CN108796090A - 一种检测食品中羊源成分的试剂盒以及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种供用于检测羊源性成分的基因序列，该序列如SEQ ID NO.1和2所示、如SEQ ID NO.3和4所示、如SEQ ID NO.5和6所示；如SEQ ID NO.7和8所示或如SEQ ID NO.9和10所示的引物。利用这些引物对可以很好的区分肉制品里的具体成分。
Description
技术领域
本发明属于食品检测领域和分子生物学技术领域，具体来说，属于如何采用实时荧光RAA技术并结合特异的引物检测食品中是否含有羊源成分的方法。
背景技术
近年来，针对群众反映强烈的羊肉掺杂掺假问题，2017年3月17日晋中市食品药品监督管理局对餐饮环节火锅店羊肉开展了专项监督抽检，并公布了抽检结果，其中共有八家存在不合格产品的火锅店。对不合格的8批次羊肉样品的检测中，发现有掺猪肉、鸡肉等情况，严重损害了消费者的权益。对于八家店家涉及的不合格产品，已批转涉事餐饮服务单位所在地食药局，要求立即启动核查处置，对不合格产品进行下架等风险控制措施，并依法予以查处。
重组酶介导扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA 解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在 RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。
发明内容
本发明目的在于，提供一组优选后的检测食品中羊源性成分的RAA引物对和一条相匹配的荧光探针。
在一些优选的方式中，本发明提供用于检测羊源性成分的基因序列，该序列如SEQID NO.1和2所示、如SEQ ID NO.3和4所示、如SEQ ID NO.5和6所示；如SEQ ID NO.7和8所示或如SEQ ID NO.9和10所示的引物。优选的，这些引物利用RAA技术对羊源性成分进行检测。
本发明的第二个目的是提供一种含有上述引物组和荧光探针，用于检测食品中羊源成分的试剂盒。在一些具体的方式中，该试剂盒包括RAA必须的试剂以及选自如下一对或者多对的引物序列：SEQ ID NO.1和2所示、如SEQ ID NO.3 和4所示、如SEQ ID NO.5和6所示；如SEQ ID NO.7和8所示或如SEQ ID NO.9和10所示的引物。
本发明的第四个目的是为进行实时荧光定量RAA，检测食品中掺杂羊源成分的含量提供引物对，这些引物对选自如下一些引物对：SEQ ID NO.1和2所示、如SEQ ID NO.3和4所示、如SEQ ID NO.5和6所示；如SEQ ID NO.7和 8所示或如SEQ ID NO.9和10所示的引物。
本发明的技术方案概述如下：一种检测食品中羊源成分的RAA引物组，其中，该引物对选自下列引物对中的一对或者几对：1号引物对、2号引物对、3号引物对、4号引物对或5号引物对组成，所述1号引物对的核苷酸序列分别如 SEQ ID NO.1和2所示；所述2号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和 4所示；所述3号引物对的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.5和6所示；所述4 号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和8所示；所述5号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9和10所示。
在一些优选的实施方式中，所处的引物对为，如SEQ ID NO.3和4所示的序列。
一种检测食品中羊源成分的试剂盒，包括引物对、RAA干粉试剂、A Buffer、 BBuffer、无菌水，所述引物对选自下列引物对中的一对或者几对：1号引物对、 2号引物对、3号引物对、4号引物对或5号引物对，其中，1号引物对核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和2所示，所述2号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和4所示，所述3号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和6所示，所述4号引物对的核酸序列分别如SEQ ID NO.7和8所示，所述5号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9和10所示。在一些优选的实施方式中，所处的引物对为，如SEQ ID NO.3和4所示的序列。
所述的A Buffer为20％PEG；B Buffer为280mM MgAc。
