KR20170135351A

KR20170135351A - 엔테로코커스 종들 중 특정 종 특이적인 프라이머 및 이를 이용한 해당 균주 분리 및 동정 방법 및 그 조성물

Info

Publication number: KR20170135351A
Application number: KR1020160067130A
Authority: KR
Inventors: 김은배; 박종빈; 진귀득
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2016-05-31
Filing date: 2016-05-31
Publication date: 2017-12-08
Also published as: KR101869832B1

Abstract

본 발명은 Enterococcus 균주선발용 Multiplex-PCR 방법에 관한 것으로, 상세히는 Enterococcus 4 species (E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. durans)를 Target으로 하여 Template를 colony로 이용하는 Multiplex-PCR 방법에 관한 것이다. 본 발명은 새로 디자인한 컴퓨터 프로그래밍 분석기법을 이용하여, Enterococcus 각 species에만 특이적으로 가지고 있는 gene을 탐색하고 primer를 제작 및 PCR을 진행하는데 이용하였기 때문에, Sequencing만을 통해서 알 수 있었던 기존 균의 동정을 PCR 방법을 통해 확인함으로써, 간단하고 경제적인 방법으로 Enterococcus 4species(E. faecalis , E. faecium , E. hirae , E. durans)의 균 동정을 할 수 있다. 이 뿐만 아니라 새로 디자인한 프로그래밍 tool을 기반으로 하여 Enterococcus 뿐만 아니라 Lactobacillus, Bacillus 등 다른 genus 상의 분석 및 적용 가능하여 균을 분리하고 동정하는데 대부분의 시간을 쏟는 생균제 및 사료 첨가제 개발에 있어 시간 절약적이며 경제적이다.

Description

엔테로코커스 종들 중 특정 종 특이적인 프라이머 및 이를 이용한 해당 균주 분리 및 동정 방법 및 그 조성물{A Novel Enterococcus species specific primer, a method for isolating and identifying specific Enterococcus strain by using the same and a composition therefor}

본 발명은 엔테로코커스 종들 중 특정 종 특이적인 프라이머 및 이를 이용한 해당 균주 분리 및 동정 방법 및 그 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 엔테로코커스 종들 중 Enterococcus 4 species (E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. durans) 각각에 특이적인 프라이머를 고안하여 이를 이용하여 해당 균주를 분리 및 동정하고, 샘플에서 Multiplex-PCR 방법을 통하여 해당 균주를 분리하고 동정하는 방법 및 이에 필요한 조성물에 관한 것이다.

Enterococcus species 는 많은 식품이나 동물과 사람의 장내, 분변에서 많이 발견된다. 식품 발효에 있어서 유산을 생성하고 독특한 향을 내는 등의 중요한 역할을 하며, 병원균에 대한 항균능력과 내산, 내담즙산 능력 및 높은 내열성으로 사람이나 동물의 생균제나 사료 첨가제로써 사용되고 있다.

하지만, 몇몇 일부 strains 들은 병원성 능력(Vancomycin 저항성 유전자 등)을 가진 유전자를 보유하고 있어, 생균제 및 사료 첨가제로 사용하는데 있어서 어려움이 있다. 또한, 기존 연구결과는 Enterococcus genus level에서의 PCR만 수행되고 있고 Sequencing을 통해 동정하는 경우가 많기에 비효율적이다(Poyart C, Quesnes G, Trieu-Cuot P. Sequencing the gene encoding manganese-dependent superoxide dismutase for rapid species identification of enterococci. J Clin Microbiol. 2000;38(1):415-8.).

중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction : PCR)은 아주 적은 양의 DNA만을 갖고서도 특정 부위의 DNA서열을 기하급수적으로 증폭할 수 있는 간단하고 편리한 방법으로, 증폭하고자 하는 DNA에 특이적으로 결합하는 서로 반대 방향의 두 종류의 프라이머와, 고온에서도 기능적으로 안정한 Taq DNA 중합효소(polymerase)를 사용하여 서로 다른 세 가지 온도의 순환과정인 변성 (Denaturation step), 결합(Annealing step), 연장(Extension step)을 반복적으로 실행함으로써 특정 DNA를 증폭하게 된다.

이에 따라, 대표적으로 알려진 14개의 Enterococcus species 중 Enterococcus 4 species(E. faecalis , E. faecium , E. hirae , E. durans) 각 strain들의 향후 연구수행을 위해 특이적이고 간단한 종의 분리 및 동정 방법이 필요하게 되었다.

[선행 특허 문헌]

대한민국특허공개번호 10-2009-0103550

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 Enterococcus 4 species(E. faecalis , E. faecium , E. hirae , E. durans) 각 strain들의 특이적이고 간단한 종의 분리 및 동정 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 분리 및 동정 방법에 필요한 프라이머 등을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a)분석을 위해 필요한 Enterococcus 종들의 전체 유전자 서열 데이터를 다운로드하는 단계;

b)다운로드 받은 전체 유전자 서열들을 각 유전자 별로 종들(species), 균주(strain), 및 유전자 이름을 부여하여 정리를 한 뒤, 한 파일로 병합시키는 단계;

c)그 다음 글로벌 어라이먼트 소트 서열 서치 툴(global alignment short sequence search tool(GASSST) 분석을 이용하여 각 종들의 균주간의 유전자 비교를 통하여 서열 상동성이 65% 이상인 유전자를 선택하는 단계;

d)그 뒤, 유전자들을 절편화시키는 방법을 이용하여 각 유전자를 절편화시켜, 이 절편화된 유전자 절편들을 GASSST을 이용하여 상기 c) 단계에서 선택된 유전자에 정렬시키는 단계;및

e)이 후, 각 상기 c) 단계에서 선택된 유전자들을 각 종들의 균주의 지놈 데이터와 비교 분석하여 상동성(%)을 기재하고, 분석된 파일을 통해 종들에만 특이적으로 존재하는 상기 선택된 유전자 중, 서열 상동성이 90% 이상인 유전자들을 선별하여 프라이머 디자인에 이용하는 단계를 포함하는 Enterococcus 종들 중 특정 균주에 특이적이고 간단한 종의 분리 및 동정 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 Enterococcus 종들은 E. avium, E. dispar, E. durans, E . gallinarum, E. gilvus, E. hirae, E. italicus, E. mundtii, E. raffinosus, E. sulfureus, E. casseliflavus, E. faecalis, 및 E. faecium인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니하고,

