CN105132563B - 一种蚜虫共生菌多重pcr检测的引物组和检测方法 - Google Patents

一种蚜虫共生菌多重pcr检测的引物组和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蚜虫共生菌多重PCR检测的引物组，该引物组是由检测沃尔巴克氏菌(Wolbachia pipientis)、杀雄菌属(Arsenophonus)和蚜虫U型共生菌(Regiella insecticola)的引物对组成。本发明还公开了一种蚜虫共生菌多重PCR检测的方法，该方法是将上述的引物组与待测蚜虫样品的总DNA进行多重PCR反应，反应结束后对PCR反应产物进行电泳分析，以确定蚜虫样品中是否含有蚜虫共生菌。本发明检测方法快速、准确、灵敏度高，能够在一个PCR反应中同时鉴定蚜虫样品中三种蚜虫共生菌的感染情况，大大降低了工作量，提升了工作效率，节省了一定程度的检测费用。

Description

一种蚜虫共生菌多重PCR检测的引物组和检测方法
技术领域
本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种蚜虫共生菌多重PCR检测的引物组和检测方法。
背景技术
蚜虫，属于半翅目，胸喙亚目(Sternorrhyncha)，是一类重要的经济害虫。蚜虫和细菌的关系密切，共生菌在蚜虫中发挥着多样化的功能，如补充营养、增强蚜虫对高温的忍耐，增强蚜虫对寄生蜂寄生和真菌感染的抵抗能力，扩大蚜虫的寄主范围等。但是蚜虫共生菌对生存环境要求苛刻，基本上都不能在蚜虫体外进行纯培养，因此蚜虫共生菌的感染检测都是通过分子手段进行鉴定的。蚜虫共生菌作为除了蚜虫核糖体和线粒体DNA外第三种可遗传的物质，以其为对象开展的蚜虫种群遗传结构分析、真核和原核生物互作，以及利用共生菌作为介体开展对蚜虫的生物防治都是目前国内外研究的热点。如何对蚜虫中共生菌的物种多样性进行准确的分析，是开展上述研究工作的前体前提，但是目前对蚜虫共生菌的检测工作基本上都是单个物种进行的，需要耗费大量的人力物力。多重PCR是在环境微生物物种多样性检测中一种高效的分子检测方法，已经广泛的应用在土壤微生物、植物病原微生物多样性的检测中，并取得了很好的结果。
沃尔巴克氏菌(Wolbachia pipientis)、杀雄菌属(Arsenophonus)和蚜虫U型共生菌(Regiella insecticola)是蚜虫中常见的三种共生菌，本发明中成功建立了一套快速、准确、直观并兼有高灵敏度的多重PCR反应体系，力图一次性阐明待测蚜虫总DNA中三种共生菌的感染情况。本发明中以三种蚜虫共生菌相关的蛋白质基因作为靶标基因，相较于目前细菌鉴定中常用的16S rRNA基因具有更强的灵敏度和特异性。wsp基因编码的是细菌外膜蛋白，是国际上对沃尔巴克氏菌进行检测和分型的通用基因(Zhou W,Rousset F,O'Neill S.1998.Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strainsusing wsp gene sequences.Proceedings of the Royal Society of London.SeriesB.Biological sciences,265:509-515)；yaeT基因编码的是外膜蛋白组装因子，已经广泛的应用于蚜虫杀雄菌属的多基因分型中(Jousselin E,Coeur d'Acier A,Vanlerberghe-Masutti F,Duron O.2012.Evolution and diversity of Arsenophonus endosymbiontsin aphids.Molecular Ecology,22:260-270)；gltA基因编码细菌中的柠檬酸合成酶，已经成功的用于蚜虫U型共生菌的检测(Li T,Xiao JH,Wu YQ,Huang DW.2014.Diversity ofbacterial symbionts in populations of Sitobion miscanthi(Hemiptera:Aphididae)in China.Environmental Entomology,43:605-611)。本发明中使用的引物组合分别扩增wsp基因435bp片段、yaeT基因294bp片段、gltA基因174bp片段，扩增片段间长度差异都超过100bp，普通的1％的琼脂糖凝胶电泳就可以完全清楚分辨不同的扩增产物，从而直观的反应出待测的蚜虫样品中共生菌的感染情况。本发明所使用的引物序列均为独立设计出来的。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明体提供一种蚜虫共生菌多重PCR检测的引物组和检测方法，该多重PCR检测方法可同时快速、准确鉴定蚜虫样品是否感染三种常见共生菌，克服了现有技术中对蚜虫共生菌检测耗时耗力的缺点，为下游的相关研究节省一定的人力物力。
