CN101775436A

CN101775436A - 饲料中牛羊源成分检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN101775436A
Application number: CN200910218081A
Authority: CN
Inventors: 逄大欣; 欧阳红生; 郑文文; 李小平; 高飞; 王铁东; 任林柱; 李莉; 张明军; 张英
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2009-12-23
Filing date: 2009-12-23
Publication date: 2010-07-14
Anticipated expiration: 2029-12-23
Also published as: CN101775436B

Abstract

本发明提供一种饲料中牛羊源成分检测试剂盒，同时还提供了相应的试剂盒，用于牲畜饲料中牛羊源成分检测。本发明建立一种快速、灵敏、准确率高，适用于饲料中牛羊源成分检测的实时荧光定量PCR体系。

Description

饲料中牛羊源成分检测方法及试剂盒

技术领域：

本发明涉及一种饲料中牛羊源成份检测方法，同时还提供了相应的试剂盒，属于牲畜饲料成分检测技术领域。

背景技术：

羊搔痒病和疯牛病致病因子相同，均由朊蛋白(Prion)引起。流行病学调查证明，用患有疯牛病和羊搔痒病的牛、羊等动物的肉和骨头制成的肉骨粉喂养动物会导致疯牛病和羊搔痒病的传播，是引起牛脑海绵状病(BSE)发生的最初的原因。目前国内外对于饲料中动物源性成分的检测方法的报道主要有显微镜检、红外光谱、普通PCR、ELISA等，但这些方法存在检测量小、易产生假阳性、要求检验人员有丰富的操作经验等缺点，因此迫切需要建立一种快速、准确和经济的方法，荧光定量PCR法正是一种可以满足这些要求的方法。

发明内容

本发明公开了一种饲料中牛羊源成分检测的试剂盒，用于牲畜饲料中牛羊源成分检测。

本发明还提供了上述试剂盒的制备方法，建立一种快速、灵敏、准确率高的适用于饲料中牛羊源成分检测的实时荧光定量PCR体系。

本发明饲料中牛羊源成分检测试剂盒，具体构成如下：

1、牛PCR反应液 750μl

2、羊PCR反应液 750μl

3、通用检测PCR反应液 750μl

4、阳性对照 110μl

5、阴性对照 110μl

本试剂盒适用于ABI、Bio-Rad、SLAN等基于Taqman技术原理设计的荧光PCR检测仪。

本发明试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1牛/羊/通用检测PCR反应液：

通过NCBI检索牛、羊(绵羊和山羊)、猪、马、狗、鱼、鸡、鸭、鹅等动物以及小麦、大豆、玉米、高粱、向日葵等植物的线粒体DNA序列，经过DNAMAN生物软件进行同源性分析。依据同源性分析结果，最终选择牛羊线粒体DNA的12SrRNA种内保守，种间特异的区域作为牛羊特异检测的靶序列；选择牛羊线粒体16SrRNA上高度同源保守区域作为牛羊通用检测的靶序列。3个靶序列长度分别是90bp、106bp和90bp，序列如下：

(1)牛特异mt12SrRNA：

GTCACCCTCCTCAAATAGATTCAGTGCATCTAACCCTATTTAAACGCAC

TAGCTACATGAGAGGAGACAAGTCGTAACAAGGTAAGCATA

(2)羊特异mt12SrRNA：

CAGCCTTCCTGTTAACTTTCAATAGACTTATACATGCAAGCATCCACGC

CCCGGTGAGTAACGCCCTTCGAATCACACAGGACTAAAAGGAGCAGG

TATCAAGCAC

(3)牛羊通用mt16SrRNA：

GATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCAA

GAGTCCATATCGACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGAT

依据靶序列，用Primer5软件设计实时定量引物和探针。探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记TAMRA淬灭基团，引物和探针序列如下：

牛：

BRTF 5’-GTCACCCTCCTCAAATAGATTCA-3’

BRTR 5’-TATGCTTACCTTGTTACGACTTGTC-3’

ProbeB 5’-C ATCTAACCCTATTTAAACGCACTAGCTACATG-3’-

羊：

ORTF 5’-CAGCCTTCCTGTTAACTTTCAATAG-3’

ORTR 5’-GTGCTTGATACCTGCTCCTTTTAG-3’

