CN104498597A - 清真食品中常见禁忌成分的多重pcr快速检测方法 - Google Patents
清真食品中常见禁忌成分的多重pcr快速检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种清真食品中常见禁忌成分的多重PCR快速检测方法，该方法包括以下步骤：⑴制备猪、羊、鸡、老鼠、牛5种混合肉的对照肉品DNA模板；⑵根据猪、羊、鸡、老鼠、牛的线粒体细胞色素b基因序列，设计通用的正向引物和反向特异性引物；⑶将通用引物猪、羊、鸡、老鼠、牛按比例混合均匀后，得到多重PCR引物；⑷提取待测肉品DNA，得到待测肉品DNA模板；⑸建立对照肉品DNA的PCR反应体系；⑹建立待测肉品DNA的PCR反应体系；⑺分别对对照肉品DNA、待测肉品DNA进行PCR反应，分别得到PCR产物；⑻分别将PCR产物用琼脂凝胶电泳检测扩增结果，继而判定该待测肉品是否含有猪、羊、鸡、牛和老鼠五种肉类成分中的一种或多种。本发明操作简便、经济省时。
Description
技术领域
本发明涉及食品质量安全检测技术领域，尤其涉及清真食品中常见禁忌成分的多重PCR快速检测方法。
背景技术
目前，食品安全已受到全社会的关注。由于经济利益驱动，一些不法商家在食品的加工过程中，常常以价格相对低廉的肉冒充高价优质的肉，尤以猪肉、鸡肉为原料替代高价格的牛肉、羊肉，这不仅关系到经济和食品安全问题，更直接影响着消费者的健康。还有清真食品掺假的案例在全国时有发生（例如，在清真食品中掺杂进猪肉等），严重危害了穆斯林群众的民族感情和身体健康。甚至，一些犯罪分子从各地购入狐狸、水貂、老鼠等未经检验检疫的动物肉制品，添加明胶、胭脂红、硝盐等冒充羊肉销售到农贸市场。因此，对清真及掺杂食品动物源性成分的检验显得十分必要，其重点就是快速、准确的鉴定肉的品种来源。
随着生物技术的发展，以物种间基因差异为基础的分子学鉴定方法成为研究的热点，因为DNA的热稳定性与酸碱稳定性均比蛋白质强，高温、强酸强碱处理过的食品中仍能提取出小片段的DNA；DNA比蛋白质具有更高的动物种属间遗传信息差异性，有利于物种鉴别。因此，PCR方法由于特异性高、方法便捷、不受组织类别限制等诸多优势，已成为动物源性成分鉴别最常用的方法。但是在国内针对肉掺假现状，并未出现应用多重PCR技术对老鼠肉、猪肉和鸡肉等检测的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简便、经济省时的清真食品中常见禁忌成分的多重PCR快速检测方法。
为解决上述问题，本发明所述的清真食品中常见禁忌成分的多重PCR快速检测方法，包括以下步骤：
⑴将生鲜的猪肉、羊肉、鸡肉、牛肉和老鼠肉分别用液氮研磨后混合，得到混合肉，使用DNeasy? Blood and Tissue Kit动物组织的基因组DNA提取试剂盒提取混合肉中的DNA，测定其在260nm和280nm处的吸光度值，计算DNA的浓度，即得到猪、羊、鸡、老鼠、牛5种混合肉的DNA作为对照肉品DNA模板；
⑵根据猪、羊、鸡、老鼠、牛的线粒体细胞色素b基因序列，设计通用的正向引物和反向特异性引物；其中
所述正向引物序列为5’-CAAAGCTACCCTCACCCG-3’；
所述反向特异性引物序列如下所示：
猪5’-CTATGTCTGATGAGATTCCGGTA-3’，片段大小为138bp；
羊5’-TGAGGATTAGTAGGATAGCACC-3’，片段大小为199bp；
鸡5’-GATGGCATAGGCGAATAGAA-3’，片段大小为327bp；
老鼠5’-AGATAAGATTAAGGCTAGAACACC-3’，片段大小为378bp；
牛5’-TTCATGTGAGTGTCAGTAGGTCT-3’，片段大小为499bp；
⑶将所述通用引物猪、羊、鸡、老鼠、牛按10pmol/30uL：5pmol/30uL：1pmol/30uL：6pmol/30uL：10pmol/30uL：12pmol/30uL的比例混合均匀后，得到多重PCR引物；
⑷提取待测肉品DNA：
