CN110408712B - 细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒及引物 - Google Patents

细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒及引物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒及引物，包括：(1)多重PCR反应液，多重PCR反应液中含有DNA聚合酶、dNTP混合液和PCR反应缓冲液；(2)引物混合液，所述引物混合液包括引物混合液I和引物混合液II；(3)阳性对照液，阳性对照液包括阳性对照液I和阳性对照液II。本发明的细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒，涵盖的喹诺酮耐药基因从4‑6种提高至8种，检测效率达到4个基因/反应体系，PCR产物的大小间隔为106bp‑350bp，结果易于肉眼判断，且能够实现对aac(6')‑Ib基因与aac(6')‑Ib‑cr基因序列的同时检测并加以区分。

Description

细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒及引物
技术领域
本发明属于检测用试剂盒技术领域，具体涉及细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒及引物。
背景技术
喹诺酮类抗生素(quinolones)是一类广谱抗生素，广泛应用于感染性疾病的治疗，但随着该类抗生素的大量应用，细菌对喹诺酮类药物的耐药性越来越严重。其中，质粒介导的喹诺酮耐药基因的迁移极大地推进了喹诺酮耐药性在细菌间的传播，目前已发现的可在细菌间迁移的喹诺酮耐药基因有8个，包括qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、aac(6’)-Ib和aac(6’)-Ib-cr。
对具有迁移性的喹诺酮耐药基因进行筛查，是评估细菌菌株耐药程度和耐药迁移风险的基础，利用普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术、多重PCR技术和基因芯片技术等，可完成耐药基因的筛查。目前，普通的单重PCR筛查效率低，每个反应体系只能完成一株细菌中一个耐药基因的定性分析，无法满足在大量细菌样本中进行多个基因的筛查的需求；基因芯片技术能实现耐药基因的高通量筛查，但这种技术依赖于昂贵的硬件设备，试剂和耗材的成本也较高，在大多数普通实验室中无法推广应用。相较于上述两种技术，多重PCR技术是大量细菌样本中快速筛查耐药基因的理想选择。但是，针对细菌中质粒介导的可迁移的喹诺酮耐药基因的筛查，现有技术中仍存在以下缺陷：
(1)各研究涉及的质粒介导的可移动喹诺酮耐药基因的数量为1-6个，未涵盖已发现的8个基因；
(2)各研究多为单重PCR，或一个三重/四重PCR与若干单重PCR的结合。即针对一株菌株的多个质粒介导的可移动喹诺酮耐药基因，整体检测效率均低于4个基因/反应体系。
(3)多重PCR反应体系中，各基因的PCR产物的大小间隔过小，甚至仅40bp，在琼脂糖凝胶电泳结果中不易定性判断。
(4)aac(6')-Ib基因与aac(6')-Ib-cr基因序列相似度高，前者仅在5’端的上游比后者多87个碱基，现有研究均未实现两个基因的同时检测并加以区分。
因此，开发涵盖有所可移动喹诺酮耐药基因、且筛查结果易于判定的多重PCR试剂盒，对于细菌中喹诺酮耐药性的定性判定和迁移风险研究十分重要。
发明内容
为克服上述现有技术中存在的已有的多重PCR体系未涵盖所有的8个基因、整体检测效率均低于4个基因/反应体系、因PCR扩增产物的长度过于接近而导致出现电泳结果不易判断以及现有研究尚未实现aac(6')-Ib基因与aac(6')-Ib-cr基因的同时检测及区分的缺陷，本发明提出一种细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒及引物，通过设计高特异性、扩增产物大小间距较大的引物序列对，在2个四重PCR体系中，实现对细菌中已知的8种质粒介导的可移动的喹诺酮耐药基因的快速检测，检测效率达到4个基因/反应体系，PCR产物的大小间隔为106bp-350bp，在琼脂糖凝胶电泳结果中易于肉眼判断；此外，在进行aac(6')-Ib基因上游引物的设计时，限制其模板序列为基因全序列的前87个碱基，通过引物位点的特异性选择，使得用于扩增aac(6')-Ib基因的上游引物对无法与aac(6')-Ib-cr基因的序列结合，因此无法对aac(6')-Ib-cr基因进行扩增，从而能够实现aac(6')-Ib基因与aac(6')-Ib-cr基因的同时检测及区分。
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒，包括：
(1)多重PCR反应液，多重PCR反应液中含有DNA聚合酶、dNTP混合液和PCR反应缓冲液；其中，dNTP混合液中包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP；
(2)引物混合液，所述引物混合液由引物混合液I和引物混合液II组成；
引物混合液I是将扩增qnrA基因、qnrB基因、aac(6’)-Ib基因和aac(6’)-Ib-cr基因的4对引物用双蒸水溶解后混合得到，其中：
扩增qnrA基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示：
SEQ ID NO.1：5’ACGCCAGGATTTGAGTGA3’
SEQ ID NO.2：5’TCCCAAGGGTTCCAGCA3’；
