CN103361422A - 一种鉴别掺假肉及其制品的多重pcr快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种鉴别掺假肉及其制品的多重PCR快速检测方法。传统的检测方法检测时间长，耗时、耗力。本发明根据狐狸肉、老鼠肉、猪肉、鸡肉、鸭肉作为特征靶基因分别设计5对特异性引物：F1/R1、F2/R1、F3/R1、F4/R2、F4/R2。取样加水均质，制成组织匀浆样品；组织匀浆样品中提取DNA；PCR扩增，将扩增产物与6×LoadingBuffer混合，用2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。本发明根据五种肉类基因的同源性设计了6条引物，与传统方法比较，引物数量大为减少，从而减少了假阳性的出现；同时确认了该方法可以检测出0.1ng的DNA含量。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种快速检测掺假肉及其制品的多重PCR检测方法，具体涉及一种一次性快速检测肉及其制品中是否掺杂狐狸肉、老鼠肉、鸡肉、鸭肉、猪肉的快速检测方法。
背景技术
近几年我国肉及其制品的消费量不断上升，涮羊肉、羊肉锅仔、羊肉串、牛肉干等都深受消费者的喜爱，而不法商贩利用检测手段的不足将廉价的鸡肉、鸭肉、猪肉甚至狐狸肉、老鼠肉等掺入羊肉及牛肉中销售，从中获取暴利，因此掺假肉及其制品的检测是一项重要工作，其关系到消费者的健康及生命安全。然而传统的检测方法检测时间长，耗时、耗力，难以适应大批量肉及其制品快速检测的需要，因此亟需建立一种操作简便、快速准确、经济适用、灵敏度好、特异性高的现代化检测方法。
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，其不同于传统PCR技术只能检测单一靶基因，它是在同一PCR反应体系里加入多对特异性引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，因此可用于多种微生物的同时快速检测或鉴定，具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点。目前该技术主要用于多种病原微生物的快速检测中，而对肉及其制品中掺杂狐狸肉、老鼠肉、鸡肉、鸭肉、猪肉的多重PCR快速检测方法未有报道和公开。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供了一种鉴别掺假肉及其制品的多重PCR快速检测方法，特别是一种用于快速检测肉及其制品中掺杂狐狸肉、老鼠肉、鸡肉、鸭肉、猪肉的多重PCR快速检测方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
为实现上述目的，本发明首先根据狐狸肉、老鼠肉、猪肉、鸡肉、鸭肉作为特征靶基因分别设计5对特异性引物：F1/R1、F2/R1、F3/R1、F4/R2、F4/R2 ，即6条特异性引物：F1、F2、F3、F4、R1、R2。狐狸特异性引物F1/R1的长度为205 bp，老鼠特异性引物F2/R1的长度为283 bp，猪特异性引物F3/R1的长度为671 bp，鸡特异性引物F4/R2的长度为563 bp，鸭特异性引物F4/R2的长度为405 bp。各特异性引物具有高度中内保守、种间特异性等优点。扩增后片段长度大小各异，可通过电泳进行分开辨别。
上述所述的狐狸肉、老鼠肉、猪肉、鸡肉、鸭肉特异性引物如表1所示。
表1 PCR扩增狐狸肉、老鼠肉、猪肉、鸡肉、鸭肉特异性引物
本发明提供了一种鉴别掺假肉及其制品的多重PCR快速检测方法包括以下步骤：
步骤(1).样品前处理
将肉类及其制品取样，加入10倍肉类及其制品体积的灭菌蒸馏水中，用组织匀浆机均质1 min，制成组织匀浆样品；
步骤(2).样品DNA提取
将50 mg组织匀浆样品、200 μl pH值为8.0的 TE缓冲液涡旋混匀，加入400 μl裂解液，混匀，然后加入600 μl的第一混合溶剂剧烈振荡，12000g离心10 min，取上清液加入与该上清液等体积的第二混合溶剂，剧烈振荡，12000 g离心10min，取上清液加入与该上清液等体积氯仿，剧烈振荡，12000g离心10 min，取上清液加入与0.8倍该上清液体积的异丙醇，12000g离心l0 min，得到沉淀物，用70﹪乙醇清洗沉淀物1次，在常温或50℃下，20min晾干，然后加入80 μl pH值为8.0的 TE缓冲液，使沉淀物溶解于TE缓冲液，得到DNA提取物。该DNA提取物即为模板DNA。将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度。
