CN104789692B - 一种鉴别牛羊猪源性成分的引物组及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种鉴别牛羊猪源性成分的引物组及试剂盒，包含有牛羊猪通用下游引物Seq1、牛羊通用上游引物Seq2和猪特异性上游引物Seq3。本发明与现有技术相比，可以在一次PCR反应中检测牛、羊、猪三个物种，且具有很高的稳定性和灵敏性。相对更为复杂的多重PCR技术，三引物PCR的在一定程度上减少了误差，更为重要的是一次PCR就可以鉴定牛羊猪三个物种，省时省力。本发明基于PCR技术平台，对实验室设备要求不高，适于基层单位应用。

Description

一种鉴别牛羊猪源性成分的引物组及试剂盒

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种鉴别牛羊猪源性成分的试剂盒。

背景技术

自古以来“民以食为天”，“食”一直以来是人们日常生活中必不可少的一部分。随着社会经济的发展，肉类及其制品成为人们日常食物的重要来源和组成部分。但是，国内外市场上肉食品安全性事件时有发生，“瘦肉精事件”、“三聚氰胺事件”、“假牛肉事件”和“马肉风波”等食品问题层出不穷，同时带来诸多社会问题。当今，食品的丰富多样化改变了外观和气味，这也给肉类掺假者带来了可乘之机。这些问题不但直接损害了消费者的经济利益，还可能引发一系列社会问题。因此，国家监管部门先后颁布多项法律法规来规范动物性食品销售的多个环节。在技术上，国家质检总局制定了一系列的标准方法用于牛、羊、猪等物种成分的检测，这对打击掺假犯罪起到了一定作用。

早期肉类鉴别依赖于感官和形态学检验，这些检验方法准确性低、局限度大，对于深加工的肉类掺假基本无法鉴别。随后发展了肉类形态学分析和成分鉴定方法，在这个过程中基本确立了以特征性的蛋白和核酸作为靶标物质进行检验的思路。如今形成了蛋白检验和DNA分析两个不同的检测方向，经过20多年的发展，鉴别精度和灵敏度均有极大提高。但是当肉类经过物理处理如切碎、混合、蒸煮和熏烤等过程后失去了原有形态和质地，蛋白质鉴定技术不能满足对这些样品检测的需要。因此，有必要提供一种简便易行、准确度更高的检测方法来检测肉类成分。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别牛羊猪源性成分的引物组，包含有如下的引物：

牛羊猪通用下游引物Seq1：

TGGCTGGCACGAGATTTA(SEQ ID NO:1)、

牛羊通用上游引物Seq2：

GCTGGACTTAACTGCATC(SEQ ID NO:2)、

猪特异性上游引物Seq3：

ACGCCAATCTACCACAAA(SEQ ID NO:3)。

为了提高检测的特异性，对上述的牛羊通用上游引物Seq2进行了优化，优化后的引物信息如下：

牛羊通用上游引物Seq2优选1：GCTGGACTTAACTGCAGC(SEQ ID NO:4)、

牛羊通用上游引物Seq2优选2：GCTGGACTTAACTGCCTC(SEQ ID NO:5)。

上述的引物组，扩增的牛、羊、猪源性成分的扩增的片段大小分别为549bp、570bp和420bp。

本发明还提供一种鉴别牛羊猪源性成分的试剂盒，使用上述的引物组；

所述的试剂盒，还包含有如下的组分：

PCR Buffer A液：含有100pM dNTP、2.0mM MgCl₂、1×PCR buffer、50U/L Taq聚合酶、0.6μM牛羊猪通用下游引物Seq1、0.3μM牛羊通用上游引物Seq2、0.3μM猪特异性上游引物Seq3和双蒸水；

Positive B液：含有阳性DNA模板(总浓度50ng/μL，等比混合牛、猪和绵羊基因组DNA。

Negative C液：蒸馏水。

本发明与现有技术相比，可以在一次PCR反应中检测牛、羊、猪三个物种，且具有很高的稳定性和灵敏性。相对更为复杂的多重PCR技术，三引物PCR在一定程度上减少了误差，更为重要的是一次PCR就可以鉴定猪牛羊三个物种，省时省力。本发明基于PCR技术平台，对实验室设备要求不高，适于基层单位应用。