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 Enterococcus 종들 중 특정 균주는 Enterococcus 종들 중 E.faecalis, E. faecium, E. hirae, 및 E. durans인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 d) 단계에서 유전자 길이의 30% 미만의 커퍼리지(coverage)를 보이는 경우 해당유전자는 지놈(Genome) 상에 존재하지 않는 것으로 판단하여 분석에 있어 이용하지 않는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 8에 기재된 서열로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 서열번호 1 내지 2에 기재된 서열로 이루어진 프라이머를 유효성분으로 포함하는 Enterococcus 종들 중 E. faecalis 균주를 특이적으로 동정하기 위한 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 서열번호 3 내지 4에 기재된 서열로 이루어진 프라이머를 유효성분으로 포함하는 Enterococcus 종들 중 E. faecium 균주를 특이적으로 동정하기 위한 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 서열번호 5 내지 6에 기재된 서열로 이루어진 프라이머를 유효성분으로 포함하는 Enterococcus 종들 중 E. hirae 균주를 특이적으로 동정하기 위한 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 서열번호 7 내지 8에 기재된 서열로 이루어진 프라이머를 유효성분으로 포함하는 Enterococcus 종들 중 E. durans 균주를 특이적으로 동정하기 위한 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 서열번호 1 내지 8에 기재된 서열로 이루어진 프라이머를 유효성분으로 포함하는 Enterococcus 종들 중 E.faecalis, E. faecium, E. hirae, 및 E. durans 균주를 특이적으로 동정하기 위한 중합효소 연쇄반응(PCR)용 믹스 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 서열번호 1 내지 8에 기재된 서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 Enterococcus 종들 중 E.faecalis, E. faecium, E. hirae, 및 E. durans 균주를 특이적으로 동정하기 위한 키트를 제공한다.

상기 키트는 하나 이상의 Enterococcus 균을 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 Enterococcus 균 진단 및 분류용 키트이다.

상기 키트의 프라이머는 2개 이상의 프라이머를 하나의 튜브에 포함하는 것을 특징으로 하는 Enterococcus 균 진단 및 분류용 키트이다.

상기 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있으며, 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함하는 것도 가능하다.

이러한 키트를 이용하면, 공통의 PCR 조건을 가지고 본 발명에서 제작한 2종이상의 프라이머 세트들을 모두 동시에 이용한 동시 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 실시하여 1회 PCR을 수행함으로써 검체 내에 존재 하는 2종 이상의 Enterococcus 균을 신속, 정확하게 검출 및 동정하는 것이 가능하다.

또 본 발명은 샘플에서 유전자를 추출하여 상기 유전자를 주형으로 하여 서열번호 1 내지 2에 기재된 서열로 이루어진 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 Enterococcus 종들 중 E. faecalis를 동정하고,

서열번호 3 내지 4에 기재된 서열로 이루어진 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 Enterococcus 종들 중 E.faecium을 동정하고,

서열번호 5 내지 6에 기재된 서열로 이루어진 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 Enterococcus 종들 중 E. hirae를 동정하고,

서열번호 7 내지 8에 기재된 서열로 이루어진 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 Enterococcus 종들 중 E. durans를 특이적으로 동정하는 방법을 제공한다.

또 본 발명은 서열번호 9에 기재된 서열로 이루어진 유전자 또는 이 유전자의 상보적 서열을 유효성분으로 포함하는 엔테로코커스(Enterococcus ) 종들 중 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis )를 특이적으로 동정하기 위한 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 서열번호 10에 기재된 서열로 이루어진 유전자 또는 이 유전자의 상보적 서열을 유효성분으로 포함하는 엔테로코커스(Enterococcus ) 종들 중 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)을 특이적으로 동정하기 위한 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 11에 기재된 서열로 이루어진 유전자 또는 이 유전자의 상보적 서열을 유효성분으로 포함하는 엔테로코커스(Enterococcus)종들 중 엔테로코커 히래(Enterococcus hirae)를 특이적으로 동정하기 위한 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 12에 기재된 서열로 이루어진 유전자 또는 이 유전자의 상보적 서열을 유효성분으로 포함하는 엔테로코커스(Enterococcus ) 종들 중 엔테로코커스 두란스(Enterococcus durans)를 특이적으로 동정하기 위한 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 Enterococcus 균주선발용 Multiplex-PCR 방법에 관한 것으로, 상세히는 Enterococcus 4 species (E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. durans)를 Target으로 하여 Template를 colony로 이용하는 Multiplex-PCR 방법에 관한 것이다.

이를 위해, 여러 Enterococcus species를 NCBI Database에서 다운로드 받는 단계, 다운받은 Database를 이용하여 새로 제작한 컴퓨터 분석기법을 이용하여 data를 분석하는 단계, 분석한 data를 토대로 Enterococcus 4종에 각각 특이적인 유전자를 찾는 단계, 4종에 특이적인 유전자 탐색 후 이를 Primer로 제작하는 단계, 제작된 Primer를 통해 이미 종판별이 완료된 Template를 대상으로 PCR 조건 설정 및 4종의 Primer를 한꺼번에 넣고 PCR을 진행하는 Multiplex-PCR 조건 설정, Template를 colony 로 이용한 PCR 조건 설정,Primer test 후 실생활에 적용이 가능한지 판별하기 위하여 환경 및 식품에서 분리한 종판별이 되지 않은 다수의 colony를 대상으로 한 Multiplex-PCR 조건 단계로 이루어진 것에 특징이 있다.

본 발명은 기존 NCBI(National Center for Biotechnology Information) database에 등록되어 있던 Enterococus species Whole genome sequene 데이터를 기반으로 하여 컴퓨터 분석 뒤, 각 종간 특이적인 유전자를 탐색하고 이후에 이에 대한 primer를 제작한 뒤 PCR을 통해 균 동정 및 분리를 진행하여 간단하고 신속하며, 경제적인 방법을 제공한다.