本发明采用的技术方案为：
一种蚜虫共生菌多重PCR检测的引物组，所述引物组是由检测尔巴克氏菌(Wolbachia pipientis)、杀雄菌属(Arsenophonus)和蚜虫U型共生菌(Regiellainsecticola)的引物对组成；
所述检测沃尔巴克氏菌引物对(Wol-F/R)的上下游引物的核苷酸序列为：
上游引物Wol-F：5'-ATAGCTGGTGGTGGTGCATT-3'(SEQ ID NO.1)，
下游引物Wol-R：5'-TGCACCAACAGTGCTGTAAAC-3'(SEQ ID NO.2)；
所述检测杀雄菌的引物对(Ars-F/R)的上下游引物的核苷酸序列为：
上游引物Ars-F：5'-AGCGCTATTTTCAACGGGTA-3'(SEQ ID NO.3)，
下游引物Ars-R：5'-CGATTACTCGGTAGCGGTGT-3'(SEQ ID NO.4)；
所述检测蚜虫U型共生菌的引物对(Reg-F/R)的上下游引物的核苷酸序列为：
上游引物Reg-F：5'-ACTGCTCCATCGTGGTTTTC-3'(SEQ ID NO.5)，
下游引物Reg-R：5'-CCACGAAAAAGATGCCAAAT-3'(SEQ ID NO.6)。
一种蚜虫共生菌多重PCR检测的方法，该方法是将上述的引物组与待测蚜虫样品的总DNA进行多重PCR反应，反应结束后对PCR反应产物进行电泳分析，以确定蚜虫样品中是否含有蚜虫共生菌，具体包括以下步骤：
(1)引物合成：合成权利要求1所述的引物组中的三种引物对；
(2)DNA模板提取：提取蚜虫样品的总DNA；
(3)多重PCR扩增反应：以步骤(2)提取得到的总DNA为模板，以步骤(1)中合成的引物组为引物，进行PCR扩增反应；
(4)多重PCR产物分析：将步骤(3)中得到的多重PCR扩增产物进行电泳分析。
根据上述蚜虫共生菌多重PCR检测的方法，其中，PCR扩增反应的反应体系为50μl：10×PCR Buffer(100mM/LTris-HCl，500mM/LKCl)5μl，2.5mM/L的dNTPs 4μl，5U/μl的TaqDNA聚合酶0.5μl，10μm/L的wsp-F 2.0μl，10μm/L的wsp-R 2.0μl，10μm/L的Ars-F 2.0μl，10μm/L的Ars-R 2.0μl，10μm/L的Reg-F2.0μl，10μm/L的Reg-R 2.0μl，DNA模板1μl，25mM/L的MgCl23μl，去离子水补至50μl。
根据上述蚜虫共生菌多重PCR检测的方法，PCR扩增反应的反应条件为：
a：94℃预变性4min；
b：94℃变性30s，
c：55℃退火30s，
d：72℃延伸30s，b-d循环35个反应；
e：72℃延伸10min。
上述引物组(其核苷酸序列为SEQ ID NO.1-6)在检测蚜虫样品共生菌感染情况中的应用。
本发明的积极有益效果：
(1)本发明建立了一种具有高灵敏度，能快速鉴定蚜虫样品中三种常见共生菌感染情况的多重PCR检测方法，检测结果和单对引物扩增结果一致，证明本发明方法的可行性。
(2)本发明所建立的检测方法能够在一个PCR反应中同时鉴定蚜虫样品中三种蚜虫共生菌的感染情况，大大降低了工作量，提升了工作效率，节省了一定程度的检测费用。
(3)本发明具有快速、准确、灵敏度高的特点，可以为以蚜虫和共生菌为模式开展的蚜虫种群遗传结构分析、真核和原核生物互作，以及利用共生菌为生物工程菌对蚜虫进行遗传改造等工作中，筛选可靠的实验材料节省人力物力。
附图说明
图1为本发明实施例3中引物浓度梯度筛选和扩增灵敏度分析的琼脂糖凝胶电泳结果：
泳道1-6是单引物PCR扩增实验引物浓度梯度筛选的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果：
