CN108796088A

CN108796088A - 一种检测食品中鸡源成分的试剂盒以及检测方法

Info

Publication number: CN108796088A
Application number: CN201710305070.1A
Authority: CN
Inventors: 程奇; 黄震巨; 刘国宪; 鲍传正; 苗丽; 姜娟娟; 韩涌; 曹伟; 张秀平
Original assignee: Hangzhou Public Survey Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Public Survey Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2017-05-03
Filing date: 2017-05-03
Publication date: 2018-11-13

Abstract

一种检测食品中鸡源成分的试剂盒以及检测方法。本发明提供一种供用于检测鸡源性成分的基因序列，该序列如SEQ ID NO.1和2所示、如SEQ ID NO.3和4所示、如SEQ ID NO.5和6所示；如SEQ ID NO.7和8所示或如SEQ ID NO.9和10所示的引物。利用这些引物对可以很好的区分肉制品里的具体成分。

Description

一种检测食品中鸡源成分的试剂盒以及检测方法

技术领域

本发明属于食品检测领域和分子生物学技术领域，具体来说，属于如何采用实时荧光RAA技术并结合特异的引物检测食品中是否含有鸡源成分的方法。

背景技术

近年来，食品安全问题，群众反映越来越强烈、社会关注度也是越来越高。 2017年1月17日，晋中市食品药品监督管理局对餐饮环节火锅店中羊肉展开专项监督抽查，其中8批不合格的羊肉样品中，检测到了鸡肉的成分。2016年6 月，青岛市食品药品监督管理局对其农贸市场内羊肉进行突击检查，发现部分羊肉卷内存在鸡肉成分。质量监督管理局执法人员均依据检验报告对涉事企业进行了相关处罚。一些食品生产企业为了一己私利，偷工减料，以次充好，严重损害了消费者的利益和人们的生命健康。通常对于生牛肉制品我们可以通过色泽、肌肉纹理和味道等进行鉴定，但是对于经加工的熟肉制品我们很难用这种传统方法进行鉴定。

重组酶介导扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA 解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在 RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。

发明内容

本发明目的在于，提供一组优选后的检测食品中鸡源性成分的RAA引物对和一条相匹配的荧光探针。

在一些优选的方式中，本发明提供用于检测鸡源性成分的基因序列，该序列如SEQ ID NO.1和2所示、如SEQ ID NO.3和4所示、如SEQ ID NO.5和6所示；如SEQ ID NO.7和8所示或如SEQ ID NO.9和10所示的引物。优选的，这些引物利用RAA技术对鸡源性成分进行检测。

本发明的第二个目的是提供一种含有上述引物组和荧光探针，用于检测食品中鸡源成分的试剂盒。在一些具体的方式中，该试剂盒包括RAA必须的试剂以及选自如下一对或者多对的引物序列：SEQ ID NO.1和2所示、如SEQ ID NO.3 和4所示、如SEQ ID NO.5和6所示；如SEQ ID NO.7和8所示或如SEQ ID NO.9和10所示的引物。

本发明的第四个目的是为进行实时荧光定量RAA，检测食品中掺杂鸡源成分的含量提供引物对，这些引物对选自如下一些引物对：SEQ ID NO.1和2所示、如SEQ ID NO.3和4所示、如SEQ ID NO.5和6所示；如SEQ ID NO.7和 8所示或如SEQ ID NO.9和10所示的引物。

或者，SEQ ID NO.1和2所示、如SEQ ID NO.3和4所示、如SEQ ID NO.5 和6所示；如SEQ ID NO.7和8所示或如SEQ ID NO.9和10所示的引物在制备利用等温RAA检测鸡源性成分的基因序列的试剂盒中的用途。

本发明的技术方案概述如下：一种检测食品中鸡源成分的RAA引物组，其中，该引物对选自下列引物对中的一对或者几对：1号引物对、2号引物对、3号引物对、4号引物对或5号引物对组成，所述1号引物对的核苷酸序列分别如 SEQ ID NO.1和2所示；所述2号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和 4所示；所述3号引物对的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.5和6所示；所述4 号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和8所示；所述5号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9和10所示。