본 발명은 Enterococcus species 마다 specific 하게 검출한다는 점에 있어서, 본 발명의 방법은 Enterococcus species의 National Center for Biotechnology Information(NCBI)에서 선발한 13종의 Whole genome sequence data를 받는 단계, 모든 받은 데이터 파일들을 합치는 단계, 컴퓨터 분석을 통하여 합친 데이터 파일을 각각의 gene들에 이름을 부여하여 각 species와 비교, 분석하는 단계, 분석한 데이터를 토대로 specific 한 gene을 찾는 단계, gene을 대상으로 primer 디자인을 하는 단계, 디자인 후 실제 primer가 정상적으로 작동하는지 기존에 검출된 균주대상/환경에서 분리한 알 수 없는 미생물 균주 대상으로 PCR을 진행하여 이를 확인하는 단계로 이루어져 있다.

본 발명은 새로 디자인한 컴퓨터 프로그래밍 분석기법을 이용하여, Enterococcus 각 species에만 특이적으로 가지고 있는 gene을 탐색하고 primer를 제작 및 PCR을 진행하는데 이용하였기 때문에, Sequencing만을 통해서 알 수 있었던 기존 균의 동정을 PCR 방법을 통해 확인함으로써, 간단하고 경제적인 방법으로 Enterococcus 4species(E. faecalis , E. faecium , E. hirae , E. durans)의 균 동정을 할 수 있다. 이 뿐만 아니라 새로 디자인한 프로그래밍 tool을 기반으로 하여 Enterococcus 뿐만 아니라 Lactobacillus, Bacillus 등 다른 genus 상의 분석 및 적용 가능하여 균을 분리하고 동정하는데 대부분의 시간을 쏟는 생균제 및 사료 첨가제 개발에 있어 시간 절약적이며 경제적이다.

도 1은 본 발명의 각 4 종의 Primer set 의 PCR Condition을 조절하기 위한 Annealing temperature Gradient PCR 결과를 나타낸 사진, 도 1에서 Enterococcus faecalis (A), Enterococcus faecium (B), Enterococcus hirae (C), Enterococcus durans (D)그룹을 나타내고, Mr은 사이즈 마커를 의미; 100bp plus DNA ladder (Bioneer, Korea):
도 2는 본 발명의 4종의 Primer set을 모두 섞은 뒤 target 종/ 다른 종에 대한 반응이 있는지 확인한 Multiplex PCR 결과. Mr는 사이즈 마커를 의미; 100bp plus DNA ladder (Bioneer, Korea)
도 3은 PCR Template를 colony/gDNA 로 사용했을 때의 실험결과 비교 전기영동 사진. 왼쪽 4개의 Band는 Template를 colony로 사용했을 때, 오른쪽 4개의 Band는 Template를 gDNA 로 사용했을 때의 전기영동 사진: Negative는 시약의 오염성여부를 확인하기 위하여 추가로 전기영동 진행하였음.
도 4는 제작된 Enterococcus 4 species primer sets를 이용하여 실제 적용한 전기영동 결과. Multiplex PCR (4가지 Primer sets를 모두 섞음) 로 진행하였으며, (A) 는 E. faecalis , (B)는 E. faecium, (C)는 E. hirae, (D)는 E. durans를 나타냄. 각 Template들은 식품 유래인 청국장, 된장, 닭고기, 돼지고기 등 과 분변 sample인 닭 분변, 말 분변, 소 분변 등 다양한 환경/식품 유래 sample들을 통하여 colony를 분리하였음.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

본 발명을 순서에 따라 구체적으로 기재하면 다음과 같다.

분석을 위해 필요한 Enterococcus species 의 whole genome sequence 데이터를 이용하기 위하여 National Center for Biotechnology Information(NCBI) 의 genome 검색란에 Enterococcus 칸을 검색, WGS 데이터를 다운로드 한다. 이 발명에서는 총 39개의 데이터 (E. avium 1 strain, E. dispar 1 strain, E. durans 2 strains, E. gallinarum 3 strain, E. gilvus 1 strain, E. hirae 3 strains, E. italicus 1 strain, E. mundtii 4 strain, E. raffinosus 2 strain, E. sulfureus 1 strain, E. casseliflavus 6 strains, E. faecalis 6 strains, E. faecium 8 strains)를 이용하였다. 모든 받은 Whole genome sequence 들을 각 gene 별로 species , strain, gene,이름을 부여하여 정리를 한 뒤, 한 파일(Enterococcus.gbk)로 병합시켜 준다.

그 뒤 GASSST 분석(Global Alignment Short Sequence Search Tool의 약어, sequence를 alignment 해주는 방법으로, 짧은 DNA Sequence 들을 align 하는데 이용. opensource. Rizk, G., & Lavenier, D. (2010). GASSST: global alignment short sequence search tool.　Bioinformatics,　26(20), 2534-2540. 참조)을 이용하여 각 species들의 strain간의 gene 비교를 통하여 Sequence homology가 65% 이상(임의값, 최소 Sequence homology가 65%이상인 경우 각 species 내에서 공통적으로 존재한다고 판단.)인 gene을 대상으로 Ortholog 라는 이름을 부여, gene별로 Ortholog.xxxxx(x는 숫자, 00001부터 시작)형식을 부여하였다.