将待测肉品10g用液氮研磨后，使用DNeasy? Blood and Tissue Kit动物组织的基因组DNA提取试剂盒提取DNA，并测定DNA浓度，得到待测肉品DNA模板；
⑸建立对照肉品DNA的PCR反应体系：
2×Taq PCR StarMix 15uL
多重PCR引物 6.7uL
对照肉品DNA模板 2.0uL
灭菌蒸馏水补足至30uL；
⑹建立待测肉品DNA的PCR反应体系：
2×Taq PCR StarMix 15uL
多重PCR引物 6.7uL
待测肉品DNA模板 2.0uL
灭菌蒸馏水补足至30uL；
⑺分别对对照肉品DNA、待测肉品DNA进行PCR反应，程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，32个循环；72℃延伸3min，分别得到对照肉品DNA的PCR产物、待测肉品DNA的PCR产物；
⑻分别将10uL所述对照肉品DNA的PCR产物、所述待测肉品DNA的PCR产物用质量浓度为2%的琼脂凝胶电泳检测扩增结果，当所述待测肉品DNA的PCR产物的电泳图中的一个泳道上出现片段大小为138bp、199bp、327bp、378bp、499bp五个条带中的一个或多个时，即判定该待测肉品含有猪、羊、鸡、牛和老鼠五种肉类成分中的一种或多种。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明根据动物线粒体细胞色素b基因序列（引物在线粒体基因组中的结合位置见图1），建立猪、羊、鸡、老鼠、牛5种肉类成分快速鉴别的通用引物多重PCR方法，可一次性快速检测食品及其制品中是否参杂猪、羊、鸡、老鼠、牛五种肉类成分。
2、对本发明进行特异性检测：
分别对猪、羊、鸡、老鼠和牛5种肉类等比例混合，以灭菌双蒸水为阴性对照进行单重、2重、3重和4重的特异性检测，琼脂糖凝胶电泳图谱见图2~图5。由图2~5可知，对5种目标肉类DNA和混合肉类的DNA进行检测，均在设计位置观察到特异性条带，未见明显非特异性扩增，且阴性对照未检出。将扩增产物纯化，取10uLPCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳，对各条带回收并委托测序，将测序结果与GenBank中的已知序列进行比对。比对结果显示猪、羊、鸡、老鼠和牛的同源性均在99%以上，与预期基本一致，确定分别为猪、羊、鸡、老鼠和牛源性成分。
3、对本发明进行灵敏度检测：
针对提取的动物基因组总DNA 进行多重PCR检测，将30ng/μL猪、羊、鸡、老鼠、牛来源的DNA模板原液10uL进行10倍梯度稀释至10-4，取每个稀释度的混合模板2ul，进行多重PCR，并进行电泳分析，结果见图6。由图6可见，目标DNA稀释103倍后，使用多重PCR法进行检测，均仍可观察到5条明显的条带，因此，检测的灵敏度0.3ng/ul。
4、对本发明进行重复性试验：
重复进行10次，每次均独立制备混合模板，进行多重PCR扩增，灭菌双蒸水为阴性对照。结果表明，本试验的重复性很强，优化的条件适合进行多重PCR的检测，对混合肉的检测具有很好的稳定性。
5、本发明特异性好，敏感性强，快速且操作简便，极大程度的提高了检测量，弥补了行业标准的不足。和已有的方法比较，本发明一次性检测的动物源性成分更多，更经济、省时，这对国内肉掺假的检测研究具有重要意义和实用价值，可推广应用于检测部门。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明细胞色素b基因中多重PCR引物结合位点。其中P：猪；G：羊；C：鸡；M：老鼠；B：牛。方框内部分为引物结合位置，黄色部分表示为各物种在引物结合位置上的差异碱基，点表示各物种在引物结合位置上的相同碱基。
图2为本发明单重PCR电泳图谱。其中M：DL 1000 DNA marker；1：猪肉；2：羊肉；3：鸡肉；4：老鼠肉；5：牛肉；6：水阴性对照。
图3为本发明二重PCR电泳图谱。其中M：DL 1000 DNA marker； 1：猪肉和羊肉；2：猪肉和鸡肉；3：猪肉和老鼠肉；4：猪肉和牛肉；5：羊肉和鸡肉；6：羊肉和牛肉；7：羊肉和老鼠肉；8：鸡肉和老鼠肉；9鸡肉和牛肉；10：老鼠肉和牛肉；11：水阴性对照。