ProbeO 5’-AGCATCCACGCCCCGGTGAGTA-3’

通用检测：

16SRTF 5’-GATCAACGGAACAAGTTACCCTA-3’

16SRTR 5’-ATCCAACATCGAGGTCGTAAAC-3’

Probe16 5’-CGCAATCCTATTCAAGAGTCCATATCGAC-3’

PCR反应液经条件优化后组成为：

0.06U/ul ExTaq、3mM dNTP Mixture、1×ExTaq buffer、0.3mM Forward Primer、0.3mM Reverse Primer、0.2mM Probe，

2阳性对照

由于荧光定量引物扩增序列很短，只有100bp左右，不方便后续实验，因此设计能将这些短片段包括在内的较长片段的3对重叠引物，进一步将这些片段拼接在一起，然后与载体连接。对测序正确的重组质粒进行浓度测定，浓度为1.0×10¹³copies/ml，10倍系列稀释。以浓度为10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴copies/ml的重组质粒作为标准品。重叠引物序列如下：

牛12SrRNA

BOWF1 5’-ATTCGCCAGAGTACTACTAGCAAC-3’

BOWF2 5’-ACCAAACCTACACACTTTCCAGTATGCTTACC-3’

羊12SrRNA

BOWF2 5’-GGAAAGTGTGTAGGTTTGGTCCCAGCCTTCCT-3’

BOWR2 5′-GCACGCATCCGGTATCTAATCCCAGTTT-3′

通用检测

16SrRNA

16SF 5’-CAATACAGGATGGTAGTTTCGGTTGGGGTGAC-3’

16SR 5’-ATAGAAACCGACCTGGATTACTCCGGT-3’

3阴性对照

用经高压灭菌的双重蒸馏水做为阴性对照。

本发明的使用方法包括以下步骤：

1.提取饲料DNA

2.根据检测目的，取相应检测PCR反应液23μl、饲料DNA 2μl(25μl体系)混于一反应管中混匀；反应管可在2～8℃放置3小时。同种方法准备阴性对照和阳性对照反应管。

3.将反应管离心数秒，取出置全自动荧光PCR仪上。

4.先95℃10S，然后再按95℃5秒→60℃40秒，循环40次。

5.质量控制

如试剂质量完好且操作正确，相应的结果应当满足下表条件。

检测结果应达到上表要求的标准，否则实验无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。

每次检测中应设置阴阳性对照品。

以下实验表明本发明的有效性与可行性

实验例1

牛/羊/通用检测标准曲线的建立：

以阳性对照标准品作为模板，分别用牛/羊/通用检测PCR反应液进行实时PCR，得到牛特异扩增曲线和标准曲线(如图1和2)、羊特异扩增曲线和标准曲线(如图3和4)以及牛羊通用扩增曲线和标准曲线(如图5和6)。3条标准曲线的相关系数分别为0.999、0.998和0.998，都大于0.99。

实验例2

牛/羊/通用检测PCR反应特异性实验：

使用牛/羊/通用检测PCR反应液，分别对采集到的包括牛、山羊、绵羊、鹿、马、驴、猪、猫、狗、兔、鱼、鸡、鸭、鹅、鸽子共15种不同动物和小麦、玉米、大豆、高粱、向日葵、花生共6种不同植物来源的DNA进行检测，按照相同的反应体系和反应条件进行实时荧光反应，记录扩增情况。结果只有模板为牛基因组的反应管有良好的扩增曲线，其他物种均扩增失败，说明特异检测牛源成分的实时定量引物和探针特异性好。扩增结果如图7

同种方法验证羊源成分检测实时定量引物和探针以及牛羊源成分同时检测的实时定量引物和探针的特异性。结果表明特异性强。结果如图7、8和9

实验例3

牛/羊/通用检测PCR反应灵敏性实验

购买牛羊肉骨，然后按照肉骨粉加工工艺进行处理：分别将各种动物肉质切成薄片，133℃，3bar，20min。烘干后，用研钵研磨成干粉，过80目筛，4℃封口保存备用。

将牛肉骨粉与玉米粉按不同比例混合，得到牛肉骨粉含量为10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％的6份模拟饲料，每份质量为100克。同种方法制备6份含羊肉骨粉的模拟饲料和6份含牛羊两种肉骨粉的模拟饲料(两种肉骨粉等量混合)。