扩增qnrB基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示：
SEQ ID NO.3：5’GTGCGATGCTGAAAGATG3’
SEQ ID NO.4：5’CGATGCCTGGTAGTTGTC3’；
扩增aac(6’)-Ib基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示：
SEQ ID NO.5：5’AAAGTTAGGCATCCCAAAGTA3’
SEQ ID NO.6：5’TTCCCACCATCCGTCCC3’；
扩增aac(6’)-Ib-cr基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示：
SEQ ID NO.7：5’GTCCGTCACTCCATACATTG3’
SEQ ID NO.8：5’TTTCTTCTTCCCACCTTCC3’；
引物混合液II是将扩增qnrC基因、qnrD基因、qnrS基因和qepA基因的4对引物用双蒸水溶解后混合得到，其中：
扩增qnrC基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9～10所示：
SEQ ID NO.9：5’TTAGAACCTCGTAAAGCGGA3’
SEQ ID NO.10：5’GTCTGGAATAACAATCACCC3’；
扩增qnrD基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11～12所示：
SEQ ID NO.11：5’CATTAGTGCCTTAGGTCTTGA3’
SEQ ID NO.12：5’CACAGTGCCATTCCAGC3’；
扩增qnrS基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14所示：
SEQ ID NO.13：5’GACTTTCGCCGTGCTAAC3’
SEQ ID NO.14：5’AACAACAATACCCAGTGCTTC3’；
扩增qepA基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15～16所示：
SEQ ID NO.15：5’CGCTGGTGATGATGATTTC3’
SEQ ID NO.16：5’GGCGTTCTTCGCTCTCG 3’；
(3)阳性对照液，阳性对照液包括阳性对照液I和阳性对照液II，其中：
阳性对照液I为分别含有喹诺酮耐药基因qnrA、qnrB、aac(6’)-Ib和aac(6’)-Ib-cr的质粒的水溶液的混合物；
阳性对照液II为分别含有喹诺酮耐药基因qnrC、qnrD、qnrS和qepA的质粒的水溶液的混合物。
优选的技术方案为：
如上所述的细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒，引物混合液I或引物混合液II中每条引物的浓度为50-200μmol/L。
如上所述的细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒，每1000μL多重PCR反应液的组成为：DNA聚合酶8-30μL，dNTP混合液28-140μL，PCR反应缓冲液100-120μL，
用双蒸水补足至1000μL。
如上所述的细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒，dNTP混合液中，dATP、dTTP、dCTP和dGTP各7-35μL。
如上所述的细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒，阳性对照液I和阳性对照液II中各质粒的浓度为0.1-10pg/μL。
如上所述的细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒，PCR反应缓冲液为10×Ex Taq Buffer。
本发明还提供了检测细菌中喹诺酮类耐药基因的引物组，所述引物组由扩增qnrA基因、qnrB基因、aac(6’)-Ib基因、aac(6’)-Ib-cr基因的4对引物以及扩增qnrC基因、qnrD基因、qnrS基因、qepA基因的4对引物组成，各引物对应核苷酸序列如下所示：
扩增qnrA基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示：
SEQ ID NO.1：5’ACGCCAGGATTTGAGTGA3’
SEQ ID NO.2：5’TCCCAAGGGTTCCAGCA3’；
扩增qnrB基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示：
SEQ ID NO.3：5’GTGCGATGCTGAAAGATG3’
SEQ ID NO.4：5’CGATGCCTGGTAGTTGTC3’；
扩增aac(6’)-Ib基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示：
SEQ ID NO.5：5’AAAGTTAGGCATCCCAAAGTA3’
SEQ ID NO.6：5’TTCCCACCATCCGTCCC3’；
扩增aac(6’)-Ib-cr基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示：
SEQ ID NO.7：5’GTCCGTCACTCCATACATTG3’
SEQ ID NO.8：5’TTTCTTCTTCCCACCTTCC3’；
扩增qnrC基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9～10所示：
SEQ ID NO.9：5’TTAGAACCTCGTAAAGCGGA3’