所述的TE缓冲液为1 ml 浓度为1 M 、pH值为 8.0的Tris-Cl，0.2 ml浓度为 0.5 M、pH值为 8.0的EDTA，定容至100 ml溶液。
所述的裂解液为Tris-HCl、乙二胺四乙酸EDTA、NaCl、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠SDS组成的混合液，其中Tris-HCl的浓度为50 mM、 pH值为 8.0，乙二胺四乙酸EDTA的浓度为25 mM，NaCl的浓度为100 mM，蛋白酶K的浓度为20 μg/μL，十二烷基硫酸钠SDS的质量分数为10﹪。
所述的第一混合溶剂为酚、氯仿、异戊醇的混合液，其中酚、氯仿与异戊醇的体积比为25：24：1。
所述的第二混合溶剂为氯仿、异戊醇的混合液，其中氯仿与异戊醇的体积比为24：1。
步骤(3).多重PCR扩增
将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增,得到扩增产物。
所述的PCR扩增反应体系为50 μl由5.0 μl的10×PCR Buffer、0.5 μl浓度为2.5 U/μl 的Taq DNA 聚合酶、4.0 μl浓度为2.5 mmol/L的 dNTPs、6.5 μl加人混合引物、2.0 μl模板DNA和余量的灭菌蒸馏水组成。
所述的多重PCR扩增反应的条件是94℃预变性5min；94℃ 变性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。
所述的加人混合引物为5对特异性引物的混合引物，其中5对特异性引物的浓度比为F1:F2:F3:F4:R1:R2=1:1:1:2:3:2。
步骤(4).扩增产物电泳检测
PCR扩增反应结束后，将5μl 扩增产物与1μl 6×Loading Buffer混合，用2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。
本发明的有益效果：本发明进行了反应的特异性验证和灵敏度检验，证明了引物设计的种间特异性和种内保守性，确保该反应能特异性检测出掺假肉类品种，而避免假阳性的出现；根据五种肉类基因的同源性设计了6条引物（五对），而可以扩增5种肉源基因，与传统方法比较，引物数量大为减少（传统方法需要10条引物），从而减少了假阳性的出现；同时确认了该方法可以检测出0.1ng的DNA含量。
附图说明
图1为已知狐狸、老鼠、鸭、鸡、猪的标准多重PCR图谱，其中M：Marker; 泳道1：多重PCR扩增条带；泳道2：阴性对照；
图2为实施例1～4的多重PCR图谱，其中M：Marker；泳道1～9：实施例1～9的PCR扩增条带；泳道10：阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的分析。
如图1所示，M表示Marker，泳道1为多重PCR扩增条带，泳道2为阴性对照。其中从泳道1可知，狐狸特异性引物F1/R1的长度为205 bp，老鼠特异性引物F2/R1的长度为283 bp，猪特异性引物F3/R1的长度为671 bp，鸡特异性引物F4/R2的长度为563 bp，鸭特异性引物F4/R2的长度为405 bp。
实施例1
步骤(1).样品前处理
取可疑羊肉15g，加入10倍羊肉体积的灭菌蒸馏水中，用组织匀浆机均质1 min，制成组织匀浆样品；
步骤(2).样品DNA提取
将50 mg组织匀浆样品、200 μl pH值为8.0的 TE缓冲液涡旋混匀，加入400 μl裂解液，混匀，然后加入600 μl的第一混合溶剂剧烈振荡，12000 g离心10 min，取上清液中加入与该上清液等体积的第二混合溶剂，剧烈振荡，12000 g离心10min，取上清液加入与该上清液等体积的氯仿，剧烈振荡，12000 g离心10 min；取上清液加入0.8倍该上清液体积的异丙醇，12000g离心l0 min，得到沉淀物，用70﹪乙醇清洗沉淀物1次，在常温或50℃下，20min晾干，然后加入80 μl pH值为8.0的 TE缓冲液，使沉淀物溶解于TE缓冲液，得到DNA提取物。该DNA提取物即为模板DNA。将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度。
步骤(3).多重PCR扩增
将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增,得到扩增产物。
PCR扩增反应体系为50 μl由5.0 μl的10×PCR Buffer、0.5 μl浓度为2.5 U/μl 的Taq DNA 聚合酶、4.0 μl浓度为2.5 mmol/L的 dNTPs、6.5 μl加人混合引物、2.0 μl模板DNA和余量的灭菌蒸馏水组成。