将制备的18个饲料样品，再选取4个阴性样品(纯玉米粉)，共22份随机编号，在不告知检测人样品中牛骨粉、羊骨粉含量的情况下，用本实验建立方法进行检测，记录检测结果(Ct值大于35为阴性)。结果显示，肉骨粉含量≥0.1％时检测结果与实际相符。说明本方法检测灵敏度可达0.1％。检测结果见表1

表1模拟饲料检测结果

实验例4

牛/羊/通用检测PCR反应重复性实验

进行批内和批间重复实验：以浓度为10⁹、10⁸、10⁷copies/mL的3个重组质粒为模板，以牛引物和探针进行实时定量PCR，每个浓度重复3次，记录Ct值，2周后，再进行同样的实验，记录Ct值，分析两次实验的Ct值。将各浓度标准品的Ct值进行统计学分析，验证实时荧光定量方法的可重复性。同种方法进行羊重复性实验和牛羊通用重复性实验。批内和批间重复实验的变异系数均小于5％，说明本实验建立的实时定量PCR检测羊源成分具有可重复性，稳定性好。实验结果如表4、5、6。

表4牛引物探针检测重复性结果

表5羊引物探针检测重复性结果

表6牛羊通用引物和探针重复性结果

结论：

1三组荧光定量引物和探针设计成功，得到理想的扩增曲线，成功建立了相关系数均大于0.99的牛羊特异检测和通用检测的标准曲线；

2建立了特异性强，灵敏度高，重复性好的牛羊源成分实时定量PCR检测方法，对牛羊基因组的检测灵敏度分别为0.08ng和0.06ng，重复性实验中变异系数CV均低于5％；

3成功设计了动植物18SrRNA内源保守引物和探针，可以检测反应体系是否存在抑制性因素，避免假阴性结果；

4对深加工饲料DNA提取方法进行了优化，可以更好的提取出饲料DNA；

5牛羊肉骨按照欧盟标准(133℃，3bar，20min)处理后配成不同浓度的模拟饲料，使用本研究建立检测方法进行盲检，结果显示本方法对牛源和羊源成分的检测灵敏度都可以达到0.1％，符合国际检测要求的标准；

本发明的积极效果在于：

建立一种快速、灵敏、准确率高，适用于饲料中牛羊源成分检测的实时荧光定量PCR体系。

附图说明

图1为牛特异扩增曲线图；

图2为牛特标准曲线图；

图3为羊特异扩增曲线图；

图4为羊特标准曲线图；

图5为牛羊通用扩增曲线图；

图6为牛羊标准曲线图；

图7为牛引物和探针特异性曲线图；

图8为羊引物和探针特异性曲线图；

图9为通用引物和探针的特异性曲线图；

具体实施方式

实施例1

饲料中牛羊源成分检测试剂盒，具体构成如下：

1)牛PCR反应液750μl；

2)羊PCR反应液750μl；

3)通用检测PCR反应液750μl；

4)阳性对照110μl；

5)阴性对照110μl。

实施例2

试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1牛/羊/通用检测PCR反应液：

(4)牛特异mt12SrRNA：

GTCACCCTCCTCAAATAGATTCAGTGCATCTAACCCTATTTAAACGCAC

TAGCTACATGAGAGGAGACAAGTCGTAACAAGGTAAGCATA

(5)羊特异mt12SrRNA：

CAGCCTTCCTGTTAACTTTCAATAGACTTATACATGCAAGCATCCACGC

CCCGGTGAGTAACGCCCTTCGAATCACACAGGACTAAAAGGAGCAGG

TATCAAGCAC

(6)牛羊通用mt16SrRNA：

GATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCAA

GAGTCCATATCGACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGAT

依据靶序列，用Primer3软件设计实时定量引物和探针。探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记TAMRA淬灭基团，引物和探针序列如下：

牛：

BRTF 5’-GTCACCCTCCTCAAATAGATTCA-3’

BRTR 5’-TATGCTTACCTTGTTACGACTTGTC-3’

ProbeB 5’-CATCTAACCCTATTTAAACGCACTAGCTACATG-3’-

羊：

ORTF 5’-CAGCCTTCCTGTTAACTTTCAATAG-3’