图4为本发明三重PCR电泳图谱。其中M：DL 1000 DNA marker。1：猪肉、羊肉和鸡肉；2：猪肉、羊肉和鸡肉；3：猪肉、羊肉和牛肉；4：猪肉、鸡肉和老鼠肉；5：羊肉、鸡肉和牛肉；6：猪肉、老鼠肉和牛肉；7：羊肉、鸡肉和老鼠肉；8：羊肉、鸡肉和老鼠肉；9：羊肉、老鼠肉和牛肉；10：鸡肉、老鼠肉和牛肉；11：水阴性对照。
图5为本发明四重PCR电泳图谱。其中M：DL 1000 DNA marker。1：猪肉、羊肉、鸡肉和老鼠肉；2：猪肉、羊肉、鸡肉和牛肉；3：猪肉、鸡肉、老鼠肉和牛肉；4：猪肉、羊肉、老鼠肉和牛肉；5：羊肉、鸡肉、老鼠肉和牛肉；6：水阴性对照。
图6为本发明多重PCR的敏感性试验。其中M：DL 1000 DNA marker；1~5分别为五种肉的混合模板量30、3、0.3、0.03和0.003ng；6：水阴性对照。
图7为本发明实施例1~3的扩增产物电泳结果。
具体实施方式
实施例1 清真食品中常见禁忌成分的多重PCR快速检测方法，包括以下步骤：
⑴将生鲜的猪肉、羊肉、鸡肉、牛肉和老鼠肉分别用液氮研磨后混合，得到混合肉，使用DNeasy? Blood and Tissue Kit动物组织的基因组DNA提取试剂盒提取混合肉中的DNA，测定其在260nm和280nm处的吸光度值，计算DNA的浓度，即得到猪、羊、鸡、老鼠、牛5种混合肉的DNA作为对照肉品DNA模板。
⑵根据猪、羊、鸡、老鼠、牛的线粒体细胞色素b基因序列，设计通用的正向引物和反向特异性引物。其中
正向引物序列为5’-CAAAGCTACCCTCACCCG-3’；
反向特异性引物序列如下所示：
猪5’-CTATGTCTGATGAGATTCCGGTA-3’，片段大小为138bp；
羊5’-TGAGGATTAGTAGGATAGCACC-3’，片段大小为199bp；
鸡5’-GATGGCATAGGCGAATAGAA-3’，片段大小为327bp；
老鼠5’-AGATAAGATTAAGGCTAGAACACC-3’，片段大小为378bp；
牛5’-TTCATGTGAGTGTCAGTAGGTCT-3’，片段大小为499bp。
⑶将通用引物猪、羊、鸡、老鼠、牛按10pmol/30uL：5pmol/30uL：1pmol/30uL：6pmol/30uL：10pmol/30uL：12pmol/30uL的比例混合均匀后，得到多重PCR引物。
⑷提取待测肉品DNA：
将待测肉品——羊肉10g用液氮研磨后，使用DNeasy? Blood and Tissue Kit动物组织的基因组DNA提取试剂盒提取DNA，并测定DNA浓度，得到待测肉品DNA模板。
⑸建立对照肉品DNA的PCR反应体系：
2×Taq PCR StarMix（购自北京康润诚业生物科技有限公司） 15uL
多重PCR引物 6.7uL
对照肉品DNA模板 2.0uL
灭菌蒸馏水补足至30uL。
⑹建立待测肉品DNA的PCR反应体系：
2×Taq PCR StarMix（购自北京康润诚业生物科技有限公司） 15uL
多重PCR引物 6.7uL
待测肉品DNA模板 2.0uL
灭菌蒸馏水补足至30uL。
⑺分别对对照肉品DNA、待测肉品DNA进行PCR反应，程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，32个循环；72℃延伸3min，分别得到对照肉品DNA的PCR产物、待测肉品DNA的PCR产物。
⑻分别将10uL对照肉品DNA的PCR产物、待测肉品DNA的PCR产物用质量浓度为2%的琼脂凝胶电泳检测扩增结果，当待测肉品DNA的PCR产物的电泳图中的泳道1上出现片段大小为327bp的一个条带时（参见图7），即判定该待测肉品含有鸡肉成分。
实施例2 清真食品中常见禁忌成分的多重PCR快速检测方法，包括以下步骤：
⑴将生鲜的猪肉、羊肉、鸡肉、牛肉和老鼠肉分别用液氮研磨后混合，得到混合肉，使用DNeasy? Blood and Tissue Kit动物组织的基因组DNA提取试剂盒提取混合肉中的DNA，测定其在260nm和280nm处的吸光度值，计算DNA的浓度，即得到猪、羊、鸡、老鼠、牛5种混合肉的DNA作为对照肉品DNA模板。