SEQ ID NO.10：5’GTCTGGAATAACAATCACCC3’；
扩增qnrD基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11～12所示：
SEQ ID NO.11：5’CATTAGTGCCTTAGGTCTTGA3’
SEQ ID NO.12：5’CACAGTGCCATTCCAGC3’；
扩增qnrS基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14所示：
SEQ ID NO.13：5’GACTTTCGCCGTGCTAAC3’
SEQ ID NO.14：5’AACAACAATACCCAGTGCTTC3’；
扩增qepA基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15～16所示：
SEQ ID NO.15：5’CGCTGGTGATGATGATTTC3’
SEQ ID NO.16：5’GGCGTTCTTCGCTCTCG 3’。
有益效果：
(1)本发明的检测细菌中喹诺酮类耐药基因的引物，与现有的喹诺酮耐药基因多重PCR筛查技术相比，涵盖的喹诺酮耐药基因引物从4-6种提高至8种，可完成已发现的8种喹诺酮耐药基因的筛查，实现基于多重PCR技术的细菌中多种喹诺酮耐药基因的快速检测；
(2)使用本发明的细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒进行检测时，将对应的PCR产物长度差异合适的引物对进行组合，可实现基于多重PCR技术的细菌中多种喹诺酮耐药基因的快速检测，对于每一个细菌样品，只需进行2组多重PCR反应，即可完成8种喹诺酮耐药基因的筛查，每组多重PCR反应几乎都达到了多重PCR反应引物对数量的上限，即四重，与单重PCR技术相比，检测效率提高约4倍；
(3)使用本发明的细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒进行检测时，每个多重PCR反应体系中，PCR产物的大小间隔为106bp-350bp，而现有技术中喹诺酮耐药基因多重PCR检测体系的PCR产物的大小间隔仅40bp-121bp，因而能通过琼脂糖凝胶电泳进行有效区分，克服了现有技术中在琼脂糖凝胶电泳结果中不易定性判断的缺点；
(4)本发明的检测细菌中喹诺酮类耐药基因的引物，在aac(6')-Ib基因的前87位设计上游引物，使得扩增aac(6')-Ib基因的引物对无法对aac(6')-Ib-cr基因进行扩增，通过引物位点的特异性选择，实现了对序列相似性极高的aac(6')-Ib基因和aac(6')-Ib-cr基因的分别检测；
(5)本发明的细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒，具有操作简便、结果易判、成本低廉、高效灵敏等优点，可用于各种细菌中质粒介导的可移动喹诺酮耐药基因的全面筛查检测。
附图说明
图1为表3中样品1(菌株组合：A+B+G+H)中喹诺酮耐药基因检测凝胶电泳图；
图2为表3中样品2(菌株组合：C+D+E+F)中喹诺酮耐药基因检测凝胶电泳图；
图3为表3中样品3(菌株组合：A+B+C+E)中喹诺酮耐药基因检测凝胶电泳图；
图4为表3中样品4(菌株组合：F+G+I+J)中喹诺酮耐药基因检测凝胶电泳图；
图5为表3中样品5(菌株组合：F+H+K+L)中喹诺酮耐药基因检测凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒，包括：
(1)多重PCR反应液，多重PCR反应液中含有DNA聚合酶、dNTP混合液和PCR反应缓冲液；
(2)引物混合液，所述引物混合液包括引物混合液I和引物混合液II；
引物混合液I是将扩增qnrA、qnrB、aac(6’)-Ib和aac(6’)-Ib-cr的4对引物用双蒸水溶解后混合得到，包括的喹诺酮耐药基因检测引物对如表1所示，其中：
扩增qnrA基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示：
SEQ ID NO.1：5’ACGCCAGGATTTGAGTGA3’
SEQ ID NO.2：5’TCCCAAGGGTTCCAGCA3’；
扩增qnrB基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示：
SEQ ID NO.3：5’GTGCGATGCTGAAAGATG3’
SEQ ID NO.4：5’CGATGCCTGGTAGTTGTC3’；
扩增aac(6’)-Ib基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示：
SEQ ID NO.5：5’AAAGTTAGGCATCCCAAAGTA3’
SEQ ID NO.6：5’TTCCCACCATCCGTCCC3’；
扩增aac(6’)-Ib-cr基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示：
SEQ ID NO.7：5’GTCCGTCACTCCATACATTG3’
SEQ ID NO.8：5’TTTCTTCTTCCCACCTTCC3’；
引物混合液II是将扩增qnrC、qnrD、qnrS和qepA的4对引物用双蒸水溶解后混合得到，其中：
扩增qnrC基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9～10所示：
SEQ ID NO.9：5’TTAGAACCTCGTAAAGCGGA3’
SEQ ID NO.10：5’GTCTGGAATAACAATCACCC3’；
扩增qnrD基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11～12所示：