ORTR 5’-GTGCTTGATACCTGCTCCTTTTAG-3’

ProbeO 5’-AGCATCCACGCCCCGGTGAGTA-3’

通用检测：

16SRTF 5’-GATCAACGGAACAAGTTACCCTA-3’

16SRTR 5’-ATCCAACATCGAGGTCGTAAAC-3’

Probe 16 5’-CGCAATCCTATTCAAGAGTCCATATCGAC-3’

PCR反应液经条件优化后组成为：

0.06U/ul ExTaq、3mM dNTP Mixture、1×ExTaq buffer、0.3mM Forward Primer、0.3mMReverse Primer、0.2mM Probe，

2阳性对照

由于荧光定量引物扩增序列很短，只有100bp左右，不方便后续实验，因此设计能将这些短片段包括在内的较长片段的3对重叠引物，重叠引物序列如下：

牛12SrRNA

BOWF1 5’-ATTCGCCAGAGTACTACTAGCAAC-3’

BOWF2 5’-ACCAAACCTACACACTTTCCAGTATGCTTACC-3’

羊12SrRNA

BOWF2 5’-GGAAAGTGTGTAGGTTTGGTCCCAGCCTTCCT-3’

BOWR2 5′-GCACGCATCCGGTATCTAATCCCAGTTT-3′

通用检测

16SrRNA

16SF 5’-CAATACAGGATGGTAGTTTCGGTTGGGGTGAC-3’

16SR 5’-ATAGAAACCGACCTGGATTACTCCGGT-3’

牛12SrRNA、羊12SrRNA和通用16SrRNA的PCR扩增体系均为50ul，0.1U/ulExtaq、5ul 10×ExTaqbuffer、4ul dNTP、1ul引物F1/F2、1ul模板，反应条件为95℃预变性5min、94℃变性30sec、61℃退火30sec、72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min.。扩增后胶回收PCR产物，然后进行2次拼接PCR即可将牛12SrRNA、羊12SrRNA和牛羊通用16SrRNA 3条片段连接在一起。第一次拼接PCR将牛12SrRNA和羊12SrRNA拼接在一起，此片段命名为A，反应体系为50ul，0.1U/ul Extaq、5ul 10×ExTaqbuffer、4ul dNTP、1ul引物BOWF1/F2、1ul牛12SrRNA、1ul羊12SrRNA，反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30sec，61℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min，第二次拼接PCR实验重叠引物BOWF1和16SR将上一步得到的片段A和牛羊通用mt16SrRNA拼接在一起，得到最终的全长DNA。反应体系为50ul，0.1U/ul Extaq、5ul 10×ExTaqbuffer、4ul dNTP、1ul引物BOWF1/F2、1ul16SrRNA、1ul片段A，反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30sec，59℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min，胶回收PCR产物，将其连接到pGEM-T Easy载体上，经测序鉴定后，测定浓度为1.0×1013copies/ml，10倍系列稀释。以浓度为10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴copies/ml的重组质粒作为标准品。

3阴性对照

用经高压灭菌的双重蒸馏水做为阴性对照。

序列表

<110>吉林大学

<120>饲料中牛羊源成分检测方法及试剂盒方法及试剂盒

<130>饲料中牛羊源成分检测

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>90

<212>DNA

<213>Bovine

<220>

<221>牛检测上游引物BRTF序列

<222>(1)..(23)

<220>

<221>牛检测探针ProbeB序列

<222>(26)..(59)

<220>

<221>牛检测下游引物BRTR序列反向互补序列

<222>(65)..(90)

<400>1

gtcaccctcc tcaaatagat tcagtgcatc taaccctatt taaacgcact agctacatga 60

gaggagacaa gtcgtaacaa ggtaagcata 90

<210>1

<211>106

<212>DNA

<213>Ovis sp.