多重PCR扩增反应的条件是94℃预变性5min；94℃ 变性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。
步骤(4).扩增产物电泳检测
反应结束后，取5 μl 扩增产物与1 μl 6×Loading Buffer混合，2﹪琼脂糖凝胶电泳检测。如图2所示，泳道1为实施例1制备得到的扩增产物电泳结果，在563 bp处出现条带说明可疑羊肉中掺有鸡肉。
实施例2
步骤(1).样品前处理
取样可疑牛肉干15g，加入10倍牛肉干体积的灭菌蒸馏水中，用组织匀浆机均质1 min，制成组织匀浆样品；
步骤(2).样品DNA提取
将50 mg组织匀浆样品、200 μl pH值为8.0的 TE缓冲液涡旋混匀，加入400 μl裂解液，混匀，然后加入600 μl的第一混合溶剂剧烈振荡，12000 g离心10 min，取上清液中加入与该上清液等体积的第二混合溶剂，剧烈振荡，12000 g离心10min，取上清液加入与该上清液等体积氯仿，剧烈振荡，12000 g离心10 min；取上清液加入0.8倍该上清液体积的异丙醇，12000 g离心l0 min，得到沉淀物，用70﹪乙醇清洗沉淀物1次，在常温或50℃下，20min晾干，然后加入80 μl pH值为8.0的 TE缓冲液，使沉淀物溶解于TE缓冲液，得到DNA提取物。该DNA提取物即为模板DNA。将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度。
步骤(3).多重PCR扩增
将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增,得到扩增产物。
PCR扩增反应体系为50 μl由5.0 μl的10×PCR Buffer、0.5 μl浓度为2.5 U/μl 的Taq DNA 聚合酶、4.0 μl浓度为2.5 mmol/L的 dNTPs、6.5 μl加人混合引物、2.0 μl模板DNA和余量的灭菌蒸馏水组成。
多重PCR扩增反应的条件是94℃预变性5min；94℃ 变性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。
步骤(4).扩增产物电泳检测
反应结束后，取5 μl 扩增产物与1 μl 6×Loading Buffer混合，2﹪琼脂糖凝胶电泳检测。如图2所示，泳道2为实施例2制备得到的扩增产物电泳结果，在283 bp处出现条带说明可疑羊肉中掺有老鼠肉。
实施例3
步骤(1).样品前处理
取样可疑羊肉卷15g，加入10倍羊肉卷体积的灭菌蒸馏水中，用组织匀浆机均质1 min，制成组织匀浆样品；
步骤(2).样品DNA提取
将50 mg组织匀浆样品、200 μl pH值为8.0的 TE缓冲液涡旋混匀，加入400 μl裂解液，混匀，然后加入600 μl的第一混合溶剂剧烈振荡，12000 g离心10 min，取上清液中加入与该上清液等体积的第二混合溶剂，剧烈振荡，12000 g离心10min，取上清液加入与该上清液等体积氯仿，剧烈振荡，12000 g离心10 min；取上清液加入0.8倍该上清液体积的异丙醇，12000 g离心l0 min，得到沉淀物，用70﹪乙醇清洗沉淀物1次，在常温或50℃下，20min晾干，然后加入80 μl pH值为8.0的 TE缓冲液，使沉淀物溶解于TE缓冲液，得到DNA提取物。该DNA提取物即为模板DNA。将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度。
步骤(3).多重PCR扩增
将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增,得到扩增产物。
PCR扩增反应体系为50 μl由5.0 μl的10×PCR Buffer、0.5 μl浓度为2.5 U/μl 的Taq DNA 聚合酶、4.0 μl浓度为2.5 mmol/L的 dNTPs、6.5 μl加人混合引物、2.0 μl模板DNA和余量的灭菌蒸馏水组成。
多重PCR扩增反应的条件是94℃预变性5min；94℃ 变性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。
步骤(4).扩增产物电泳检测
反应结束后，取5 μl 扩增产物与1 μl 6×Loading Buffer混合，2﹪琼脂糖凝胶电泳检测。如图2所示，泳道3为实施例3制备得到的扩增产物电泳结果，在205bp处出现条带说明可疑羊肉中掺有狐狸肉。
实施例4
步骤(1).样品前处理