그 다음, Genome들을 fragmentation 시키는 tool(C언어중 하나인 Perl을 이용하여 직접 디자인 ; 함수를 이용하여 각 sequence를 읽고 얻고자 하는 bp를 입력하여 그 간격을 설정하면 자동으로 파일을 읽어 Genome sequence를 fragmentation 시켜줌)을 이용하여 각 gene을 7bp간격으로 50bp로 만들었으며, 이 잘라진 gene fragments을 GASSST을 이용, Ortholog gene에 align시켰다(homology >65%). 이 후, gene 길이의 30% 미만(임의값, Sequence homology가 60~100%인 경우에는 Genome상에 존재하는 것으로 판단하는 최대 범위이며 최소 40~50% 까지는 coverage가 있다고 할 수 있다. 하지만 40%이하의 coverage를 보이는 경우, sequencing의 오류, insertion sequence)의 coverage를 보이는 경우 해당유전자는 Genome상에 존재하지 않는 걸로 판단, 분석에 있어 이용하지 않았다. 각 Orthologs 들을 각 species의 strain의 Genome data와 비교 분석하여 homology(%)를 기재하였고, 다음 분석에 이용하기 편리하기 위해, Excel파일로 정리하였다. 분석된 파일을 통해 Species에만 특이적으로 존재하는 Orthologs 중, sequence homology가 90% 이상(NCBI, 등 유전자 데이터 분석의 경우, Sequence homology가 90% 이상인 경우에는 입력한 값과 데이터의 값이 같다고 본다. 즉, 같은 종이라고 판단. 임의값)인 orthologs들을 선별, Primer를 디자인하는데 이용하였다.

Primer 디자인의 경우, 오픈소스인 Primer3Plus를 통하여 Primer디자인을 진행하였으며, species 별로 PCR에서 차이를 볼 수 있도록 Product size를 조절하였다. 이를 통해 E. faeclis(1209bp), E. faecium(1032bp), E. hirae(442bp), E. durans(231bp) 4종의 Primer를 디자인하였으며, Primer가 종 특이적인지를 판별하기 위하여 NCBI의 Primer-BLAST tool을 이용하여 종 특이성을 판별하였다. 이 후, 실제 환경에서 적용 가능한지를 알아보기 위하여 Primer들을 주문, 제작하였으며 최적의 PCR 조건을 성립(도 1, 도 2, 도 3의 설명 참고.)하였다.

한 번의 PCR을 통해 4종을 검출할 수 있도록 하기 위하여 4개의 종의 PCR 조건을 모두 동일하게 맞추어 Primer들을 섞었고, Entercoccus positive sample 과 환경에서 분리된 sample들을 통하여 Primer 가 종에 특이적으로 작용하는 것을 확인하였다.

표 1은 in silico 분석을 통해 Enterococcus species의 Homology 를 분석하였으며 이를 토대로 한 종에서 각 strain 간의 homology가 95% 이상임과 동시에 다른 종에서는 Sequence homology가 10% 이하인 경우를 선별하였고, 최종 표와 같은 gene을 확보할 수 있었다. (Sequence homology가 95% 이상인 경우 높은 확률로 이 sequence가 종 내에 공통적으로 존재한다고 판단하고, 10% 이하인 경우 이 sequence가 공통적으로 존재하지 않는 sequence라고 판단하였음)

이를 NCBI Sequence search tool[입력한 Sequence와 기존 NCBI에 저장되어있는 데이터와 Sequence homology, identity 비교.]인 Blastn-nucleotide에 분석한 결과, 입력한 값의 비슷한 sequence들의 species 정보를 찾을 수 있었으며, 각 정보들의 seuqence homolgy와 identity는 95% 이상의 일치성을 볼 수 있었다. 이를 토대로 Primer 디자인 tool인 Primer3Plus[Steve Rozen　and Helen J. Skaletsky (2000)　Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.　In: Krawetz S, Misener S (eds)　Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology.　Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386]를 이용하여 Foward primer와 reverse primer를 디자인하였고, 디자인한 프라이머가 어떤 종에 일치하는지 분석가능한 NCBI의 Primer-BLAST를 이용함으로써 in silico 분석을 진행하였다. 분석 결과, 표1의 디자인한 프라이머들이 각 Strains 들에만 특이적으로 검출됨을 확인할 수 있었으며, 이 분석 결과를 토대로 프라이머 디자인을 확립하였다. in vitro를 통해, 도1, 도2, 도3, 도4 와 같은 실제 분석을 통하여 제작된 Primer들이 각 종에만 특이적으로 증폭이 되며 발현되는 것을 확인하였기에, 이 프라이머 서열이 종 특이적으로 사용될 수 밖에 없다고 판단하였다.

상술하면 다음과 같다.

각 Primer set에 대한 최적 PCR 조건을 맞추기 위함과 동시에 4종의 균주들을 한번에 검출하는 Multiplex PCR 방법을 고안하고자 PCR 과정 중 Annealing temperature 값을 조절하기 위하여 Gradient PCR을 실시하였다. PCR mastermix 의 경우, i-Taq PCR mastermix (intron Biotechnology, Korea) 제품을 이용하였으며, 최종 18ul volume 중 12.98ul의 Autoclaved Distilled Water, 2ul 10X PCR buffer, 1.6ul dNTP(200 uM), 0.3ul MgCl₂, 0.12ul i-Taq polymerase (5 unit/ul), 1ul specific primers (foward primer와 reverse primer 각각,10pmole/ul) 을 넣어주었으며, 만들어진 mastermix를 PCR tube에 gradient PCR 조건을 위하여 8개씩 분주하였다. KACC, KCTC에서 얻은 E. faecalis (실험실 자체 분리), E. faecium KCTC 13225, E. durans KACC10787, E. hirae KACC 10779 균주들의 genomic DNA를 1ul(30ng/ul) 분주 한뒤 mixing 하였으며, 각 8개의 Annealing 온도 조건(64℃, 62.9℃, 61.2℃, 58.5℃, 55.3℃, 52.7℃, 51.0℃, 50℃) 에 맞도록 PCR machine의 설정을 조절하였으며, 그 외 PCR 조건은 Pre-denaturation 64℃ 3분, denaturation 64℃ 1분, extension 단계 72℃ 1분의 단계로 진행하였다.

도 1의 그림의 A, B, C, D는 각각 E. faecalis (A), E. faecium (B), E. hirae (C), E. durans (D) 의 전기영동 결과를 나타낸다. Gradient PCR의 결과, A, C, D 의 경우 모든 Annealing 온도 조건에서 디자인한 Primer의 band(표1 참고.) 가 하나의 밴드로 발견되었다. 하지만, B의 E. faecium의 경우, 원하던 band size인 1032bp 에서 진한 band가 발견되었으나, 58.5℃ ~ 50℃ 조건의 경우, 900bp 와 100bp 에서도 band 가 발견됨을 확인할 수 있었다. 이 결과를 바탕으로, 네 종 모두에게 맞는 PCR 조건을 확립하였고 이 결과를 토대로 Annealing 온도의 값을 64℃로 설정하기로 하였고 향후 진행한 도 2, 도 3, 도 4의 PCR도 이 설정된 값을 통해 PCR을 진행하였다.