SEQ ID NO.11：5’CATTAGTGCCTTAGGTCTTGA3’
SEQ ID NO.12：5’CACAGTGCCATTCCAGC3’；
扩增qnrS基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14所示：
SEQ ID NO.13：5’GACTTTCGCCGTGCTAAC3’
SEQ ID NO.14：5’AACAACAATACCCAGTGCTTC3’；
扩增qepA基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15～16所示：
SEQ ID NO.15：5’CGCTGGTGATGATGATTTC 3’
SEQ ID NO.16：5’GGCGTTCTTCGCTCTCG 3’；
(3)阳性对照液，阳性对照液包括阳性对照液I和阳性对照液II，其中：
阳性对照液I为分别含有喹诺酮耐药基因qnrA、qnrB、aac(6’)-Ib和aac(6’)-Ib-cr的质粒的水溶液的混合物；
阳性对照液II为分别含有喹诺酮耐药基因qnrC、qnrD、qnrS和qepA的质粒的水溶液的混合物。
表1本发明包括的喹诺酮耐药基因检测引物对
Figure GDA0004274964510000071
采用如上所述的细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒进行实验，涉及到的材料和试剂，实验条件和方法如下：
材料：具有喹诺酮耐药表型的细菌菌株和不具有喹诺酮耐药表型的细菌菌株，由本实验室分离自养鸡场、养牛场和养猪场，并通过16S rDNA测序鉴定菌种。
试剂：DNA聚合酶(5U/μL，配套10×Ex Taq Buffer(含Mg2+))和dNTP混合液(包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP，各2.5mM)购于宝日医生物技术(北京)有限公司)；8对喹诺酮耐药基因PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；琼脂糖凝胶电泳试剂购于北京全式金生物技术有限公司；脑心浸液肉汤培养基(Brain heart infusion broth,BHI)和琼脂粉购于英国Oxoid公司，环丙沙星购于美国Sigma公司。
仪器：Bio-Rad T100型PCR仪，Bio-Rad Powerpac Universal型电泳仪，Bio-RadGelDoc XR+Imager型凝胶成像分析系统，北京六一生物科技有限公司DYCP-31E型电泳槽，Eppendorf Centrifuge 5424R型高速冷冻台式离心机，Eppendorf Research Plus型微量移液枪，德国Eppendorf公司；
对上述细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒进行装配，其具体步骤为：
(1)多重PCR反应液的装配
多重PCR反应液中，DNA聚合酶8-30μL；dNTP 28-140μL(dATP、dTTP、dCTP和dGTP各7-35μL)；PCR反应缓冲液(10×Ex Taq Buffer)100-120μL；用双蒸水补足至1000μL；
(2)配置引物混合液
将扩增qnrA、qnrB、aac(6’)-Ib和aac(6’)-Ib-cr的4对引物的干粉用双蒸水溶解后混合成引物混合液I，将扩增qnrC、qnrD、qnrS和qepA的4对引物引物的干粉用双蒸水溶解后混合成引物混合液II，每条引物的浓度为50-200μmol/L；
(3)配置阳性对照液
将分别含有喹诺酮耐药基因qnrA、qnrB、aac(6’)-Ib和aac(6’)-Ib-cr的质粒混合，得到阳性对照液I；将分别含有喹诺酮耐药基因qnrC、qnrD、qnrS和qepA的质粒混合，得到阳性对照液II，阳性对照液中各质粒的含量为0.1-10pg/μL。
在含有环丙沙星的BHI培养基上分离具有喹诺酮类抗生素耐药表型的细菌，对单个菌株用单重PCR鉴定8个质粒介导的可移动喹诺酮耐药基因的存在情况，并将PCR产物测序，确认是否为目的基因；用16S rDNA测序法鉴定菌种，其中，菌株种属及8个喹诺酮耐药基因的携带情况汇总于表2，将不同菌株排列组合(表3)，模拟实际的细菌混合样品。
表2用于PCR实验的菌株及喹诺酮耐药基因的携带情况
Figure GDA0004274964510000081
表3用于PCR实验的菌株组合
Figure GDA0004274964510000082
Figure GDA0004274964510000091
以表3所列菌株组合液为5个细菌样品，采用上述装配好的细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒对细菌样品进行喹诺酮耐药基因检测，检测的条件汇总于表4。
表4用本发明试剂盒检测5个细菌混合液的测试条件
Figure GDA0004274964510000092
实施例1
以上述装配好的细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒检测表3中样品编号1(菌株组合：A+B+G+H)中的含有4个耐药基因(qnrA、qnrB、aac(6’)-Ib和aac(6’)-Ib-cr)的菌株混合液，检测条件见表4中的检测编号1，同时分别以阳性对照液和蒸馏水为模板进行PCR扩增，作为检测试剂盒的阳性对照和阴性对照，仅当阳性对照管扩增出目的条带且阴性对照管未扩增出任何条带时，检测管的结果才可用，用琼脂糖凝胶电泳观察结果，根据电泳条带的大小判断是否存在某种喹诺酮耐药基因，实际检测结果如图1中的泳道1、2、3、4、5和6所示，图中，M为2K Maker，1为本发明试剂盒(引物混合液I)对应泳道，2为本发明试剂盒(引物混合液I)的阳性对照对应泳道，3为本发明试剂盒(引物混合液I)的阴性对照对应泳道，4为本发明试剂盒(引物混合液II)对应泳道，5为本发明试剂盒(引物混合液II)的阳性对照对应泳道，6为本发明试剂盒(引物混合液II)的阴性对照对应泳道，问题分析汇总于表6。