取合格猪肉丸15g，加入10倍猪肉丸体积的灭菌蒸馏水中，用组织匀浆机均质1 min，制成组织匀浆样品；
步骤(2).样品DNA提取
将50 mg组织匀浆样品、200 μl pH值为8.0的 TE缓冲液涡旋混匀，加入400 μl裂解液，混匀，然后加入600 μl的第一混合溶剂剧烈振荡，12000 g离心10 min，取上清液中加入与该上清液等体积的第二混合溶剂，剧烈振荡，12000 g离心10min，取上清液加入与该上清液等体积氯仿，剧烈振荡，12000 g离心10 min，取上清液加入0.8倍该上清液体积的异丙醇，12000 g离心l0 min，得到沉淀物，用70﹪乙醇清洗沉淀物1次，在常温或50℃下，20min晾干，然后加入80 μl pH值为8.0的 TE缓冲液，使沉淀物溶解于TE缓冲液，得到DNA提取物。该DNA提取物即为模板DNA。将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度。
步骤(3).多重PCR扩增
将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增,得到扩增产物。
PCR扩增反应体系为50 μl由5.0 μl的10×PCR Buffer、0.5 μl浓度为2.5 U/μl 的Taq DNA 聚合酶、4.0 μl浓度为2.5 mmol/L的 dNTPs、6.5 μl加人混合引物、2.0 μl模板DNA和余量的灭菌蒸馏水组成。
多重PCR扩增反应的条件是94℃预变性5min；94℃ 变性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。
步骤(4).扩增产物电泳检测
反应结束后，取5 μl 扩增产物与1 μl 6×Loading Buffer混合，2﹪琼脂糖凝胶电泳检测。如图2所示，泳道4为实施例4制备得到的扩增产物电泳结果，只在671 bp处出现条带说明该猪肉丸中没有掺有其他肉类物质。
实施例5
步骤(1).样品前处理
取样可疑牛肉干15g，加入10倍牛肉干体积的灭菌蒸馏水中，用组织匀浆机均质1 min，制成组织匀浆样品；
步骤(2).样品DNA提取
将50 mg组织匀浆样品、200 μl pH值为8.0的 TE缓冲液涡旋混匀，加入400 μl裂解液，混匀，然后加入600 μl的第一混合溶剂剧烈振荡，12000 g离心10 min，取上清液中加入与该上清液等体积的第二混合溶剂，剧烈振荡，12000 g离心10min，取上清液加入与该上清液等体积氯仿，剧烈振荡，12000 g离心10 min；取上清液加入0.8倍该上清液体积的异丙醇，12000 g离心l0 min，得到沉淀物，用70﹪乙醇清洗沉淀物1次，在常温或50℃下，20min晾干，然后加入80 μl pH值为8.0的 TE缓冲液，使沉淀物溶解于TE缓冲液，得到DNA提取物。该DNA提取物即为模板DNA。将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度。
步骤(3).多重PCR扩增
将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增,得到扩增产物。
PCR扩增反应体系为50 μl由5.0 μl的10×PCR Buffer、0.5 μl浓度为2.5 U/μl 的Taq DNA 聚合酶、4.0 μl浓度为2.5 mmol/L的 dNTPs、6.5 μl加人混合引物、2.0 μl模板DNA和余量的灭菌蒸馏水组成。
多重PCR扩增反应的条件是94℃预变性5min；94℃ 变性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。
步骤(4).扩增产物电泳检测
反应结束后，取5 μl 扩增产物与1 μl 6×Loading Buffer混合，2﹪琼脂糖凝胶电泳检测。如图2所示，泳道5为实施例5制备得到的扩增产物电泳结果，在405 bp处出现条带说明可疑羊肉中掺有鸭肉。
实施例6
步骤(1).样品前处理
取样合格羊肉卷15 g，加入10倍羊肉卷体积的灭菌蒸馏水中，用组织匀浆机均质1 min，制成组织匀浆样品；
步骤(2).样品DNA提取
将50 mg组织匀浆样品、200 μl pH值为8.0的 TE缓冲液涡旋混匀，加入400 μl裂解液，混匀，然后加入600 μl的第一混合溶剂剧烈振荡，12000 g离心10 min，取上清液中加入等体积的第二混合溶剂，剧烈振荡，12000 g离心10min，取上清液加入等体积氯仿，剧烈振荡，12000 g离心10 min；在第三上清液中加入0.8倍体积的异丙醇，12000 g离心l0 min，得到沉淀物，用70﹪的乙醇清洗沉淀物1次，在常温或50℃下，20min晾干，然后加入80 μl pH值为8.0的 TE缓冲液，使沉淀物溶解于TE缓冲液，得到DNA提取物。该DNA提取物即为模板DNA。将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度。