<220>

<221>羊检测上游引物ORTF序列

<222>(1)..(25)

<220>

<221>羊检测探针ProbeO序列

<222>(38)..(60)

<220>

<221>羊检测下游引物BRTO序列反向互补序列

<222>(82)..(106)

<400>1

cagccttcct gttaactttc aatagactta tacatgcaag catccacgcc ccggtgagta 60

acgcccttcg aatcacacag gactaaaagg agcaggtatc aagcac 106

<210>1

<211>90

<212>DNA

<213>Bovine and Ovis sp

<220>

<221>通用检测上游引物16SRTF序列

<222>(1)..(22)

<220>

<221>通用检测探针Probe16序列

<222>(33)..(62)

<220>

<221>通用检测下游引物16SRTR反向互补序列

<222>(68)..(90)

<400>1

gatcaacgga acaagttacc ctagggataa cagcgcaatc ctattcaaga gtccatatcg 60

acaatagggt ttacgacctc gatgttggat 90

Claims

1.一种饲料中牛羊源成分检测试剂盒，具体构成如下：

1)牛PCR反应液750μl；

2)羊PCR反应液750μl；

3)通用检测PCR反应液750μl；

4)阳性对照110μl；

5)阴性对照110μl。

2.根据权利要求1所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)牛/羊/通用检测PCR反应液：

通过NCBI检索牛、羊、猪、马、狗、鱼、鸡、鸭、鹅等动物以及小麦、大豆、玉米、高粱、向日葵等植物的线粒体DNA序列，经过DNAMAN生物软件进行同源性分析；依据同源性分析结果，选择牛羊线粒体DNA的12SrRNA种内保守，种间特异的区域作为牛羊特异检测的靶序列；选择牛羊线粒体16SrRNA上高度同源保守区域作为牛羊通用检测的靶序列；

3个靶序列长度分别是90bp、106bp和90bp，序列如下：

牛特异mt12SrRNA：

GTCACCCTCCTCAAATAGATTCAGTGCATCTAACCCTATTTAAACGCACTAGCTACATGAGAGGAGACAAGTCGTAACAAGGTAAGCATA

羊特异mt12SrRNA：

CAGCCTTCCTGTTAACTTTCAATAGACTTATACATGCAAGCATCCACGCCCCGGTGAGTAACGCCCTTCGAATCACACAGGACTAAAAGGAGCAGGTATCAAGCAC

牛羊通用mt16SrRNA：

GATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTATTCAAGAGTCCATATCGACAATAGGGTTTACGACCTCGATGTTGGAT

依据靶序列，用Primer5软件设计实时定量引物和探针；探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记TAMRA淬灭基团，引物和探针序列如下：

牛：

BRTF 5’-GTCACCCTCCTCAAATAGATTCA-3’

BRTR 5’-TATGCTTACCTTGTTACGACTTGTC-3’

ProbeB 5’-CATCTAACCCTATTTAAACGCACTAGCTACATG-3’-

羊：

ORTF 5’-CAGCCTTCCTGTTAACTTTCAATAG-3’

ORTR 5’-GTGCTTGATACCTGCTCCTTTTAG-3’

ProbeO 5’-AGCATCCACGCCCCGGTGAGTA-3’

通用检测：

16SRTF 5’-GATCAACGGAACAAGTTACCCTA-3’

16SRTR 5’-ATCCAACATCGAGGTCGTAAAC-3’

Probe16 5’-CGCAATCCTATTCAAGAGTCCATATCGAC-3’

PCR反应液经条件优化后组成为：

0.06U/ul ExTaq、3mM dNTP Mixture、1×ExTaq buffer、0.3mM Forward Primer、0.3mM Reverse Primer、0.2mM Probe；

2)阳性对照

以浓度为109、108、107、106、105、104copies/ml的重组质粒作为标准品；

重叠引物序列如下：

牛12SrRNA

BOWF1 5’-ATTCGCCAGAGTACTACTAGCAAC-3’

BOWF2 5’-ACCAAACCTACACACTTTCCAGTATGCTTACC-3’

羊12SrRNA

BOWF2 5’-GGAAAGTGTGTAGGTTTGGTCCCAGCCTTCCT-3’

BOWR2 5′-GCACGCATCCGGTATCTAATCCCAGTTT-3′

通用检测

16SrRNA

16SF 5’-CAATACAGGATGGTAGTTTCGGTTGGGGTGAC-3’

16SR 5’-ATAGAAACCGACCTGGATTACTCCGGT-3’

3)阴性对照

用经高压灭菌的双重蒸馏水做为阴性对照。