-3’

OCU-R：5'-GCCTTAGAGTAGGGTCTTTTTGG-3’。

5.根据权利要求3或4所述的检测试剂盒，其特征在于，其还包括下述试剂中的一种或多种：Taq酶、dNTPs、MgCl₂、PCR缓冲液、阳性对照DNA模板、双蒸水；或者还包括下述试剂中的一种或多种：TaqDNAMasterMix、阳性对照DNA模板、双蒸水。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照DNA模板为犬科狐属的蓝狐或银狐DNA模板，所述空白对照为双蒸水。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照DNA模板还包括兔、狗基因组DNA模板中的一种或多种。

8.权利要求1或2所述的狐狸特异性引物或权利要求3～7任一项所述的检测试剂盒在狐源性成分或在肉类、饲料或皮毛制品分子鉴定中的应用。

9.狐源性成分鉴定及其制品中掺入兔、狗成分的检测方法，其步骤如下所述：

1)提取样品基因组DNA；

2)PCR扩增：

A)用权利要求1或2所述的引物进行PCR扩增，并以狐狸DNA模板为阳性对照，以双蒸水为空白对照；

B)用权利要求4-7任一项所述的试剂盒，用所述的狐狸特异性、兔和/或狗特异性引物分别进行PCR扩增，以狐狸DNA模板为阳性对照，同时兔、狗DNA模板中的一种或多种为阳性对照，以双蒸水为空白对照；

C)用权利要求4-7任一项所述的试剂盒，进行多重PCR扩增，以狐狸、兔、狗等比例混合的DNA模板为阳性对照，以双蒸水为空白对照；

3)对PCR扩增产物进行检测和结果判定。