步骤(3).多重PCR扩增
将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增,得到扩增产物。
PCR扩增反应体系为50 μl由5.0 μl的10×PCR Buffer、0.5 μl浓度为2.5 U/μl 的Taq DNA 聚合酶、4.0 μl浓度为2.5 mmol/L的 dNTPs、6.5 μl加人混合引物、2.0 μl模板DNA和余量的灭菌蒸馏水组成。
多重PCR扩增反应的条件是94℃预变性5min；94℃ 变性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。
步骤(4).扩增产物电泳检测
反应结束后，取5 μl 扩增产物与1 μl 6×Loading Buffer混合，2﹪琼脂糖凝胶电泳检测。如图2所示，泳道6为实施例6制备得到的扩增产物电泳结果，未出现条带说明该羊肉卷合格。
实施例7
步骤(1).样品前处理
取样合格牛肉卷15 g，加入10倍牛肉卷体积的灭菌蒸馏水中，用组织匀浆机均质1 min，制成组织匀浆样品；
步骤(2).样品DNA提取
将50 mg组织匀浆样品、200 μl pH值为8.0的 TE缓冲液涡旋混匀，加入400 μl裂解液，混匀，然后加入600 μl的第一混合溶剂剧烈振荡，12000 g离心10 min，取上清液中加入等体积的第二混合溶剂，剧烈振荡，12000 g离心10min，取上清液加入等体积氯仿，剧烈振荡，12000 g离心10 min；在第三上清液中加入0.8倍体积的异丙醇，12000 g离心l0 min，得到沉淀物，用70﹪的乙醇清洗沉淀物1次，在常温或50℃下，20min晾干，然后加入80 μl pH值为8.0的 TE缓冲液，使沉淀物溶解于TE缓冲液，得到DNA提取物。该DNA提取物即为模板DNA。将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度。
步骤(3).多重PCR扩增
将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增,得到扩增产物。
PCR扩增反应体系为50 μl由5.0 μl的10×PCR Buffer、0.5 μl浓度为2.5 U/μl 的Taq DNA 聚合酶、4.0 μl浓度为2.5 mmol/L的 dNTPs、6.5 μl加人混合引物、2.0 μl模板DNA和余量的灭菌蒸馏水组成。
多重PCR扩增反应的条件是94℃预变性5min；94℃ 变性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。
步骤(4).扩增产物电泳检测
反应结束后，取5 μl 扩增产物与1 μl 6×Loading Buffer混合，2﹪琼脂糖凝胶电泳检测。如图2所示，泳道7为实施例7制备得到的扩增产物电泳结果，未出现条带说明该牛肉卷合格。
实施例8
步骤(1).样品前处理
取可疑羊肉15g，加入10倍羊肉体积的灭菌蒸馏水中，用组织匀浆机均质1 min，制成组织匀浆样品；
步骤(2).样品DNA提取
将50 mg组织匀浆样品、200 μl pH值为8.0的 TE缓冲液涡旋混匀，加入400 μl裂解液，混匀，然后加入600 μl的第一混合溶剂剧烈振荡，12000 g离心10 min，取上清液中加入与该上清液等体积的第二混合溶剂，剧烈振荡，12000 g离心10min，取上清液加入与该上清液等体积氯仿，剧烈振荡，12000 g离心10 min；取上清液加入0.8倍该上清液体积的异丙醇，12000 g离心l0 min，得到沉淀物，用70﹪乙醇清洗沉淀物1次，在常温或50℃下，20min晾干，然后加入80 μl pH值为8.0的 TE缓冲液，使沉淀物溶解于TE缓冲液，得到DNA提取物。该DNA提取物即为模板DNA。将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度。
步骤(3).多重PCR扩增
将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增,得到扩增产物。