其中，泳道1表示以0.2μm/L Ars-F/R为引物的扩增效果；泳道2表示以0.4μm/LArs-F/R为引物的扩增效果；泳道3表示以0.2μm/L Reg-F/R为引物的扩增效果；泳道4表示以0.4μm/L Reg-F/R为引物的扩增效果；泳道5表示以0.2μm/L Wol-F/R为引物的扩增效果；泳道6表示以0.4μm/L Wol-F/R为引物的扩增效果；
泳道7-8是多重PCR扩增实验引物浓度梯度筛选的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果：
其中，泳道7表示多重PCR体系中引物对Ars-F/R、Reg-F/R、Wol-F/R的浓度均为0.2μm/L时的多重PCR扩增效果；
泳道8表示多重PCR体系中引物对Ars-F/R、Reg-F/R、Wol-F/R的浓度均为0.4μm/L时的多重PCR扩增效果；
泳道10-13是多重PCR反应体系中引物扩增灵敏度分析的琼脂糖凝胶电泳结果：
其中，泳道10表示以浓度为102copies/μl的混合质粒作为模板的扩增效果；泳道11表示以浓度为103copies/μl的混合质粒作为模板的扩增效果；泳道12表示以浓度为104copies/μl的混合质粒作为模板的扩增效果；泳道13表示以浓度为105copies/μl的混合质粒作为模板的扩增效果；
泳道M为DL1000Marker，从上到下片段大小依次为：1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
图2为本发明实施例4中多重PCR检测蚜虫样品中共生菌的感染情况的结果(Reg-F/R、Ars-F/R和Wol-F/R的浓度均为0.4μm/L)：
其中，泳道1表示单独感染蚜虫U型共生菌的荻草谷网蚜的多重PCR检测结果；泳道2表示单独感染杀雄菌属的禾谷缢管蚜的多重PCR检测结果；泳道3表示单独感染沃尔巴克氏菌的禾谷缢管蚜的多重PCR检测结果；泳道4表示未感染三种共生菌的荻草谷网蚜的多重PCR检测结果；泳道5表示以浓度为104copies/μl的混合质粒作为模板的多重PCR检测结果；泳道M为DL1000Marker，从上到下片段大小依次为：1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面通过实施例对本发明作进一步说明，但并不限制本发明的范围。除非特别说明，本发明采用的除引物、探针之外的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1：引物的设计与合成：
(1)筛选检测目标的基因或者DNA片段用于引物设计：
本发明首先通过文献分析获得了每一种蚜虫共生菌多重PCR检测的目标基因(见表1)。
表1三种常见蚜虫共生菌多重PCR检测的目标基因
目标微生物 目标基因
沃尔巴克氏菌 wsp基因
杀雄菌属 yaeT基因
蚜虫U型共生菌 gltA基因
(2)wsp基因的引物设计：
在Genbank中下载多个不同沃尔巴克氏菌株系的wsp基因序列(其基因序列号分别为：KJ596656.1、KC137225.1、AB096235.1、AY860419.1、KP208723.1、AB512756.1、AB231470.1、AY157684.1、AB094386.1、AB094385.1、AB109567.1、AB109611.1、GQ385974.1、AB109591.1、KF898395.1)，然后将下载的wsp基因序列导入MEGA 6.0软件中进行多序列比对，获得保守序列，该保守序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.7所示(其中r、y、m和s为简并碱基，r＝a或g；y＝c或t；m＝a或c；s＝g或c)。
将上述wsp基因的保守序列输入Primer Primer6.0软件中，控制参数(引物长度18-20碱基、Tm值57-60℃、GC含量20％-80％)进行引物设计，得到引物设计方案。然后将获得的引物序列在wsp多序列比对结果中进行回比筛选，选择保守性较高的引物序列，并进一步在Genbank中使用Blastn分析检测其特异性。最终得到的最佳引物序列为：
Wol-F：5'-ATAGCTGGTGGTGGTGCATT-3'(SEQ ID NO.1)；
Wol-R：5'-TGCACCAACAGTGCTGTAAAC-3'(SEQ ID NO.2)。
(3)yaeT基因的引物设计：