⑵根据猪、羊、鸡、老鼠、牛的线粒体细胞色素b基因序列，设计通用的正向引物和反向特异性引物。其中
正向引物序列为5’-CAAAGCTACCCTCACCCG-3’；
反向特异性引物序列如下所示：
猪5’-CTATGTCTGATGAGATTCCGGTA-3’，片段大小为138bp；
羊5’-TGAGGATTAGTAGGATAGCACC-3’，片段大小为199bp；
鸡5’-GATGGCATAGGCGAATAGAA-3’，片段大小为327bp；
老鼠5’-AGATAAGATTAAGGCTAGAACACC-3’，片段大小为378bp；
牛5’-TTCATGTGAGTGTCAGTAGGTCT-3’，片段大小为499bp。
⑶将通用引物猪、羊、鸡、老鼠、牛按10pmol/30uL：5pmol/30uL：1pmol/30uL：6pmol/30uL：10pmol/30uL：12pmol/30uL的比例混合均匀后，得到多重PCR引物。
⑷提取待测肉品DNA：
将待测肉品——牛肉丸10g用液氮研磨后，使用DNeasy? Blood and Tissue Kit动物组织的基因组DNA提取试剂盒提取DNA，并测定DNA浓度，得到待测肉品DNA模板。
⑸建立对照肉品DNA的PCR反应体系：
2×Taq PCR StarMix（购自北京康润诚业生物科技有限公司） 15uL
多重PCR引物 6.7uL
对照肉品DNA模板 2.0uL
灭菌蒸馏水补足至30uL。
⑹建立待测肉品DNA的PCR反应体系：
2×Taq PCR StarMix（购自北京康润诚业生物科技有限公司） 15uL
多重PCR引物 6.7uL
待测肉品DNA模板 2.0uL
灭菌蒸馏水补足至30uL。
⑺分别对对照肉品DNA、待测肉品DNA进行PCR反应，程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，32个循环；72℃延伸3min，分别得到对照肉品DNA的PCR产物、待测肉品DNA的PCR产物。
⑻分别将10uL对照肉品DNA的PCR产物、待测肉品DNA的PCR产物用质量浓度为2%的琼脂凝胶电泳检测扩增结果，当待测肉品DNA的PCR产物的电泳图中的泳道2上出现片段大小为、199bp的一个条带时（参见图7），即判定该待测肉品含有羊肉成分。
实施例3 清真食品中常见禁忌成分的多重PCR快速检测方法，包括以下步骤：
⑴将生鲜的猪肉、羊肉、鸡肉、牛肉和老鼠肉分别用液氮研磨后混合，得到混合肉，使用DNeasy? Blood and Tissue Kit动物组织的基因组DNA提取试剂盒提取混合肉中的DNA，测定其在260nm和280nm处的吸光度值，计算DNA的浓度，即得到猪、羊、鸡、老鼠、牛5种混合肉的DNA作为对照肉品DNA模板。
⑵根据猪、羊、鸡、老鼠、牛的线粒体细胞色素b基因序列，设计通用的正向引物和反向特异性引物。其中
正向引物序列为5’-CAAAGCTACCCTCACCCG-3’；
反向特异性引物序列如下所示：
猪5’-CTATGTCTGATGAGATTCCGGTA-3’，片段大小为138bp；
羊5’-TGAGGATTAGTAGGATAGCACC-3’，片段大小为199bp；
鸡5’-GATGGCATAGGCGAATAGAA-3’，片段大小为327bp；
老鼠5’-AGATAAGATTAAGGCTAGAACACC-3’，片段大小为378bp；
牛5’-TTCATGTGAGTGTCAGTAGGTCT-3’，片段大小为499bp。
⑶将通用引物猪、羊、鸡、老鼠、牛按10pmol/30uL：5pmol/30uL：1pmol/30uL：6pmol/30uL：10pmol/30uL：12pmol/30uL的比例混合均匀后，得到多重PCR引物。
⑷提取待测肉品DNA：
将待测肉品——羊肉片10g用液氮研磨后，使用DNeasy? Blood and Tissue Kit动物组织的基因组DNA提取试剂盒提取DNA，并测定DNA浓度，得到待测肉品DNA模板。