在一些优选的实施方式中，所处的引物对为，如SEQ ID NO.1和2所示的序列。

一种检测食品中鸡源成分的试剂盒，包括引物对、RAA干粉试剂、A Buffer、BBuffer、无菌水，所述引物对选自下列引物对中的一对或者几对：1号引物对、 2号引物对、3号引物对、4号引物对或5号引物对，其中，1号引物对核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和2所示，所述2号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和4所示，所述3号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和6所示，所述4号引物对的核酸序列分别如SEQ ID NO.7和8所示，所述5号引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9和10所示。在一些优选的实施方式中，所处的引物对为，如SEQ ID NO.1和2所示的序列。

所述的A Buffer为20％PEG；B Buffer为280mM MgAc。

所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、 120ng/μLrecA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶、100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL 肌酸激酶。或者，RAA干粉试剂的组分如下：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶、30ng/μL Exo核酸外切酶，100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L 二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶。

在一些优选方式中，本发明的引物组扩增的目的片段大小如下，1号引物对：257bp；2号引物对：225bp；3号引物对：247bp；4号引物对：245bp；5号引物对：241bp。

有益效果

本发明的试剂盒可以快速、准确、灵敏的检测肉制品中的鸡源成分。特别是针对线粒体DNA降解严重的深加工肉制品，因提供引物的目的片段均为小片段，可以很好的进行检测，进而克服了目的片段过大，在实际检测中无法针对熟肉制品进行检测的情况。

附图说明

图1为本发明中涉及的5对引物，即1号引物对分别对5个物种的肉制品基因组DNA进行RAA扩增的结果，M为DL 2000DNA Marker(从下往上，100bp、 250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp)；1-5分别为鸡、猪、鸭、牛、羊的基因组DNA。

图2为鸡肉基因组不同浓度的检测结果图。1-5依次为：167.0ng/μL、16.7ng/μL、1.67ng/μL、167.0pg/μL、16.7pg/μL；6为阴性对照，7为阳性对照。

图3A-3E为本发明中涉及的1号引物对经深加工的市售鸡肉制品基因组DNA的实时荧光RAA扩增结果；图3A为鸡肉制品基因组DNA与阴性对照，图3B为鸡肉与鸭肉制品基因组DNA平行检测；图3C为鸡肉与猪肉制品基因组DNA平行检测；图3D为鸡肉与牛肉制品基因组DNA平行检测；图3E为鸡肉与羊肉制品基因组DNA平行检测。

图4不同浓度的新鲜的鸡肉DNA的RAA的检测结果图。

图5为生熟鸡肉的RAA结果图，其中1，2为深加工的鸡肉(熟制品)制品的基因组DNA的扩增结果，4为阴性对照，3为阳性对照(新鲜鸡肉)。

图6为牛肉中参假有鸡肉的检测结果图，1为新鲜鸡肉作为阳性对照，2为混合制品中检测出鸡肉成分，3为纯牛肉DNA的扩增结果(序列略)，4为阴性结果。

具体实施方法

以下通过具体实施例对本发明进一步说明。

实施例1：引物设计

首先从NCBI(National Center for Biotechnology Information，美国国家生物技术信息中心)的Genbank数据库中找到鸡与鸭的线粒体DNA全序列、猪的线粒体DNA全序列、牛的线粒体DNA全序列、羊的线粒体DNA全序列(鸡Gallus gallus登录号：KM096864；鸭Anas platyrhynchos登录号：KJ833587.1；猪Susscrofa domesticus登陆号：NC_012095.1；牛Bos taurus登陆号：AY676864.1；羊Ovis aries登录号：KR868678.1；)，进行序列比对。

根据比对结果，利用鸡线粒体DNA编码的细胞色素b(cytb)基因序列(AF028795.1)放入Primer5.0中进行引物设计，获得250对不同的引物对进行筛选试验。

在设计引物的同时参考鸡(Gallus gallus)与鸭(Anas platyrhynchos)、、猪(Sus scrofa domesticus)、牛(Bos Taurus)、羊(Ovis aries)的序列对比结果，保证设计出的用于扩增鸡线粒体基因组片段的引物序列不与鸭、猪、牛、羊线粒体基因组任意序列匹配。同时考虑到熟肉制品的基因组DNA降解明显，因而所设引物范围为100bp-400bp。并且为了增强引物的特异性，所设引物的GC含量均在30％-50％之间。

根据以上条件，挑选出200对鸡源成分引物进行合成，同时以鸡、猪、鸭、牛、羊全基因组DNA为模板，经常规PCR扩增检验引物特异性与产物量，挑选最优引物对，即本发明所提供的5对引物。筛选结果如下：