在Genbank中下载多个不同杀雄菌属株系的yaeT基因序列(其基因序列号分别为：JX188415.1、GU226794.1、GU226791.1、GU226789.1、KF362024.1、GU226788.1、KF362025.1、KC701197.1、JX188417.1)，然后将下载的yaeT基因全长序列导入MEGA 6.0软件中进行多序列比对，获得保守序列，该保守序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.8所示(其中r、y、m、w和k为简并碱基，r＝a或g；y＝c或t；m＝a或c；w＝a或t；k＝g或t)。
将上述yaeT基因的共有序列输入Primer Primer6.0软件中，控制参数(引物长度18-20碱基、Tm值57-60℃、GC含量20％-80％)进行引物设计，得到引物设计方案。然后将获得的引物序列在yaeT多序列比对结果中进行回比筛选，选择保守性较高的引物序列，并进一步在Genbank中使用Blastn分析检测其特异性。最终得到的最佳引物序列为：
Ars-F：5'-AGCGCTATTTTCAACGGGTA-3'(SEQ ID NO.3)；
Ars-R：5'-CGATTACTCGGTAGCGGTGT-3'(SEQ ID NO.4)。
(4)gltA基因的引物设计：
所参考的基因序列为从蚜虫U型共生菌基因组(基因序列号NZ_CM000957.1)中提取出来的gltA基因全长序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.9所示；将该gltA基因全长序列输入Primer Primer6.0软件中，控制参数(引物长度18-20碱基、Tm值57-60℃、GC含量20％-80％)进行引物设计，得到引物设计方案。在Genbank中使用Blastn分析检测其特异性。最终得到的最佳引物序列为：
Reg-F：5'-ACTGCTCCATCGTGGTTTTC-3'(SEQ ID NO.5)，
Reg-R：5'-CCACGAAAAAGATGCCAAAT-3'(SEQ ID NO.6)。
本发明中的引物序列信息详见表2，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
表2三种常见蚜虫共生菌多重PCR检测的引物组
实施例2：模板的制备
1、蚜虫样品总DNA的提取
(1)供试蚜虫材料：本发明中使用的蚜虫材料是2013年4月采集自河南郑州、原阳麦田的荻草谷网蚜(Sitobion miscanthi)和禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi)，随后在实验室进行单雌饲养，检测其共生菌感染情况，建立室内不同共生菌感染种群。本发明中具体采用单独感染沃尔巴克氏菌的禾谷缢管蚜、单独感染杀雄菌属的禾谷缢管蚜、单独感染蚜虫U型共生菌的荻草谷网蚜和未感染共生菌的荻草谷网蚜的四种蚜虫样品作为实验材料，进行实验研究。
(2)蚜虫样品总DNA的提取步骤：取出饲养的单头蚜虫，在75％酒精中进行多次漂洗以除去蚜虫表面菌污染，然后在无菌水中浸泡1-2小时去除酒精。使用灭菌的无菌移液器枪头对蚜虫样品进行研磨，然后使用动物组织和细菌通用DNA提取试剂盒(EasyPureGenomic DNA Extraction Kit，北京全式金生物技术有限公司)进行总DNA的提取，具体的操作参见试剂盒的使用说明。
按照该蚜虫样品总DNA的提取步骤，分别对单独感染沃尔巴克氏菌的禾谷缢管蚜、单独感染杀雄菌属的禾谷缢管蚜、单独感染蚜虫U型共生菌的荻草谷网蚜和未感染共生菌的荻草谷网蚜的四种蚜虫样品进行DNA提取，提取后每一种蚜虫样品的总DNA置于4℃保存备用。
2、制备包含沃尔巴克氏菌wsp基因片段的质粒
(1)PCR扩增反应
以上述提取单独感染沃尔巴克氏菌的禾谷缢管蚜的总DNA提取物为模板，以实施例1合成的Wol-F和Wol-R为引物，进行PCR扩增反应。
PCR扩增反应的反应体系为50μl：10×PCR Buffer(100mM/L Tris-HCl，500mM/LKCl)5μl，2.5mM/L的dNTPs 4μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，10μm/L的上游引物2.0μl，10μm/L的下游引物2.0μl，DNA模板1μl，25mM/L的MgCl23μl，去离子水补至50μl。
PCR扩增反应的反应条件为：
a：94℃预变性4min；
b：94℃变性30s，
c：55℃退火30s，
d：72℃延伸30s，b-d循环35个反应；