도 1에서 디자인한 PCR을 이용하여 4종의 Primer set을 모두 섞어 원하는 타겟 균주 4종과 같은 종인 E. mundtii ATCC43186, E. gallinarum ATCC49573, E. silesiacus KACC14591, E. termitis KACC14592 균주 4종과 다른 속(genus)에 속하는 유산균의 일종인 Lactobacillus salivarius EBK00100, Lactobacillus reuteri EBK00025 를 대상으로 PCR template로 선정하여 디자인된 Multiplex-PCR 조건이 다른 종 및 속에 반응을 보이는지 PCR 및 전기영동을 통해 확인하였다.

도 2의 결과, Mr을 제외한 왼쪽부터 4개 Lane의 결과는 디자인한 PCR에 적합한 gDNA (E. faecalis JB00071, E. faecium KCTC13225, E. hirae ATCC10541, E. durans KACC43185)를 template로 하여 반응시킨 결과이다. 도 1의 결과와 마찬가지로, 4개의 종에서 모두 원하던 사이즈(사이즈는 표1 참고.)의 밴드가 떴음을 확인할 수 있다. 그 뒤 Lane인 E. mundtii ATCC35665 ~ L. reuteri EBK00025의 경우, 디자인한 PCR에 반응시켜 전기영동한 결과, 밴드가 확인되지 않음을 알 수 있었다. 따라서 디자인한 Primer set과 PCR 조건이 다른 속과 종에는 반응이 없고 원하는 종에만 선택적으로 반응이 일어남을 확인할 수 있었다.

도 3은 시간절약적 및 경제적인 측면을 위해, 디자인한 Multiplex-PCR이 상업적인 kit를 이용하여 뽑은 gDNA (시간소요, 시약 및 재료비 소요 등)를 이용하지 않고 colony 자체만을 대상 template로 사용하였을 때도 gDNA를 이용한 결과와 다른 점이 있는지를 확인하고자 한 결과이다.

Colony sample을 이용한 Multiplex PCR의 경우, 기존 Enterococcus 4종의 stock 에서 상업배지를 이용하여 streaking 한 뒤 얻은 colony를 물과 희석하여 이미 만들어진 PCR mastermix에 소량 (약 1ul) 투입 후 기존 도 1, 도 2 방법과 마찬가지로 PCR을 진행하였다. gDNA sample의 경우, 도 1, 도 2의 방법과 모든 sample조건, PCR 조건이 같도록 하였다. 도 3 의 전기영동 결과는 colony를 template로 이용한 전기영동 결과(왼쪽 Lane부터 Mr을 제외한 E. faecalis colony, E. faecium colony, E. hirae colony , E. durans colony 4개 Lane)와 gDNA를 template로 이용한 전기영동 결과(왼쪽 7번째 Lane부터 ; E. faecalis gDNA, E. faecium gDNA, E. hirae gDNA, E. durans gDNA)를 나타낸다. 두 전기영동 결과를 비교했을 , 밴드의 사이즈나 진하고 약함의 차이가 별로 없음을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 균주에서 gDNA를 추출하지 않고 colony만을 이용하여도 PCR이 정상적으로 반응함을 알 수 있었다. 따라서 시간 제약, 경제적 제약이 따르는 실험실 환경에서의 신속한 균의 분리 검출이 가능하다고 판단한다.

도 4에서는 디자인한 Multiplex PCR이 실제 환경에서 분리된 colony에서도 적용되는지를 확인하기 위하여, 이미 Enterococcus Agar(MB Cell, Korea)를 통하여 1차적으로 분리된 속/종 명이 판별되지 않은 colony sample 20종을 선발하였고, 디자인한 Multiplex PCR에 도 1, 도 2, 도 3과 같은 조건으로 진행하였으며 판명된 균주들은 전기영동상태에서 보기 쉽도록 다시 정리하였다. 도 4는 각각 E. faecalis (A), E. faecium (B), E. hirae (C), E. durans (D) 를 나타내며 A의 colony sample 5개는 각각 YS00632 , YS00768, YS00778, JB00070, JB00073, JB00007 이며, B인 E. faecium 의 경우, JB00160, JB00148, JB00192, JB00056, JB00008 이다.

Gene	Species	Primers		PCR Product size (bp)
		Pair	Sequence (5'→ 3')
6-aminohexanoate-cyclic-dimer hydrolase (EC 3.5.2.12)	E. faecalis	F2	+ACCAATGTTGGCACAAGAAA(서열번호 1)	1209
		R2	-TTTCGTTCAAGCGGTCTTTT(서열번호 2)
FIG00628976: hypothetical protein	E. faecium	F1	+ACGGAGATCGTGGATTCAAA* (서열번호 3)	1032
		R1	-CGTACGGGAAGTGATTCGAC* (서열번호 4)
Rhamnulokinase (EC 2.7.1.5), hypothetical protein, L-fuculokinase (EC 2.7.1.51)	E. hirae	F4	+AGAATCTTCGATCGCCTCAA (서열번호 5)	442
		R4	-TTGGATCTGTTGGATCGTGA (서열번호 6)
hypothetical protein	E. durans	F3	+TGGGTCTCAAGCCATTCC(서열번호 7)	231
		R3	-GGCTGGTTGTTCCACAGAG (서열번호 8)