1号引物对：

F：5’-AYTTCGGCTCCCTAYTAGCAGTMTGCCTCATS-3’(SEQ ID NO.1)

R：5’-TACTCCTGTRTTTCAGGTTTCYTTRTAKAGG-3’(SEQ ID NO.2)

2号引物对：

F：5’-TYATCACAAACCTATTCTCAGCAATYCCCTAC-3’(SEQ ID NO.3)

R：5’-ATGGRATTTTGTCAGMGTYKGATGAGATGCC-3’(SEQ ID NO.4)

3号引物对：

F：5’-TWGGCATCTCATCMRACKCTGACAAAATYCC-3’(SEQ ID NO.5)

R:5’-ACACCTCCAAGTTTGTTKGGGATKGAGCGTAG-3’(SEQID NO.6)

4号引物对：

F：5’-TMCTAGCCYTAGCAGCMTCAGTMCTCATYCTY-3’(SEQ ID NO.7)

R：5’-TAGKGYTCCGATTRWGGGGAAGAGGATWAGTAR-3’(SEQ ID NO.8)

5号引物对：

F：5’-ATCCTACGCTCMATCCCMAACAAACTTGGAGGTG-3’(SEQ ID NO.9)

R：5’-TGAAGTARGARAGGGATGCTATTTGGCCAATG-3’(SEQ ID NO.10)

备注：序列中的兼并碱基代码为：M＝A/C，R＝A/C，W＝A/T，S＝G/C， Y＝C/T，K＝G/T，V＝A/G/C，H＝A/C/T，D＝A/G/T，B＝G/C/T，N＝A/G/C/T。

实施例子2：最佳引物对的筛选(特异性及灵敏度验证)

1号引物对：

分别提取鸡、猪、鸭、牛、羊5个物种的鲜肉组织中基因组DNA，提取的方法如下：

将样品(例如：新鲜肉样品)处理成肉末状；取30mg加入1.5mlEP管中；加入500μl裂解液(1M tris-Hcl PH8.0；0.5M EDTA PH8.0；5M Nacl；0.5％ N-Lanroyl Sarc0sine(N-月桂酰肌氨酸)；蛋白酶K(20mg/μl)；RNaseA(10mg/μl)70℃ 消化0.5-1h或50℃过夜消化，离心(12000r/min，5-15min)，取上清；在上清液中加等体积的酚、氯仿与异戊醇(25∶24∶1)抽提；取400μl水相，加40μlNacl， 1ml冰乙醇，冰上放置30min；离心(12000r/min，5min)，弃上清；用1ml70％无水乙醇洗3次，晾干；加70-100μlTE，静置30min。所提基因组DNA放置于-20℃ 冰箱中保存，为以后实验使用。

以此为模板进行RAA反应。

RAA反应干粉：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶、 100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶。

反应体系：50μl：

(提取的基因DNA的模板：2.0μl；20％PEG的A Buffer：12.5μl；280mM MgAc的BBuffer：2.5μl；上下游引物分别2.0μl；ddH₂O 31μl，以及RAA反应干粉试剂。

50μl反应体系的配置方法：在上RAA反应干粉试剂中添加提取的基因DNA的模板：2.0μl；20％PEG的A Buffer：12.5μl；280mM MgAc的B Buffer：2.5μl；上下游引物分别2.0μl；ddH₂O 31μl，然后混合均匀进入如下步骤的反应扩增。反应条件：37℃下反应30分钟。

反应结果后进行琼脂电泳，结果如图1所示，1-5为鸡、猪、鸭、牛、羊的基因组DNA，6为阴性对照，7为阳性对照；

如图2所示，1-5为鸡的基因组DNA浓度(依次为167.0ng/μL、16.7ng/μL、 1.67ng/μL、167.0pg/μL、16.7pg/μL)的扩增结果，6为阴性对照，7为阳性对照。 M为DL 2000DNAMarker(从下往上，100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、 2000bp)。

以上是1号引物的结果图，可以看出1号引物可以区分出不同的肉来源，具有较好的特异性，单纯对于鸡肉制品来讲，当DNA浓度为167.0ng/μL、16.7ng/μL、 1.67ng/μL、167.0pg/μL的时候，可以获得检测结果，而其他浓度，没有明显的线条出现，说明检测结果不够明显。