对比例1
采用参考文献(“Kim HB1,Park CH,Kim CJ,Kim EC,Jacoby GA,HooperDC.Prevalence of plasmid-mediated quinolone resistance determinants over a 9-year period.Antimicrob Agents Chemother.2009,53(2):639-45.”和“杨羚,戴碧云,罗毓婷,陈定强.多重耐药菌中质粒介导喹诺酮耐药基因的检测和分析.国际医药卫生导报，2013，18：2820-2823.”)报道的喹诺酮耐药基因多重PCR检测方法对表3中样品编号1(菌株组合：A+B+G+H)中的含有4个耐药基因(qnrA、qnrB、aac(6’)-Ib和aac(6’)-Ib-cr)的菌株混合液均进行2个反应体系(表5中体系1和体系2)的检测，引物信息总结于表5，根据上述文献将反应体系定为：10×PCR Buffer 10μL，dNTP(各2.5mmol/L)1μL，引物对混合物1μL，DNA模板1μL，用水补足至20μL；根据文献将反应程序定为：预变性94℃5min，35个循环(每循环均为94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s)，最后72℃延伸3min，用琼脂糖凝胶电泳观察结果，根据电泳条带的大小判断是否存在某种喹诺酮耐药基因，实际检测结果如图1中的泳道7、8、9和10所示，图中，7为文献多重PCR反应体系(体系1)对应泳道，8为本文献多重PCR反应体系(体系1)的阴性对照对应泳道，9为文献多重PCR反应体系(体系2)对应泳道，10为文献多重PCR反应体系(体系2)的阴性对照对应泳道，问题分析汇总于表6。
表5文献中用于喹诺酮耐药基因多重PCR检测的引物对
Figure GDA0004274964510000101
表6样品1中8种喹诺酮耐药基因检测结果及问题分析
Figure GDA0004274964510000111
由表6中实施例1和对比例1中的检测结果及问题分析汇总可知，本发明的试剂盒能够有效检测出4个耐药基因(qnrA、qnrB、aac(6’)-Ib和aac(6’)-Ib-cr)，且无非特异性扩增，结果易于分辨，检测效果优于文献报道的喹诺酮耐药基因多重PCR反应体系。
实施例2
以上述装配好的细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒及引物检测表3中样品编号2(菌株组合：C+D+E+F)中的含有4个耐药基因(qnrC、qnrD、qnrS和qepA)的菌株混合液，检测条件见表4中的检测编号2，同时分别以阳性对照液和蒸馏水为模板进行PCR扩增，作为检测试剂盒的阳性和阴性对照，用琼脂糖凝胶电泳观察结果，根据电泳条带的大小判断是否存在某种喹诺酮耐药基因，实际检测结果如图2中的泳道1、2、3、4、5和6所示，图中，M为2K Maker，1为本发明试剂盒(引物混合液I)对应泳道，2为本发明试剂盒(引物混合液I)的阳性对照对应泳道，3为本发明试剂盒(引物混合液I)的阴性对照对应泳道，4为本发明试剂盒(引物混合液II)对应泳道，5为本发明试剂盒(引物混合液II)的阳性对照对应泳道，6为本发明试剂盒(引物混合液II)的阴性对照对应泳道，问题分析汇总于表7。
对比例2
以对比例1中的参考文献报道的喹诺酮耐药基因多重PCR检测方法对表3中样品编号2(菌株组合：C+D+E+F)中的含有4个耐药基因(qnrC、qnrD、qnrS和qepA)的菌株混合液均进行2个反应体系的检测，引物信息和反应体系设定与对比例1相同，用琼脂糖凝胶电泳观察结果，根据电泳条带的大小判断是否存在某种喹诺酮耐药基因，实际检测结果如图2中的泳道7、8、9和10所示，图中，7为文献多重PCR反应体系(体系1)对应泳道，8为本文献多重PCR反应体系(体系1)的阴性对照对应泳道，9为文献多重PCR反应体系(体系2)对应泳道，10为文献多重PCR反应体系(体系2)的阴性对照对应泳道，问题分析汇总于表7。
表7样品2中8种喹诺酮耐药基因检测结果及问题分析
Figure GDA0004274964510000121
由表7中实施例2和对比例2中的检测结果及问题分析汇总可知，本发明试剂盒能有效检测出4种喹诺酮耐药基因(qnrC、qnrD、qnrS和qepA)，且无非特异性扩增，结果易于分辨，检测效果优于文献报道的喹诺酮耐药基因多重PCR反应体系。
实施例3
以上述装配好的细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒及引物检测表3中样品编号3(菌株组合：A+B+C+E)中的含有4个耐药基因(qnrA、qnrB、qnrC和qnrS)的菌株混合液，检测条件见表4中的检测编号3，同时分别以阳性对照液和蒸馏水为模板进行PCR扩增，作为检测试剂盒的阳性和阴性对照，用琼脂糖凝胶电泳观察结果，根据电泳条带的大小判断是否存在某种喹诺酮耐药基因，实际检测结果如图3中的泳道1、2、3、4、5和6所示，图中，M为2K Maker，1为本发明试剂盒(引物混合液I)对应泳道，2为本发明试剂盒(引物混合液I)的阳性对照对应泳道，3为本发明试剂盒(引物混合液I)的阴性对照对应泳道，4为本发明试剂盒(引物混合液II)的阳性对照对应泳道，5为本发明试剂盒(引物混合液II)对应泳道，6为本发明试剂盒(引物混合液II)的阴性对照对应泳道，问题分析汇总于表8。
对比例3