표 1은 본 발명의 Primer design에 이용된 Species 별 유전자정보 및 primer 정보

<110> University-Industry Cooperation Foundation, Kangwon National University <120> A Novel Enterococcus species specific primer, a method for isolating and identifying specific Enterococcus strain by using the same and a composition therefor <130> P16-0241 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 accaatgttg gcacaagaaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tttcgttcaa gcggtctttt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 acggagatcg tggattcaaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cgtacgggaa gtgattcgac 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 agaatcttcg atcgcctcaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ttggatctgt tggatcgtga 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tgggtctcaa gccattcc 18 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggctggttgt tccacagag 19 <210> 9 <211> 2265 <212> DNA <213> E. faecalis <400> 9 atgaagaagt cgattttgtt caaaaagtta gggattattt tattaattag ccaaacactg 60 gtaggggtac caatgttggc acaagaaagt atactagaaa caaccgttca aacagagacg 120 gaatcagtaa caacagaaac cagtcagact gtagctaact tggaatctga aactactagc 180 caaacggtga tgcaggaaaa agaatcctct tcggcaatcg ccgaaagcag tagccgaaat 240 gtggttgcag taaccactga aaccacaaat gagatacaaa atagtgatac agatggaaaa 300 gctgtttctg cagagagtgt tttttcagaa gcagattata aacaagcaac tgcactggag 360 ttagcaactt tagtaagaga aaaaaaggtg acgagcgaag aattagtaaa aattgcgttg 420 gccatcacta aacgtgaaaa tcctacatta aatgcggtca ttactttacg agaagaagcg 480 gctttgacag aagcaaaagc tttacaagat acaggtcaac catttctagg tgtgccgctc 540 ttactaaaag ggttaggaca atccttgaaa ggtgaaagca acacgaacgg ttttggtttt 600 ctccaagatc aagtagctgg tgggacatcg acctttgtca aagcactaca aaatgccgga 660 ttcataatca ttggtcaaac gaattatcca gaattaggtt ggaagaatat ttcagattca 720 aagttatatg gcgtttccgt caatccatgg aatcctaacc attattcagg tggttcttca 780 ggcggagcgg gtgctagtgt cgccgcggca tttgttccca ttgcttctgg aagtgatgct 840 ggtggctcta tccgcatccc tgcttcttgg acaggcaccg taggcttgaa accttctaga 900 ggagtaatca ttggtaattc taatagtgca aaaggtcaaa ctgttcactt tggtttaagt 960 cgaaccgtgg cggatacaaa tgcattattt gaaaccttat taaccaaaaa agatcttcct 1020 gcgggacatt taagtcaagc gcaacccatt gcttatacaa cagaatcccc tgccggaacg 1080 cctgtaagtg ccgaagcaaa agaggcggtc gctgaagctg ttgctttttt aaaagaccaa 1140 gggtacacat tggttgaagt gaagcaccct gttgatgggg aacgtctaat gaaaaattat 1200 tatactgtag ctgctggctc agcaggaatt gccgatttta tggcgcggca gaaattaaaa 1260 agaccgcttg aacgaaatga tgtagaactg ttaacatggg cgctttttca aacaggaaaa 1320 aatataacga gtgaagagac aactgcggct tggacagata ttgctttaca agcacaagcg 1380 atggacgaat tttatcaaca gtatcctatc ttattaacac caacgacggc tgccacggca 1440 cctagtattg ataatccgtt actaaaacca gaacatgcag cacagatgga aaaaattgat 1500 caattgtcac cagcagaaca aaaacaattg atttatgacc aatggctgac ggcgttcaca 1560 tatacaccgt ttacacaaca agcaaattta tttggacatc cagcattaag tgtaccaact 1620 tacgtttcaa aagaaggact gcctttgggg attcaattta atagtgcatt aaatgaagac 1680 cgaacattgc tacaattagg tgctttattt gaaaataacc acaagataaa tcaaccacat 1740 gtagaagaac cagacaaaga caaagaacca gatgcaagtg gcgaaccaga aaaagacaaa 1800 gaaccaaatg caagtggcga accagacaaa gacaaagagc cagatgcaag cggcgaacca 1860 gacaaagaca aagaaccaga tgcaagtggc gaaccagata aagataaaga actagataca 1920 agtggcgaac cagaaaaaga caaagaaaca aaaacaagtg aaggaccaat cgaaggaaaa 1980 gatcaaaacc aaaaccaaaa ccaaaaccca gacaaagctg gaaaaactac tagtgagtca 2040 tccttagata attcgctgaa ttcatcagca aatcagggaa ccaaatcaac agaaagtacg 2100 catgcttttt ctaataaaag tatgattggg aaacaagaac agcttcccaa aaaagtatta 2160 ccaaaagcag gtgcagaagt acctagtact ttctggattg ttttaggagg agctttctta 2220 gtaacgagtg gaacgattta tataaggaaa actagaaaac gataa 2265 <210> 10 <211> 1479 <212> DNA <213> E. faecium <400> 10 atgaagttgg attaccttat cgaagaggaa gatagagaaa aactgctgtt agccagatat 60 ttagaatttg agaaaaagaa ttacgtcgtg ttgtctaagt tatatgaaac attaggttta 120 tctaaattta aaacaagaaa ttatatcata gaattaaata aagaattttc tgaattcaaa 180 tcaaagccag agatccaaat ctcagaagaa ggagagattc atgttgaacg gctaaatttg 240 acggatatca aaaatttaag aagaatctac tttcaacgat caaaaattgc tcgactgtta 300 acggagatcg tggattcaaa agtaacaatt gaaaaatttg cagagaacca ttttttaagc 360 atatcaagag catatgtaaa aagaagagaa ttagtctctt ttcttgaaca gcatcaaata 420 aagttaaaga aaaacatatt agttggggaa gaaataaaca tacggaacgt attatttggg 480 gtatattttg gggtctttaa tggtttttct atgccattta gagaaagcgt catgaatgaa 540 gcaaaaagta tcgtgcaata ttttgaatat ctgttcaatt taaagttgtc tgccacaaag 600 cgaatcaaat tcaatttgct aactactgtt agtttgttga ggatttatgg aaatcaacca 660 ataggaaaac gtttcttttc agatgaatac tttaagagct cagaaggaat gaagattatt 720 aaggatttat cgcatatttc ttttctacat atccctaaag agcagattat