附图说明

图1：是本发明对牛羊猪样品的检测结果。以中国荷斯坦牛、湖羊、美利奴羊、太湖猪、长白猪的DNA为模板，扩增测试所有待检样品扩增性良好，混合样品提取的DNA也完全达到一致效果。图中泳道编号备注如下：1：DNA Marker；2:牛；3：羊；4：猪；5：牛羊猪；6：牛羊；7：阴性对照。

具体实施方式：

本发明经过对猪、牛、羊及常见物种的mtDNA全序列做精细对比，以包含物种特异性序列两端的保守区为引物设计区域，扩增区域序列由于存在插入-缺失片段而产物大小不同，可在一步PCR中同时鉴定不同的物种，提高检测效率。

应当说明的是，本方法以绵羊基因组为参照设计完成，对山羊宜使用，具有与绵羊源性成分同等检测效果，但对山羊基因组扩增产物长度为575bp。

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。

实施例1引物的设计及检测

1、引物的设计

根据GenBank所公布的基因序列，以牛(JQ437479)、绵羊(NC_001941)和猪(DQ534707)的线粒体DNA(mtDNA)全序列为模板，通过比对分析三个物种及常见动物(鸡、鸭、兔、鼠、马、狗)的mtDNA序列，根据其基因序列的特异性和保守性，设计特异性引物。同时，为了避免牛羊猪近缘物种的非特异性扩增，引入特异性错配碱基以提高PCR的特异性，设计了两条通用引物的优选引物，分别在3ˊ端倒数第二和第三个碱基引入G-A和C-T错配。引物序列如表1所示。

表1：引物序列信息

2、引物效果的检测

引物设计完成后，以标准品DNA为模板，对引物的灵敏度和特异性进行了检测，基本过程如下：

2.1PCR基础体系和反应条件的优化

PCR反应体系采用了20μL的基础体系，包含试剂和溶液的量如表2所示。本试验基本的PCR过程如下：95℃变性5min；95℃变性40s，不同退火温度(温度范围48.0～63.0℃)30s，72℃延伸40s为一个循环，共计30个循环；然后72℃延伸10min。

表2：PCR基础体系

根据上述PCR体系，在梯度PCR仪上设置温度梯度，对5条引物组成的4对组合(Seq1-Seq2；Seq1-Seq3；Seq1-优选1；Seq1-优选2)进行退火温度优化。不同温度下的PCR产物经电泳检测后选取电泳条带大小与预期大小一致、亮度高、无杂带的温度作为基础体系的温度，然后在该温度下依次进行Mg²⁺浓度(1.5，1.8，2.1，2.5，3.0mM)、dNTP浓度和引物浓度(1.5μM-0.2μM)以及PCR程序(循环数26、30、35、40)的优化。

经过上述方法对PCR体系的优化筛选，4对配对引物Seq1-Seq2、Seq1-Seq3、Seq1-优选1和Seq1-优选2均能扩增预期大小的片段，且条带清晰、亮度好。分别选取牛羊猪的PCR产物，按照试剂盒说明进行回收、连接、转化至大肠杆菌，菌液送往公司测序，证明扩增序列为预期片段。

2.2PCR各引物特异性和灵敏度检测

为验证各引物组合的特异性和灵敏度，用4对引物分别对牛、羊、猪、鸡、鸭、鱼、鼠和兔的基因组DNA按照最优条件进行扩增反应，结果证明Seq1-Seq2引物能很好的扩增牛、羊基因组DNA，但是该引物组合对于鸡基因组DNA也有微量的非特异性扩增；其次Seq1-Seq3引物能特异性扩增猪基因组DNA，而对其他待检动物DNA无扩增；引物Seq1-Seq2优选1、Seq1-Seq1优选2组合均能特异性扩增牛羊DNA，但是Seq1-优选1组合需要40个循环，而Seq1-优选2组合只要30个循环就能达到很好的效果，相比Seq1-优选1能提高扩增检测的效率、节约时间。因此，选择特异性高的Seq1-Seq3和Seq1-优选2组合做为检测首选的引物进行灵敏度检测。把牛、羊、猪基因组DNA模板按照梯度稀释最低浓度至1.0pg/μL，按照最优PCR条件添加不同量的DNA模板，扩增后电泳检测PCR产物。结果在Seq1-Seq3引物体系中对猪DNA的最低检测量为8pg，Seq1-优选2组合中对牛羊DNA的最低检测量为16pg；均不低于现有对牛羊猪单一物种的检测标准。