以对比例1中的参考文献报道的喹诺酮耐药基因多重PCR检测方法对表3中样品编号3(菌株组合：A+B+C+E)中的含有4个耐药基因(qnrA、qnrB、qnrC和qnrS)的菌株混合液均进行2个反应体系的检测，引物信息和反应体系设定与对比例1相同，用琼脂糖凝胶电泳观察结果，根据电泳条带的大小判断是否存在某种喹诺酮耐药基因，实际检测结果如图3中的泳道7、8、9和10所示，图中，7为文献多重PCR反应体系(体系1)对应泳道，8为本文献多重PCR反应体系(体系1)的阴性对照对应泳道，9为文献多重PCR反应体系(体系2)对应泳道，10为文献多重PCR反应体系(体系2)的阴性对照对应泳道，问题分析汇总于表8。
表8样品3中8种喹诺酮耐药基因检测结果及问题分析
Figure GDA0004274964510000131
由表8中实施例3和对比例3中的检测结果及问题分析汇总可知，本发明试剂盒能有效检测出4种喹诺酮耐药基因(qnrA、qnrB、qnrC、qnrS)，且无非特异性扩增，结果易于分辨，检测效果优于文献报道的喹诺酮耐药基因多重PCR反应体系。
实施例4
以上述装配好的细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒及引物检测表3中样品编号4(菌株组合：F+G+I+J)中的含有2个耐药基因(qepA和aac(6’)-Ib)的菌株混合液，检测条件见表4中的检测编号4，同时分别以阳性对照液和蒸馏水为模板进行PCR扩增，作为检测试剂盒的阳性和阴性对照，用琼脂糖凝胶电泳观察结果，根据电泳条带的大小判断是否存在某种喹诺酮耐药基因，实际检测结果如图4中的泳道1、2、3、4、5和6所示，图中，M为2KMaker，1为本发明试剂盒(引物混合液I)对应泳道，2为本发明试剂盒(引物混合液I)的阳性对照对应泳道，3为本发明试剂盒(引物混合液I)的阴性对照对应泳道，4为本发明试剂盒(引物混合液II)对应泳道，5为本发明试剂盒(引物混合液II)的阳性对照对应泳道，6为本发明试剂盒(引物混合液II)的阴性对照对应泳道，问题分析汇总于表9。
对比例4
以对比例1中的参考文献报道的喹诺酮耐药基因多重PCR检测方法对表3中样品编号4(菌株组合：F+G+I+J)中的含有2个耐药基因(qepA和aac(6’)-Ib)的菌株混合液均进行2个反应体系的检测，引物信息和反应体系设定与对比例1相同，用琼脂糖凝胶电泳观察结果，根据电泳条带的大小判断是否存在某种喹诺酮耐药基因，实际检测结果如图4中的泳道7、8、9和10所示，图中，7为文献多重PCR反应体系(体系1)对应泳道，8为本文献多重PCR反应体系(体系1)的阴性对照对应泳道，9为文献多重PCR反应体系(体系2)对应泳道，10为文献多重PCR反应体系(体系2)的阴性对照对应泳道，问题分析汇总于表9。
表9样品4中8种喹诺酮耐药基因检测结果及问题分析
Figure GDA0004274964510000141
由表9中实施例4和对比例4中的检测结果及问题分析汇总可知，本发明试剂盒能有效检测出2种喹诺酮耐药基因(qepA和aac(6’)-Ib)，且无非特异性扩增，结果易于分辨，检测效果优于文献报道的喹诺酮耐药基因多重PCR反应体系。
实施例5
以上述装配好的细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒及引物检测表3中样品编号5(菌株组合：F+H+K+L)中的含有2个耐药基因(qepA、和aac(6’)-Ib-cr)的菌株混合液，检测条件见表4中的检测编号5，同时分别以阳性对照液和蒸馏水为模板进行PCR扩增，作为检测试剂盒的阳性和阴性对照，用琼脂糖凝胶电泳观察结果，根据电泳条带的大小判断是否存在某种喹诺酮耐药基因，实际检测结果如图5中的泳道1、2、3、4、5和6所示，图中，M为2KMaker，1为本发明试剂盒(引物混合液I)对应泳道，2为本发明试剂盒(引物混合液I)的阳性对照对应泳道，3为本发明试剂盒(引物混合液I)的阴性对照对应泳道，4为本发明试剂盒(引物混合液II)对应泳道，5为本发明试剂盒(引物混合液II)的阳性对照对应泳道，6为本发明试剂盒(引物混合液II)的阴性对照对应泳道，问题分析汇总于表10。
对比例5
以对比例1中的参考文献报道的喹诺酮耐药基因多重PCR检测方法对表3中样品编号5(菌株组合：F+H+K+L)中的含有2个耐药基因(qepA、和aac(6’)-Ib-cr)的菌株混合液均进行2个反应体系的检测，引物信息和反应体系设定与对比例1相同，用琼脂糖凝胶电泳观察结果，根据电泳条带的大小判断是否存在某种喹诺酮耐药基因，实际检测结果如图5中的泳道7、8、9和10所示，图中，7为文献多重PCR反应体系(体系1)对应泳道，8为本文献多重PCR反应体系(体系1)的阴性对照对应泳道，9为文献多重PCR反应体系(体系2)对应泳道，10为文献多重PCR反应体系(体系2)的阴性对照对应泳道，问题分析汇总于表10。
表10样品5中8种喹诺酮耐药基因检测结果及问题分析
Figure GDA0004274964510000151
Figure GDA0004274964510000161
由表10中实施例5和对比例5中的检测结果及问题分析汇总可知，本发明试剂盒能有效检测出2种喹诺酮耐药基因(qepA、和aac(6’)-Ib-cr)，且无非特异性扩增，结果易于分辨，检测效果优于文献报道的喹诺酮耐药基因多重PCR反应体系。
SEQUENCE LISTING
<110>申请人名称（上海市农业科学院）
<120>细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒及引物
<130> 2019
<160> 14
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：扩增qnrA的引物
<400> 1
ACGCCAGGATTTGAGTGA 18