tgatgagatt 780 tcttatatca tgttattttt gattacggaa gaagaatttg aattagatgg tgcgtttgga 840 cttgcagaag ctcatttcca tgatatccat atgattagtc aaaaaatgac agtggaattg 900 attgatcaat taccattttc aactgaagtt tctgaagaag aaagactcca tatacgaaaa 960 gaacttcgta tggggatgat gcatgtcaat cggaaaaatt ggatattcga ctttgagatg 1020 actagtttta cgtctaaaaa gcagttgcag tttttcttcg aaacgtatcc aatattcagt 1080 acagcgatcc aaaatgtcat acaagataat aaacactatt tcttggaaaa agatgaacgt 1140 ttcatgattc gcttatttta tgattatctt tttttattgg tcggtatttg tccagtctct 1200 tattttgaat caccaatcca tgtctgtatt gatttttctc aaggatctgc ctataccgct 1260 tatattattt ctcaagtgaa gggatttaaa aattacaata ttgtgattga aagtcgaatc 1320 acttcccgta cggatattta tttatctgat tgtttgcttg aaaaattcaa caaagagcag 1380 ataatatgga aaaatccgcc gacaccagat gactgggaat attttgggaa tatcattatc 1440 agagaaaaaa atagacattt aactgaaaaa atcagctaa 1479 <210> 11 <211> 1458 <212> DNA <213> E. hirae <400> 11 atgagtacga tcttagcctt tgatttaggt gctaccagtg cgcgaggtat cgttttttcc 60 ttaatgaatg gtcaaatcaa ggaagaaaaa gtttatcgtt tcactgatta ccaagtgatt 120 gaccccaaca aagatgaaat ccattggaat attgagaaaa tcatgacgaa tatcaaggaa 180 atcattactt tagcaactac agaatatgtc attgaaagta tcggcatcga tacatggggc 240 tgtgattttg gtttgataga taaaaaagga cagctagtgc taccaccact ttgctatcaa 300 actatgctga aagaacctaa tttacattat ggtggggatt taccaactca ctttcacgaa 360 cgtacaggga ttccaaatgc atcgatcaat accagttccc aactactcta cttgaaagaa 420 cattatcctg agcagctaaa taaagcaagt actcttttga tgatgcctga tctgatccat 480 tttttattaa caggtacgat cttaacagaa tcttcgatcg cctcaacgag tcaattattc 540 gatatcgata aacatcaatg ggcatccgac cttattgaac aattagggat ttccccttcc 600 ttgttctcaa cgatcgttct tccatataca aaaatcggtt tgataaatct agccgaaaaa 660 caacttccga ttcattcggt gatgtcccat gatactgcta gtgcgatctt tgctttacca 720 accaacgatc actcttgttt ctttttatcc tctggcacct ggtctgttct aggagaaaaa 780 tcagaaagag gaattttggt caatcaccca ttagatacga actattctta tgaacaagcc 840 ggtgatggaa aaatattaaa actcaaaaac atgttaggaa tgtggttcat tgaggaagct 900 ttagcgttca gcaatcaaac ccagtcaatc acgatccaac agatccaaga catgctactt 960 actgctgagc cgattcattt tttctttgat aacgaacatc ctgaattttt gagtaaaggt 1020 caatttgtaa aaaaattgca gcaatacgga aaccaacatc atttttcatc aattgaagag 1080 ccacaacaat tgtttttagc catctatcaa aatctagcat ttaaatacgc tgaaacgttc 1140 gataaattag caggttccgc tcctttcact aagctatatt tatttggtgg tgggagtaaa 1200 tcacactttt tgactcaact aacagccaat ttaacgcaaa cgacgataga ggtctgctat 1260 tctgaaaatt cagctttagg taatgcgtta gcccaatttt tagcgatcaa agcaatcaaa 1320 aatagagagg aattggtgac actcgtcaca gaaaattatc aaccaatttc ttttttccca 1380 gaagtttcga caccctttga acaaacgtac atcaactata aacaatttat gaggaggaat 1440 atcaatgaat tatcctaa 1458 <210> 12 <211> 1635 <212> DNA <213> E. durans <400> 12 atggcatcta tcccatattc taatgatagc ttattgcggt atactacact aaaagccatg 60 gaaagagagt atcaaaatct caaagaaaaa acgcaagaaa taaaaccaca gctcacacga 120 aaagcctatc gaaagctgaa agcccgatca tcaacagaag aactgacagc actagtagaa 180 aaacttcaag caaagtcaga cattcaactt gattcatata tagcgggtat agatagacag 240 gatatcccaa acgaaataaa acgtatggat gatgagttga aaaaaatcag aaaggtctat 300 ttggaactga cagcaatcga agctaaatta tcaggttatc cttttaaaga aaaatacgta 360 aaaaaatctg tcgaagtgaa ggaaattatc ggagaaaagc agaaaaaaga agaggagcta 420 agagcactct gcggaaccag tcgcccattt actaaaaccg gacgaacaaa attgaactca 480 accgccaaaa aatctaaaga agatcattcg gttagaaata gtggtattga accaaaaccg 540 gtgacattga tccctagaaa tgacatttgg gtgcattacc aagacaaaca ttataaaaaa 600 gaaatagaga cttactctag atatataaaa aatcacaaat tcacaaaaat aaccgatgaa 660 acacttcaag agaatctatt ggttgcatgt atcaacaatg aaaatcctaa acttgttcca 720 ctcgaaaaag actttgctct gatggctcgt acctatcaaa atctttatga tgactgtttg 780 aacatcgata aggaactact gtcagttcca gaagtgcgat caaaaatcca gaagcacatc 840 atcaactatt ttaatgacaa tatgaagcac catccaactt acgataaaga ttccaccaga 900 tggaagtggt tcaggagacc taatactcat caccagcttt attttaatga tatgcgctat 960 atggatgatc tacttcggtt gctattaaac gaaagaaggg gatacacaga gctacgagac 1020 tctacactca agctgcttca aaagaacgag aaacaaataa aatcacaaat agctgaactt 1080 aaacaagaat taaagccagt agcctattca aaattcaaga agaattttca aggttttgac 1140 gacttgattc agcaagtaaa aaaacatccc tatttgggtc tcaagccatt cctgaatgat 1200 atcctagaaa aaaataaaga tttgctagaa caaaaaatgt ggcaaatcaa gcaatataag 1260 ggtaaggcag tcatgcttta tcgtgaaaaa aaggaacttg aaacagcgtt agaaattttt 1320 tcttatggta acggggatat agaatacaat tataaaaaga tgcaagcgga aaagaaacta 1380 aaagccctct gtggaacaac cagcccatta acagaaaaag gaaaacaaat gatagccatt 1440 cgctcagatg aagaagatct acatacctat aacaatttaa attatatcct ttcagaatgg 1500 aaattcccag ctactgatag aagaccctta agagccatac taatggaggc agaacatagg 1560 gatagatggc caatcgaaag gaaagactca gggaaaaaaa gagtagagcc agaagaggat 1620 attacccata tgtga 1635