采取同样的体系和方法对其它4对引物做了检测，结果如下：

2号引物对：灵敏度不好，低浓度的DNA，扩增效率不高，可能是因为序列的匹配度不高，具体数据略，但是对于新鲜制品却具有特异性。

3号引物对：3号引物的结果与1号引物的结果相似，具体数据略。

4号引物对：4号引物的结果与1号引物的结果相似，具体数据略。

5号引物对：特异性不好，不能很好区分各个物种(新鲜样品)，具体数据略。

从以上结果来看，1，3，4号引物对为最佳的引物对，适合用RAA的方法进行扩增，具有良好的特异性和灵敏度。

以上样品是新鲜的肉质品做的实验和筛选，当选用熟肉制品(可以食用， 9成熟或者10成熟的肉做与上述相同的类似RAA扩增实验，具体数据和过程略)，却发现，1,3,5号引物对具有良好的扩增效果。这证明了，对于新鲜或者熟品的鸡肉却具有不同的特异的引物，原因可能是熟制品的DNA形状发生了一些改变，从而影响序列的扩增，也可能是新鲜和熟肉制品的成分或者干扰不同，对于同一序列却有相反的结果，具体机理不清楚。

实施例子3：ABI7500实时荧光RAA扩增验证(以1号引物对为例)

所对应的探针的序列：

ACGGCGCCTCATTCTTCTTCATCTGTATCT[FAM-dT][THF]C[BQH-dT]T

CACATCGGACG(SEQ ID NO.11)

反应体系：50μl：

提取的新鲜样品的基因DNA的模板(鸡、猪、鸭、牛、羊)分别是：2.0μl； 20％PEG的ABuffer：12.5μl；280mM MgAc的B Buffer：2.5μl；上下游引物分别2.0μl；Probe(探针)0.6μl；ddH₂O 28.4μl，以及实时荧光RAA反应干粉试剂。

实时荧光RAA反应干粉：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA 重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶、 30ng/μL Exo核酸外切酶，100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、 100ng/μL肌酸激酶。

50μl反应体系的配置方法：在上述实时荧光RAA反应干粉试剂中添加提取的基因DNA的模板：2.0μl；20％PEG的A Buffer：12.5μl；280mM MgAc的 B Buffer：2.5μl；上下游引物分别2.0μl；Probe 0.6μl；ddH₂O 28.4μl，然后混合均匀进入如下步骤的反应扩增。

首先开启ABI7500实时荧光扩增仪(美国应用生物系统公司)进行 20-30min预热，设计以下程序：Holding stage，39℃60s，1个循环；Cycling stage， 39℃30s，40个循环，并收集荧光信号数据。

结果：最后，对扩增结果进行分析，如图3A-E所示，图3A为鸡肉制品基因组DNA与阴性对照，图3B为鸡肉与鸭肉制品基因组DNA平行检测；图 3C为鸡肉与猪肉制品基因组DNA平行检测；图3D为鸡肉与牛肉制品基因组 DNA平行检测；图3E为鸡肉与羊肉制品基因组DNA平行检测；

如图4所示，1-3为鸡的基因组DNA浓度。从上到下依次为16.7ng/μL、 1.67ng/μL、167.0pg/μL，阴性对照。

同时采用类似ABI7500实时荧光RAA扩增验证引物对3和4，结果与1 号引物对类似，具体数据略。

实施例子4：对市售经深加工的鸡肉制品进行验证(以1号引物对为例)

1、提取深加工的熟制品鸡肉制品的基因组DNA：方法同实施例1中提肉制品的基因组DNA。

2、体系：50μl(模板：2.0μl；A Buffer 12.5μl；B Buffer 2.5μl；上下游引物分别2.0μl；Probe 0.6μl；ddH₂O 28.4μl)。各个组分具体组成与实施例3中一样。

3、ABI7500荧光扩增验证

以上所提的基因组DNA为模板，用本发明中引物1进行实时荧光RAA扩增。

反应条件：

第一步：39℃60s；

第二步：39℃30s，40个循环。

最后，对扩增结果进行分析，如图5所示，1，2为深加工的鸡肉(熟制品)制品的基因组DNA，4为阴性对照，3为阳性对照(新鲜鸡肉)。

当采用同样的方法进行其它引物对的扩增(鸡肉熟制品中混杂有其他动物的熟肉质品，牛肉，鸭肉，猪肉)，却发现3,5号引物对具有良好的扩增效果，具有显著的特异性，而4号引物却不能很好的检测出，而且当具有其他肉制品混合的时候，却不具有特异性。这说明，1，3号引物对于新鲜或者熟制肉质品都具有良好的区分度，具有较高的特异性和灵敏度。同时，5号引物对于熟制品鸡肉具有良好的区分，而不能对新鲜的肉质品进行区分，而2号引物可以检测出新鲜鸡肉制品，但是对于熟肉鸡肉制品，却不能有好的区分度，不具有特异性。