所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、 120ng/μLrecA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶、100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL 肌酸激酶。或者，RAA干粉试剂的组分如下：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶、30ng/μL Exo核酸外切酶，100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L 二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶。
在一些优选方式中，本发明的引物组扩增的目的片段大小如下，1号引物对：165bp；2号引物对：229bp；3号引物对：217bp；4号引物对：207bp；5号引物对：155bp。
有益效果
本发明的试剂盒可以快速、准确、灵敏的检测肉制品中的牛源成分。特别是针对线粒体DNA降解严重的深加工肉制品，因提供引物的目的片段均为小片段，可以很好的进行检测，进而克服了目的片段过大，在实际检测中无法针对熟肉制品进行检测的情况。
附图说明
图1为本发明中涉及的5对引物，即1号引物对分别对5个物种的肉制品基因组DNA进行RAA扩增的结果，M为DL 2000DNA Marker(从下往上，100bp、 250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp)；1-5分别为鸡、猪、鸭、牛、羊的基因组DNA,6为阴性对照，7为阳性对照。
图2为牛基因不同浓度的检测结果图。
图3A-3E为本发明中涉及的1号引物对经深加工的市售羊肉制品基因组DNA的实时荧光RAA扩增结果；其中,图3A为羊肉与阴性对照，图3B为羊肉与鸡肉平行检测；图3C为羊肉与鸭肉平行检测；图3D为羊肉与猪肉平行检测；图3E 为羊肉与牛肉平行检测1-5分别为鸡、猪、鸭、牛、羊肉制品基因组DNA。
图4为羊肉DNA浓度的RAA检测结果图。
图5为熟羊肉的RAA检测结果图。
具体实施方法
以下通过具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1：引物设计
首先从NCBI(National Center for Biotechnology Information，美国国家生物技术信息中心)的Genbank数据库中找到羊与鸡的线粒体DNA全序列、猪的线粒体DNA全序列、鸭的线粒体DNA全序列、牛的线粒体DNA全序列(羊Ovis aries登录号：KP702285.1；鸡Gallus gallus登录号：KM096864；猪Sus scrofa domesticus登陆号：NC_012095.1；鸭Anasplatyrhynchos登录号：KJ833587.1；牛Bos taurus登陆号：AY676864.1；)，进行序列比对。
根据比对结果，利用羊线粒体DNA编码的细胞色素b(cytb)基因序列(KU899149.1)放入Primer5.0中进行引物设计，获得190对不同的引物对进行筛选试验。
在设计引物的同时参考羊(Ovis aries)与鸡(Gallus gallus)、猪(Sus scrofadomesticus)、鸭(Anas platyrhynchos)、牛(Bos Taurus)的序列对比结果，保证设计出的用于扩增羊线粒体基因组片段的引物序列不与鸡、猪、鸭、牛线粒体基因组任意序列匹配。同时考虑到熟肉制品的基因组DNA降解明显，因而所设引物范围为100bp-400bp。并且为了增强引物的特异性，所设引物的GC含量均在 30％-50％之间。
根据以上条件，挑选出100对羊源成分引物进行合成，同时以鸡、猪、鸭、牛、羊全基因组DNA为模板，经常规PCR扩增检验引物特异性与产物量，挑选最优引物对，即本发明所提供的5对引物作为后续的RAA测试和筛选。筛选结果如下：
1号引物对：
F：5’-AATATCATTYTGAGGRGCAACAGTYATYAC-3’(SEQ ID NO.1)
R：5’-AGGGCTGYGATGATGAATGGGARRATAAAGTG-3’(SEQ ID NO.2)
2号引物对：
F：5’-TTGGVTCYCTCCTAGGMATTTGCYTAATYTTAC-3’(SEQ ID NO.3)
R：5’-AARGTRTATGATCCRTARTATAGRCCTCGTC-3’(SEQ ID NO.4)
3号引物对：
F：5’-TYCTTTCAGCAATYCCATATATTGGCACAARC-3’(SEQ ID NO.5)
R：5’-AAKGGRATTTTATCTGTGTCYGATGGAATTC-3’(SEQ ID NO.6)
4号引物对：
F：5’-TCATCATCRCAGCCCTCGCCATAGTYCACC-3’(SEQ ID NO.7)
R：5’-AGTTGTCTGGGTCTCCGAGTARGTCRGGYGTG-3’(SEQ ID NO.8)
5号引物对：
F：5’-TYCACTTTATYYTCCCATTCATCATCRCAGC-3’(SEQ ID NO.9)
R：5’-RGCRCCTARGATRTCTTTAATGGTGTARTAAG-3’(SEQ ID NO.10)
备注：序列中的兼并碱基代码为：M＝A/C，R＝A/C，W＝A/T，S＝G/C， Y＝C/T，K＝G/T，V＝A/G/C，H＝A/C/T，D＝A/G/T，B＝G/C/T，N＝A/G/C/T；