Claims

a)분석을 위해 필요한 엔테로코커스(Enterococcus ) 종들의 전체 유전자 서열 데이터를 다운로드하는 단계;
b)다운로드 받은 전체 유전자 서열들을 각 유전자 별로 종들(species), 균주(strain), 및 유전자 이름을 부여하여 정리를 한 뒤, 한 파일로 병합시키는 단계;
c)그 다음 글로벌 어라이먼트 소트 서열 서치 툴(global alignment short sequence search tool(GASSST) 분석을 이용하여 각 종들의 균주간의 유전자 비교를 통하여 서열 상동성이 65% 이상인 유전자를 선택하는 단계;
d)그 뒤, 유전자들을 절편화시키는 방법을 이용하여 각 유전자를 절편화시켜, 이 절편화된 유전자 절편들을 GASSST을 이용하여 상기 c) 단계에서 선택된 유전자에 정렬시키는 단계;및
e)이 후, 각 상기 c) 단계에서 선택된 유전자들을 각 종들의 균주의 지놈 데이터와 비교 분석하여 상동성(%)을 기재하고, 분석된 파일을 통해 종들에만 특이적으로 존재하는 상기 선택된 유전자 중, 서열 상동성이 90% 이상인 유전자들을 선별하여 프라이머 디자인에 이용하는 단계를 포함하는 엔테로코커스(Enterococcus ) 종들 중 특정 균주에 특이적이고 간단한 종의 분리 및 동정 방법.
제1항에 있어서, 상기 엔테로코커스(Enterococcus ) 종들은 E. avium, E. dispar, E. durans, E . gallinarum, E. gilvus, E. hirae, E. italicus, E. mundtii, E. raffinosus, E. sulfureus, E. casseliflavus, E. faecalis, 및 E. faecium인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 엔테로코커스(Enterococcus ) 종들 중 특정 균주는 Enterococcus 종들 중 E.faecalis, E. faecium, E. hirae, 및 E. durans인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 d) 단계에서 유전자 길이의 30% 미만의 커퍼리지(coverage)를 보이는 경우 해당유전자는 지놈(Genome) 상에 존재하지 않는 것으로 판단하여 분석에 있어 이용하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 8에 기재된 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
서열번호 1 내지 2에 기재된 서열로 이루어진 프라이머를 유효성분으로 포함하는 엔테로코커스(Enterococcus ) 종들 중 E. faecalis 균주를 특이적으로 동정하기 위한 조성물.
서열번호 3 내지 4에 기재된 서열로 이루어진 프라이머를 유효성분으로 포함하는 엔테로코커스(Enterococcus ) 종들 중 E. faecium 균주를 특이적으로 동정하기 위한 조성물.
서열번호 5 내지 6에 기재된 서열로 이루어진 프라이머를 유효성분으로 포함하는 엔테로코커스(Enterococcus ) 종들 중 E. hirae 균주를 특이적으로 동정하기 위한 조성물.
서열번호 7 내지 8에 기재된 서열로 이루어진 프라이머를 유효성분으로 포함하는 엔테로코커스(Enterococcus ) 종들 중 E. durans 균주를 특이적으로 동정하기 위한 조성물.
서열번호 1 내지 8에 기재된 서열로 이루어진 프라이머를 유효성분으로 포함하는 엔테로코커스(Enterococcus ) 종들 중 E.faecalis, E. faecium, E. hirae, 및 E. durans 균주를 특이적으로 동정하기 위한 중합효소 연쇄반응(PCR)용 믹스 조성물.
샘플에서 얻어진 유전자를 주형으로 하여 서열번호 1 내지 2에 기재된 서열로 이루어진 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 엔테로코커스(Enterococcus) 종들 중 E. faecalis를 특이적으로 동정하고,
서열번호 3 내지 4에 기재된 서열로 이루어진 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 엔테로코커스(Enterococcus) 종들 중 E.faecium을 특이적으로 동정하고,
서열번호 5 내지 6에 기재된 서열로 이루어진 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 엔테로코커스(Enterococcus ) 종들 중 E. hirae를 특이적으로 동정하고,
서열번호 7 내지 8에 기재된 서열로 이루어진 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 엔테로코커스(Enterococcus ) 종들 중 E. durans를 특이적으로 동정하는 방법.
서열번호 9에 기재된 서열로 이루어진 유전자 또는 이 유전자의 상보적 서열을 유효성분으로 포함하는 엔테로코커스(Enterococcus ) 종들 중 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis )를 특이적으로 동정하기 위한 조성물.
서열번호 10에 기재된 서열로 이루어진 유전자 또는 이 유전자의 상보적 서열을 유효성분으로 포함하는 엔테로코커스(Enterococcus ) 종들 중 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)을 특이적으로 동정하기 위한 조성물.
서열번호 11에 기재된 서열로 이루어진 유전자 또는 이 유전자의 상보적 서열을 유효성분으로 포함하는 엔테로코커스(Enterococcus)종들 중 엔테로코커 히래(Enterococcus hirae)를 특이적으로 동정하기 위한 조성물.
서열번호 12에 기재된 서열로 이루어진 유전자 또는 이 유전자의 상보적 서열을 유효성분으로 포함하는 엔테로코커스(Enterococcus ) 종들 중 엔테로코커스 두란스(Enterococcus durans)를 특이적으로 동정하기 위한 조성물.