PCR扩增反应体系为50 μl由5.0 μl的10×PCR Buffer、0.5 μl浓度为2.5 U/μl 的Taq DNA 聚合酶、4.0 μl浓度为2.5 mmol/L的 dNTPs、6.5 μl加人混合引物、2.0 μl模板DNA和余量的灭菌蒸馏水组成。
多重PCR扩增反应的条件是94℃预变性5min；94℃ 变性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。
步骤(4).扩增产物电泳检测
反应结束后，取5 μl 扩增产物与1 μl 6×Loading Buffer混合，2﹪琼脂糖凝胶电泳检测。如图2所示，泳道8为实施例8制备得到的扩增产物电泳结果，在671 bp处出现条带说明可疑羊肉中掺有猪肉。
实施例9
步骤(1).样品前处理
取狐狸肉、老鼠肉、猪肉、鸡肉、鸭肉共15g，加入10倍肉类体积的灭菌蒸馏水中，用组织匀浆机均质1 min，制成组织匀浆样品；
步骤(2).样品DNA提取
将50 mg组织匀浆样品、200 μl pH值为8.0的 TE缓冲液涡旋混匀，加入400 μl裂解液，混匀，然后加入600 μl的第一混合溶剂剧烈振荡，12000 g离心10 min，取上清液中加入与该上清液等体积的第二混合溶剂，剧烈振荡，12000 g离心10min，取上清液加入与该上清液等体积氯仿，剧烈振荡，12000 g离心10 min，取上清液加入0.8倍该上清液体积的异丙醇，12000 g离心l0 min，得到沉淀物，用70﹪乙醇清洗沉淀物1次，在常温或50℃下，20min晾干，然后加入80 μl pH值为8.0的 TE缓冲液，使沉淀物溶解于TE缓冲液，得到DNA提取物。该DNA提取物即为模板DNA。将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度。
步骤(3).多重PCR扩增
将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增,得到扩增产物。
PCR扩增反应体系为50 μl由5.0 μl的10×PCR Buffer、0.5 μl浓度为2.5 U/μl 的Taq DNA 聚合酶、4.0 μl浓度为2.5 mmol/L的 dNTPs、6.5 μl加人混合引物、2.0 μl模板DNA和余量的灭菌蒸馏水组成。
多重PCR扩增反应的条件是94℃预变性5min；94℃ 变性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。
步骤(4).扩增产物电泳检测
反应结束后，取5 μl 扩增产物与1 μl 6×Loading Buffer混合，2﹪琼脂糖凝胶电泳检测。如图2所示，泳道9为实施例9制备得到的扩增产物电泳结果，在205bp、283 bp、405 bp、563 bp、671 bp五处均出现条带说明含有狐狸肉、老鼠肉、猪肉、鸡肉、鸭肉，作为实施例1～8的阳性对照。
实施例10
将水用2﹪琼脂糖凝胶电泳检测。如图2所示，泳道10为实施例10的电泳结果，无条带出现，作为实施例1～8的阴性对照。
上述实施例1～9所用的TE缓冲液为1 ml 浓度为1 M 、pH值为 8.0的Tris-Cl，0.2 ml浓度为 0.5 M、pH值为 8.0的EDTA，定容至100 ml溶液；
所用的裂解液为Tris-HCl、乙二胺四乙酸EDTA、NaCl、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠SDS组成的混合液，其中Tris-HCl的浓度为50 mM、 pH值为 8.0，乙二胺四乙酸EDTA的浓度为25 mM，NaCl的浓度为100 mM，蛋白酶K的浓度为20 μg/μL，十二烷基硫酸钠SDS的质量分数为10﹪。
所用的第一混合溶剂为酚、氯仿、异戊醇的混合液，其中酚、氯仿与异戊醇的体积比为25：24：1；
所用的第二混合溶剂为氯仿、异戊醇的混合液，其中氯仿与异戊醇的体积比为24：1。
上述实施例1～9所述的狐狸肉、老鼠肉、猪肉、鸡肉、鸭肉特异性引物如表1所示。
表1 PCR扩增狐狸肉、老鼠肉、猪肉、鸡肉、鸭肉特异性引物
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江工商大学
<120> 一种鉴别掺假肉及其制品的多重PCR快速检测方法
<130> 1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gacagcagta ttaccatata ac 22
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<213> 人工合成
<400> 4
gaatcacctt gacactgatg cac 23