<210>2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：扩增qnrA的引物
<400> 2
TCCCAAGGGTTCCAGCA 17
<210>3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：扩增qnrB的引物
<400> 3
GTGCGATGCTGAAAGATG 18
<210>4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：扩增qnrB的引物
<400> 4
CGATGCCTGGTAGTTGTC 18
<210>5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：扩增aac(6’)-Ib的引物
<400>5
AAAGTTAGGCATCCCAAAGTA 21
<210>6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：扩增aac(6’)-Ib的引物
<400>6
TTCCCACCATCCGTCCC 17
<210>7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：扩增aac(6’)-Ib-cr的引物
<400>7
GTCCGTCACTCCATACATTG 20
<210>8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：扩增aac(6’)-Ib-cr的引物
<400>8
TTTCTTCTTCCCACCTTCC 19
<210>9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：扩增qnrC的引物
<400>9
TTAGAACCTCGTAAAGCGGA 20
210>10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：扩增qnrC的引物
<400>10
GTCTGGAATAACAATCACCC 20
210>11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：扩增qnrD的引物
<400>11
CATTAGTGCCTTAGGTCTTGA 21
<210>12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：扩增qnrD的引物
<400>12
CACAGTGCCATTCCAGC 17
<210>13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：扩增qnrS的引物
<400>13
GACTTTCGCCGTGCTAAC 18
<210>14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：扩增qnrS的引物
<400>14
AACAACAATACCCAGTGCTTC 21
<210>15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：扩增qepA的引物
<400>15
CGCTGGTGATGATGATTTC 19
<210>16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述：扩增qepA的引物
<400>16
GGCGTTCTTCGCTCTCG 17

Claims (7)

1.细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒，其特征在于，包括：
(1)多重PCR反应液，多重PCR反应液中含有DNA聚合酶、dNTP混合液和PCR反应缓冲液；其中，dNTP混合液中包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP；
(2)引物混合液，所述引物混合液由引物混合液I和引物混合液II组成；
引物混合液I是将扩增qnrA基因、qnrB基因、aac(6’)-Ib基因和aac(6’)-Ib-cr基因的4对引物用双蒸水溶解后混合得到，其中：
扩增qnrA基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示：
SEQ ID NO.1：5’ACGCCAGGATTTGAGTGA3’
SEQ ID NO.2：5’TCCCAAGGGTTCCAGCA3’；
扩增qnrB基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示：
SEQ ID NO.3：5’GTGCGATGCTGAAAGATG3’
SEQ ID NO.4：5’CGATGCCTGGTAGTTGTC3’；
扩增aac(6’)-Ib基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示：
SEQ ID NO.5：5’AAAGTTAGGCATCCCAAAGTA3’
SEQ ID NO.6：5’TTCCCACCATCCGTCCC3’；
扩增aac(6’)-Ib-cr基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示：
SEQ ID NO.7：5’GTCCGTCACTCCATACATTG3’
SEQ ID NO.8：5’TTTCTTCTTCCCACCTTCC3’；
引物混合液II是将扩增qnrC基因、qnrD基因、qnrS基因和qepA基因的4对引物用双蒸水溶解后混合得到，其中：
扩增qnrC基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9～10所示：