实施例子2：最佳引物对的筛选(特异性及灵敏度验证)
2号引物对：
分别提取鸡、猪、鸭、牛、羊5个物种的鲜肉组织中基因组DNA，提取的方法如下：
将样品(例如：新鲜肉样品)处理成肉末状；取30mg加入1.5mlEP管中；加入500μl裂解液(1M tris-Hcl PH8.0；0.5M EDTA PH8.0；5M Nacl；0.5％ N-Lanroyl Sarc0sine(N-月桂酰肌氨酸)；蛋白酶K(20mg/μl)；RNaseA(10mg/μl)70℃消化0.5-1h或50℃过夜消化，离心(12000r/min，5-15min)，取上清；在上清液中加等体积的酚、氯仿与异戊醇(25∶24∶1)抽提；取400μl水相，加40μlNacl， 1ml冰乙醇，冰上放置30min；离心(12000r/min，5min)，弃上清；用1ml70％无水乙醇洗3次，晾干；加70-100μlTE，静置30min。所提基因组DNA放置于-20℃冰箱中保存，为以后实验使用。
以此为模板进行RAA反应。
RAA反应干粉：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶、 100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶。
反应体系：50μl：
(提取的基因DNA的模板：2.0μl；20％PEG的A Buffer：12.5μl；280mM MgAc的BBuffer：2.5μl；上下游引物分别2.0μl；ddH2O 31μl，以及RAA反应干粉试剂。
50μl反应体系的配置方法：在上RAA反应干粉试剂中添加提取的基因DNA的模板：2.0μl；20％PEG的A Buffer：12.5μl；280mM MgAc的B Buffer：2.5μl；上下游引物分别2.0μl；ddH2O：31μl，然后混合均匀进入如下步骤的反应扩增。反应条件：：37℃下反应30分钟。
反应结果后进行琼脂电泳，结果如图1所示，1-5为鸡、猪、鸭、牛、羊的基因组DNA，6为阴性对照，7为阳性对照；
如图2所示，1-5为羊的基因组DNA浓度(从左到右依次为109.0ng/uL、 10.9ng/uL、1.09ng/uL、109.0pg/uL、10.9pg/uL)的扩增结果，6为阴性对照，7 为阳性对照。M为DL2000DNA Marker(从下往上，100bp、250bp、500bp、750bp、 1000bp、2000bp)。
以上是2号引物的结果图，可以看出2号引物可以区分出不同的肉来源，具有较好的特异性，单纯对于羊肉制品来讲，当DNA浓度为109.0ng/uL、10.9ng/uL、 1.09ng/uL的时候，可以获得检测结果，而其他浓度，没有明显的线条出现，说明检测结果不够明显。
采取同样的体系和方法对其它4对引物做了检测，结果如下：
1号引物对：1号引物的结果与2号引物的结果相似，具体数据略。
3号引物对：灵敏度不好，低浓度的DNA，扩增效率不高，可能是因为序列的匹配度不高。
4号引物对：4号引物的结果与2号引物的结果相似，具体数据略。
5号引物对：特异性不好，不能很好区分个物种。
从以上结果来看，1，2，4号引物对为最佳的引物对，适合用RAA的方法进行新鲜样品的扩增，具有良好的特异性和灵敏度。
实施例子3：ABI7500实时荧光RAA扩增验证(以2号引物对为例)
所对应的探针的序列：
ATGCTGTTGTTGTGTCAGGTGTATAGTG[FAM-dT][THF]T[BQH-dT]GCT AGGAATAGGC(SEQID NO.11)
反应体系：50μl：
提取的新鲜样品的基因DNA的模板(鸡、猪、鸭、牛、羊)分别是：2.0μl； 20％PEG的ABuffer：12.5μl；280mM MgAc的B Buffer：2.5μl；上下游引物分别2.0μl；Probe(探针)0.6μl；ddH2O 28.4μl，以及实时荧光RAA反应干粉试剂。
实时荧光RAA反应干粉：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA 重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶、 30ng/μL Exo核酸外切酶，100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、 100ng/μL肌酸激酶。
50μl反应体系的配置方法：在上述实时荧光RAA反应干粉试剂中添加提取的基因DNA的模板：2.0μl；20％PEG的A Buffer：12.5μl；280mM MgAc的 B Buffer：2.5μl；上下游引物分别2.0μl；Probe 0.6μl；ddH2O 28.4μl，然后混合均匀进入如下步骤的反应扩增。
首先开启ABI7500实时荧光扩增仪(美国应用生物系统公司)进行 20-30min预热，设计以下程序：Holding stage，39℃60s，1个循环；Cycling stage， 39℃30s，40个循环，并收集荧光信号数据。