⑸建立对照肉品DNA的PCR反应体系：
2×Taq PCR StarMix（购自北京康润诚业生物科技有限公司） 15uL
多重PCR引物 6.7uL
对照肉品DNA模板 2.0uL
灭菌蒸馏水补足至30uL。
⑹建立待测肉品DNA的PCR反应体系：
2×Taq PCR StarMix（购自北京康润诚业生物科技有限公司） 15uL
多重PCR引物 6.7uL
待测肉品DNA模板 2.0uL
灭菌蒸馏水补足至30uL。
⑺分别对对照肉品DNA、待测肉品DNA进行PCR反应，程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，32个循环；72℃延伸3min，分别得到对照肉品DNA的PCR产物、待测肉品DNA的PCR产物。
⑻分别将10uL对照肉品DNA的PCR产物、待测肉品DNA的PCR产物用质量浓度为2%的琼脂凝胶电泳检测扩增结果，当待测肉品DNA的PCR产物的电泳图中的泳道3上出现片段大小为199bp的一个条带时（参见图7），即判定该待测肉品含有羊肉成分，没有掺有其他肉类物质。
Claims (1)
1.清真食品中常见禁忌成分的多重PCR快速检测方法，包括以下步骤：
⑴将生鲜的猪肉、羊肉、鸡肉、牛肉和老鼠肉分别用液氮研磨后混合，得到混合肉，使用DNeasy? Blood and Tissue Kit动物组织的基因组DNA提取试剂盒提取混合肉中的DNA，测定其在260nm和280nm处的吸光度值，计算DNA的浓度，即得到猪、羊、鸡、老鼠、牛5种混合肉的DNA作为对照肉品DNA模板；
⑵根据猪、羊、鸡、老鼠、牛的线粒体细胞色素b基因序列，设计通用的正向引物和反向特异性引物；其中
所述正向引物序列为5’-CAAAGCTACCCTCACCCG-3’；
所述反向特异性引物序列如下所示：
猪5’-CTATGTCTGATGAGATTCCGGTA-3’，片段大小为138bp；
羊5’-TGAGGATTAGTAGGATAGCACC-3’，片段大小为199bp；
鸡5’-GATGGCATAGGCGAATAGAA-3’，片段大小为327bp；
老鼠5’-AGATAAGATTAAGGCTAGAACACC-3’，片段大小为378bp；
牛5’-TTCATGTGAGTGTCAGTAGGTCT-3’，片段大小为499bp；
⑶将所述通用引物猪、羊、鸡、老鼠、牛按10pmol/30uL：5pmol/30uL：1pmol/30uL：6pmol/30uL：10pmol/30uL：12pmol/30uL的比例混合均匀后，得到多重PCR引物；
⑷提取待测肉品DNA：
将待测肉品10g用液氮研磨后，使用DNeasy? Blood and Tissue Kit动物组织的基因组DNA提取试剂盒提取DNA，并测定DNA浓度，得到待测肉品DNA模板；
⑸建立对照肉品DNA的PCR反应体系：
2×Taq PCR StarMix 15uL
多重PCR引物 6.7uL
对照肉品DNA模板 2.0uL
灭菌蒸馏水补足至30uL；
⑹建立待测肉品DNA的PCR反应体系：
2×Taq PCR StarMix 15uL
多重PCR引物 6.7uL
待测肉品DNA模板 2.0uL
灭菌蒸馏水补足至30uL；
⑺分别对对照肉品DNA、待测肉品DNA进行PCR反应，程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，32个循环；72℃延伸3min，分别得到对照肉品DNA的PCR产物、待测肉品DNA的PCR产物；
⑻分别将10uL所述对照肉品DNA的PCR产物、所述待测肉品DNA的PCR产物用质量浓度为2%的琼脂凝胶电泳检测扩增结果，当所述待测肉品DNA的PCR产物的电泳图中的一个泳道上出现片段大小为138bp、199bp、327bp、378bp、499bp五个条带中的一个或多个时，即判定该待测肉品含有猪、羊、鸡、牛和老鼠五种肉类成分中的一种或多种。
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