2.3引物组合的优化和灵敏度

由于本发明所用引物组在反应体系中有三条引物即Seq1、Seq3和Seq2优选2，两两配对组成2对组合，在PCR体系中进行多重PCR，因此在扩增混合模板DNA样品时要合适筛选不同的上下游引物比例，以便达到最佳扩增效果。对不同比例混合的DNA样品，共设计了4个浓度比例引物组合，Seq2优选2：Seq3：Seq1浓度比分别为1:1:1，1:1:2，1:1:3，2:1:3。在最优条件下，以牛羊猪等比例混合DNA作为模板进优化，PCR产物电泳检测结果表明，当引物浓度比为1:1:2时对混合DNA模板有最好的扩增效果；进一步灵敏度测试表明，此时反应体系中混合DNA检测最低量为20pg。

实施例2：牛羊猪源性样品的检测试剂盒

本发明还提供一种含有上述试剂的适用于牛羊猪肉及产制品成分检测的PCR试剂盒。其包含下列试剂及标注浓度：

PCR Buffer A液：含有dNTP(100pM)、MgCl₂(2.0mM)、PCR buffer(1×)、Taq聚合酶(50U/L)、引物Seq1(0.6μM)、引物Seq2优选2(0.3μM)、引物Seq3(0.3μM)和双蒸水。

Positive B液：含有阳性DNA模板(总浓度50ng/μL，等比混合牛、猪和绵羊基因组DNA。

Negative C液：蒸馏水。

包含PCR程序及具体操作的说明书，PCR程序如下：

95℃变性5min；95℃变性30s，退火53.2℃30s，72℃延伸40s为一个循环，共计30个循环；然后72℃保持10min。结束后降温至4℃。

实施例3：牛羊猪源性样品的检测

为了验证本发明中对牛、羊、猪三个物种源性DNA的检测准确性，首先分别从构建的载体中提取质粒DNA，按照上述方法进行检测，电泳结果均能准确清楚的判读物种来源。其次，对从市场购买的鲜猪肉、鲜牛肉、鲜羊肉进行处理，包括混合搅拌、腌制、高温蒸煮(100℃开水)处理，然后按照DNA提取方法进行基因组DNA提取。按照本发明的方法进行检测，也能很好的检测所含成分。

同时，把猪肉、牛肉、羊肉单一或者混合样品与鸡肉及淀粉混合搅拌，取样后提取基因组DNA并按照本发明进行检测。当混合样品中猪肉、牛肉、羊肉单一或者总份量达到6.0％以上均能检测出掺入的牛、羊、猪源性成分。

从夜市和火锅店购买20份烤肉串和10份炸鸡块，按照本发明进行检测，20份烤肉串中2份含有羊源性成分，20份中均含有猪源性成分；10份炸鸡块中均未检测到牛羊猪源性成分。

Claims (4)

1.一种鉴别牛羊猪源性成分的引物组，其特征在于，所述的引物组包含有：

序列为SEQ ID NO:1的牛羊猪通用下游引物、

序列为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5任一项的牛羊通用上游引物；

序列为SEQ ID NO:3的猪特异性上游引物。

2.一种鉴别牛羊猪源性成分的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求1所述的引物组。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有如下的组分：

PCR Buffer A液：含有100pM dNTP、2.0mM MgCl₂、1×PCR buffer、50U/L Taq聚合酶、0.6μM牛羊猪通用下游引物、0.3μM牛羊通用上游引物、0.3μM猪特异性上游引物和双蒸水；

Positive B液：含有阳性DNA模板、

Negative C液：蒸馏水。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性DNA模板的浓度为50ng/μL。