实施例子5：对市售经掺假的牛、羊肉制品(掺入鸡肉)进行验证(以1号引物对为例)

对人工掺假的牛、羊肉制品(掺入熟鸡肉)进行验证

1、提取人工掺假的牛、羊肉制品(掺入图5所示，1，2为深加工的鸡肉 (熟制品)制品的基因组DNA，4为阴性对照，3为阳性对照(新鲜鸡肉)鸡肉，掺假肉质量比1:1)的基因组DNA：方法同实施例1中提肉制品的基因组DNA。

2、ABI7500荧光扩增验证

以上所提的基因组DNA为模板，用本发明中引物1进行实时荧光RAA 扩增。

反应体系：50μl(模板：2.0μl；A Buffer 12.5μl；B Buffer 2.5μl；上下游引物分别2.0μl；Probe 0.6μl；ddH₂O 28.4μl)。各个组分具体组成与实施例3中一样.

反应条件：

第一步：39℃60s；

第二步：39℃30s，40个循环。

最后，对扩增结果进行分析，如图6所示，1为纯新鲜鸡肉阳性对照，2 为鸡肉和牛肉混合的牛肉制品的基因组DNA(确定是否含有鸡肉，结果是含有鸡肉成分)；3为纯牛肉DNA的扩增结果(序列略)，4为阴性结果。

最终，对扩增的阳性产物(2号中的产物)进行序列测定，或者如下序列：(上游)

ACCCAAATCCTCACCGGCCTACTACTAGCCATGCACTACACAGCAGACACATCCCTAGCCTTCTCCTCCGTAGCCCACACTTGCCGGAACGTACAATACGGCTGACTCATCCGGAATCTCCACGCAAACGGCGCCTCATTCTTCTTCATCTGTATCTTCCTTCACATCGGACGAGGCCTATACTACGGCTCCTA (下游)(SEQ ID NO.12)(灰色突出显示的是1 好引物对)。通过与实施例1中的鸡线粒体DNA编码的细胞色素b(cytb)基因序列(AF028795.1-1140bp)进行对比，发现与其中的一段具有100％的匹配度。

同时，采用5号引物对进行同样的熟肉制品的检测，也发现可以很好的区分鸡肉与其他肉制品的混合。进一步说明了，采用RAA方法可以很好的检测出鸡肉成分以及其他肉制品中参假有熟鸡肉的食品。

在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本发明，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。

本文中所述或记载的文章、专利、专利申请以及所有其他文献和以电子方式可得的信息的内容在某种程度上全文包括在此以作参考，就如同每个单独的出版物被具体和单独指出以作参考一样。申请人保留把来自任何这种文章、专利、专利申请或其他文献的任何及所有材料和信息结合入本申请中的权利。

Claims

1.一种供用于检测鸡源性成分的基因序列，该序列如SEQ ID NO.1和2所示、如SEQ IDNO.3和4所示、如SEQ ID NO.5和6所示；如SEQ ID NO.7和8所示或如SEQ ID NO.9和10所示的引物。

2.一种检测食品中鸡源成分的试剂盒；该试剂盒包括RAA必须的试剂以及选自如下一对或者多对的引物序列：SEQ ID NO.1和2所示、如SEQ ID NO.3和4所示、如SEQ ID NO.5和6所示；如SEQ ID NO.7和8所示或如SEQ ID NO.9和10所示的引物。

3.一种进行实时荧光定量RAA，检测食品中掺杂鸡源成分的含量提供引物对，这些引物对选自如下一些引物对：SEQ ID NO.1和2所示、如SEQ ID NO.3和4所示、如SEQ ID NO.5和6所示；如SEQ ID NO.7和8所示或如SEQ ID NO.9和10所示的引物。

4.根据权利要求1-3之一所述的基因序列，试剂盒或者引物对，其中，所处的引物对为，如SEQ ID NO.1和2所示的序列。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，还包括A Buffer、B Buffer和、RAA干粉试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述逇A Buffer为20％PEG；B Buffer为280mMMgAc。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶，100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，还包括探针序列为SEQ ID NO.11所示的序列，和Exo核酸外切酶。