SEQ ID NO.9：5’TTAGAACCTCGTAAAGCGGA3’
SEQ ID NO.10：5’GTCTGGAATAACAATCACCC3’；
扩增qnrD基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11～12所示：
SEQ ID NO.11：5’CATTAGTGCCTTAGGTCTTGA3’
SEQ ID NO.12：5’CACAGTGCCATTCCAGC3’；
扩增qnrS基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14所示：
SEQ ID NO.13：5’GACTTTCGCCGTGCTAAC3’
SEQ ID NO.14：5’AACAACAATACCCAGTGCTTC3’；
扩增qepA基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15～16所示：
SEQ ID NO.15：5’CGCTGGTGATGATGATTTC3’
SEQ ID NO.16：5’GGCGTTCTTCGCTCTCG 3’；
(3)阳性对照液，阳性对照液包括阳性对照液I和阳性对照液II，其中：
阳性对照液I为分别含有喹诺酮耐药基因qnrA、qnrB、aac(6’)-Ib和aac(6’)-Ib-cr的质粒的水溶液的混合物；
阳性对照液II为分别含有喹诺酮耐药基因qnrC、qnrD、qnrS和qepA的质粒的水溶液的混合物。
2.根据权利要求1所述的细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒，其特征在于，引物混合液I或引物混合液II中每条引物的浓度为50-200μmol/L。
3.根据权利要求1所述的细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒，其特征在于，每1000μL多重PCR反应液的组成为：DNA聚合酶8-30μL，dNTP混合液28-140μL，PCR反应缓冲液100-120μL，用双蒸水补足至1000μL。
4.根据权利要求1所述的细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒，其特征在于，dNTP混合液中，dATP、dTTP、dCTP和dGTP各7-35μL。
5.根据权利要求1所述的细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒，其特征在于，阳性对照液I和阳性对照液II中各质粒的浓度为0.1-10pg/μL。
6.根据权利要求1所述的细菌中喹诺酮类耐药基因的快速筛查试剂盒，其特征在于，PCR反应缓冲液为10×Ex Taq Buffer。
7.检测细菌中喹诺酮类耐药基因的引物组，其特征在于，所述引物组由扩增qnrA基因、qnrB基因、aac(6’)-Ib基因、aac(6’)-Ib-cr基因的4对引物以及扩增qnrC基因、qnrD基因、qnrS基因、qepA基因的4对引物组成，各引物对应核苷酸序列如下所示：
扩增qnrA基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示：
SEQ ID NO.1：5’ACGCCAGGATTTGAGTGA3’
SEQ ID NO.2：5’TCCCAAGGGTTCCAGCA3’；
扩增qnrB基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示：
SEQ ID NO.3：5’GTGCGATGCTGAAAGATG3’
SEQ ID NO.4：5’CGATGCCTGGTAGTTGTC3’；
扩增aac(6’)-Ib基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示：
SEQ ID NO.5：5’AAAGTTAGGCATCCCAAAGTA3’
SEQ ID NO.6：5’TTCCCACCATCCGTCCC3’；
扩增aac(6’)-Ib-cr基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示：SEQ IDNO.7：5’GTCCGTCACTCCATACATTG3’
SEQ ID NO.8：5’TTTCTTCTTCCCACCTTCC3’；
扩增qnrC基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9～10所示：SEQ ID NO.9：5’TTAGAACCTCGTAAAGCGGA3’
SEQ ID NO.10：5’GTCTGGAATAACAATCACCC3’；
扩增qnrD基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11～12所示：SEQ ID NO.11：5’CATTAGTGCCTTAGGTCTTGA3’
SEQ ID NO.12：5’CACAGTGCCATTCCAGC3’；
扩增qnrS基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14所示：SEQ ID NO.13：5’GACTTTCGCCGTGCTAAC3’
SEQ ID NO.14：5’AACAACAATACCCAGTGCTTC3’；
扩增qepA基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15～16所示：SEQ ID NO.15：5’CGCTGGTGATGATGATTTC3’
SEQ ID NO.16：5’GGCGTTCTTCGCTCTCG 3’。
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