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
Claims (3)
1.一种鉴别掺假肉及其制品的多重PCR快速检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
根据狐狸肉、老鼠肉、猪肉、鸡肉、鸭肉作为特征靶基因分别设计5对特异性引物：F1/R1、F2/R1、F3/R1、F4/R2、F4/R2 ，即6条特异性引物：F1、F2、F3、F4、R1、R2；
步骤(1).样品前处理：
将肉类及其制品取样，加入10倍肉类及其制品体积的灭菌蒸馏水中，用组织匀浆机均质1min，制成组织匀浆样品；
步骤(2).样品DNA提取：
将50 mg组织匀浆样品、200 μl pH值为8.0的 TE缓冲液涡旋混匀，加入400 μl裂解液，混匀，然后加入600 μl的第一混合溶剂剧烈振荡，12000g离心10 min，取上清液加入与该上清液等体积的第二混合溶剂，剧烈振荡，12000 g离心10min，取上清液加入与该上清液等体积氯仿，剧烈振荡，12000g离心10 min，取上清液加入与0.8倍该上清液体积的异丙醇，12000g离心l0 min，得到沉淀物，用70﹪乙醇清洗沉淀物1次，在常温或50℃下，20min晾干，然后加入80 μl pH值为8.0的 TE缓冲液，使沉淀物溶解于TE缓冲液，得到DNA提取物；该DNA提取物即为模板DNA；将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度；
所述的TE缓冲液为1 ml 浓度为1 M 、pH值为 8.0的Tris-Cl，0.2 ml浓度为 0.5 M、pH值为 8.0的EDTA，定容至100 ml溶液；
所述的裂解液为Tris-HCl、乙二胺四乙酸EDTA、NaCl、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠SDS组成的混合液，其中Tris-HCl的浓度为50 mM、 pH值为 8.0，乙二胺四乙酸EDTA的浓度为25 mM，NaCl的浓度为100 mM，蛋白酶K的浓度为20 μg/μL，十二烷基硫酸钠SDS的质量分数为10﹪；
所述的第一混合溶剂为酚、氯仿、异戊醇的混合液，其中酚、氯仿与异戊醇的体积比为25：24：1；
所述的第二混合溶剂为氯仿、异戊醇的混合液，其中氯仿与异戊醇的体积比为24：1；
步骤(3).多重PCR扩增：
将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增,得到扩增产物；
所述的PCR扩增反应体系为50 μl由5.0 μl的10×PCR Buffer、0.5 μl浓度为2.5 U/μl 的Taq DNA 聚合酶、4.0 μl浓度为2.5 mmol/L的 dNTPs、6.5 μl加人混合引物、2.0 μl模板DNA和余量的灭菌蒸馏水组成；
所述的多重PCR扩增反应的条件是94℃预变性5min；94℃ 变性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸30s，35个循环；72℃延伸7min；
所述的加人混合引物为5对特异性引物的混合引物，其中5对特异性引物的浓度比为F1:F2:F3:F4:R1:R2=1:1:1:2:3:2；
步骤(4).扩增产物电泳检测：
PCR扩增反应结束后，将5μl 扩增产物与1μl 6×Loading Buffer混合，用2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。
2.如权利要求1所述的一种鉴别掺假肉及其制品的多重PCR快速检测方法，其特征在于所述的6条特异性引物具体是：
F1: 5’-CTAGGGGTTTAGGTTAAACG-3’；
F2: 5’-CACCAAACAAAAACTAAACC-3’；
F3: 5’-GACAGCAGTATTACCATATAAC-3’；
F4: 5’-GAATCACCTTGACACTGATGCAC-3’；
R1: 5’- AGGGTATTTAGCTGTTAAC-3’；
R2: 5’-GCGGATACTTGCATGTATATGTC-3’。
3.如权利要求1所述的一种鉴别掺假肉及其制品的多重PCR快速检测方法，其特征在于狐狸特异性引物F1/R1的长度为205 bp，老鼠特异性引物F2/R1的长度为283 bp，猪特异性引物F3/R1的长度为671 bp，鸡特异性引物F4/R2的长度为563 bp，鸭特异性引物F4/R2的长度为405 bp。
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