结果：最后，对扩增结果进行分析，如图3A-E所示，依次为羊与阴性对照平行实验、羊与鸡平行实验、羊与鸭平行实验、羊与猪平行实验、羊与牛平行实验；可以看出，都可以获得特异的羊肉检测扩增曲线，其他物种或者阴性对照都没有特异的扩增曲线出现(为平滑的直线)。
如图4所示，1-3(从上到下)为羊的基因组DNA浓度(从上到下依次(1-3) 为10.90ng/uL、1.09ng/uL、109pg/uL)，最下边为阴性对照。
同时采用类似ABI7500实时荧光RAA扩增验证引物对1和4，结果与2 号引物对类似，具体数据略。
实施例子4：对市售经深加工的羊肉制品进行验证(以2号引物对为例)
1、提取深加工的熟肉羊肉制品的基因组DNA：方法同实施例1中提肉制品的基因组DNA。
2、体系：50μl(模板：2.0μl；A Buffer 12.5μl；B Buffer 2.5μl；上下游引物分别2.0μl；Probe 0.6μl；ddH2O 28.4μl)。各个组分具体组成与实施例3中一样。
3、ABI7500荧光扩增验证
以上所提的基因组DNA为模板，用本发明中引物2进行实时荧光RAA扩增。
反应条件：
第一步：39℃60s；
第二步：39℃30s，40个循环。
最后，对扩增结果进行分析，如图5所示，1为新鲜羊肉作为阳性对照， 2-3为深加工的羊肉制品的基因组DNA的扩增结果(熟肉)，4为阴性对照。
最终，对扩增的产物进行序列测定，或者如下序列：
TTGGCTCTCTCCTAGGCATTTGCTTAATTTTAC(上游)
AGATTCTAACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTATACACCTGACACAACAACAGCATTCTCCTCTGTAACCCACATTTGCCGAGACGTAAACTATGGCTGAATTATCCGATATATACACGCAAACGGGGCATCAATATTTTTTATCTGCCTATTTATGCATGTAGGACGAGGCCTATACTATGGATCATATACCTT(下游)(SEQ ID NO.12)。通过与实施例1中的羊线粒体DNA编码的细胞色素b(cytb)基因序列(KU899149.1-1140bp)进行对比，发现与其中的一段具有100％的匹配度。
同样，利用熟肉制品，对1，4，5号引物对进行RAA测试，发现，1和 5号引物对可以特异扩增出线条，而4号则不能，似乎说明，对于2和1号引物可以同时对新鲜或者熟肉制品的羊肉制品进行检测，而5号则只能对熟肉羊肉制品进行检测，4号只能对于新鲜羊肉制品进行检测，而不能检测熟肉制品中的羊肉成分。具体原因可能是新鲜样品和熟肉样品的DNA具体结构或者其他干扰物质的异同，从而对于不同的引物具有具体的影响，具体机理目前不清楚。
在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本发明，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。
本文中所述或记载的文章、专利、专利申请以及所有其他文献和以电子方式可得的信息的内容在某种程度上全文包括在此以作参考，就如同每个单独的出版物被具体和单独指出以作参考一样。申请人保留把来自任何这种文章、专利、专利申请或其他文献的任何及所有材料和信息结合入本申请中的权利。
Claims (8)
1.一种用于检测羊源性成分的基因序列，该序列如SEQ ID NO.1和2所示、如SEQ IDNO.3和4所示、如SEQ ID NO.5和6所示；如SEQ ID NO.7和8所示或如SEQ ID NO.9和10所示的引物。
2.一种检测食品中羊源成分的试剂盒；该试剂盒包括RAA必须的试剂以及选自如下一对或者多对的引物序列：SEQ ID NO.1和2所示、如SEQ ID NO.3和4所示、如SEQ ID NO.5和6所示；如SEQ ID NO.7和8所示或如SEQ ID NO.9和10所示的引物。
3.一种进行实时荧光定量RAA，检测食品中掺杂羊源成分的含量提供引物对，这些引物对选自如下一些引物对：SEQ ID NO.1和2所示、如SEQ ID NO.3和4所示、如SEQ ID NO.5和6所示；如SEQ ID NO.7和8所示或如SEQ ID NO.9和10所示的引物。
4.根据权利要求1-3之一所述的基因序列，试剂盒或者引物对，其中，所处的引物对为，如SEQ ID NO.3和4所示的序列。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，还包括A Buffer、B Buffer和、RAA干粉试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述的A Buffer为20％PEG；B Buffer为280mMMgAc。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶，100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，还包括探针序列为SEQ ID NO.11所示的序列，和Exo核酸外切酶。
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