e：72℃延伸10min。
(2)PCR产物纯化回收
将步骤(1)中的PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，在1×TAE缓冲液环境中100V稳压电泳40分钟；然后将凝胶置于紫外透射仪或凝胶图象分析仪下进行观察；在凝胶上分别得到1条特异性条带；经过与Maker条带的比较和分析，该特异性条带为wsp基因片段(435bp)的扩增条带。将该特异性条带切下，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(EasyPure QuickGel Extraction Kit，北京全式金生物技术有限公司)进行PCR产物的纯化回收，得到wsp基因的纯化产物，具体纯化回收方法参见琼脂糖凝胶回收试剂盒的使用说明。
(3)目的基因克隆和阳性克隆菌检测
①目的片段的连接
在超净工作台中，将回收的基因片段与pEASY-T1Simple Cloning Vector载体(北京全式金生物技术有限公司)按照载体说明书要求的体系进行混合，然后在25℃的环境中进行连接反应，反应10分钟；
②转化
a.取出100μl在-70℃保存的E.coli Top10感受态细胞，将E.coli Top10感受态细胞冰浴溶解；然后上述的连接产物全部加入到感受态细胞中，柔和地混匀，冰浴30分钟；
b.冰浴结束后，放置于42℃水浴中45秒，然后立即移至冰上放置1～2分钟；
c.在无菌条件下，将经步骤b处理的感受态细胞加入400μl预先保存在37℃的LB液体培养基中，轻轻混匀；然后37℃、120rpm摇菌培养45分钟；
d.得到的菌液在4000rpm离心1分钟，吸去上清液至剩余200μl，然后用移液器将菌体沉淀轻轻悬浮，得到悬浮菌液；
e.将16μl 50mg/ml X-gal和4μl 200mg/ml IPTG均匀涂于含有氨苄的LB琼脂固体培平板上，将200μl的悬浮菌液均匀涂布在LB固体培养平板上，然后先将平板于37℃正放30min，然后在将平板倒置，37℃恒温培养12小时；
③阳性克隆菌检测
a.挑取平板上长出的白色菌落，加入300ul含有氨苄的LB液体培养基中，培养4小时；
b.根据载体中插入基因片段两端的侧翼序列，合成阳性克隆的检测引物对(M13-F：5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'和M13-R：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')步骤a中的菌液进行PCR检测，根据电泳结果筛选阳性克隆；
c.对步骤b中筛选到的阳性克隆菌送至生物公司进行测序，挑选测序正确的阳性克隆菌；
(4)质粒提取
将测序正确的含有wsp基因片段的阳性克隆菌进一步摇菌扩大培养，然后使用质粒提取试剂盒(EasyPure Plasmid MiniPrep Kit，北京全式金生物技术有限公司)进行质粒的提取，得到了含沃尔巴克氏菌wsp基因片段的质粒，将该质粒-20℃保存，备用。
3、制备包含杀雄菌属yaeT基因片段的质粒
包含杀雄菌属yaeT基因片段的质粒的构建方法与包含沃尔巴克氏菌wsp基因质粒的构建方法相同。
4、制备包含蚜虫U型共生菌gltA基因片段的质粒
包含蚜虫U型共生菌gltA基因片段的质粒的构建方法与包含沃尔巴克氏菌wsp基因质粒的构建方法相同。
实施例3：引物的浓度梯度筛选和扩增灵敏度检测
1、引物浓度梯度筛选
(1)单引物PCR扩增实验的引物浓度筛选
分别以上述得到的三种质粒(每一种质粒的浓度为104copies/μl)为模板，对比PCR反应体系中单引物对Wol-F/R、Ars-F/R、Reg-F/R的浓度分别为0.2μm/L和0.4μm/L时PCR反应的扩增效果。
单引物PCR扩增反应的反应体系(PCR反应体系中每次只加入一种质粒作为模板，然后加入该模板对应的引物对)为50μl：10×PCR Buffer(100mM/L Tris-HCl，500mM/LKCl)5μl，2.5mM/L的dNTPs 4μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，10μm/L的上游引物1-2.0μl，10μm/L的下游引物1-2.0μl，DNA模板1μl，25mM/L的MgCl23μl，去离子水补至50μl。
PCR扩增反应的反应条件为：
a：94℃预变性4min；
b：94℃变性30s，
c：55℃退火30s，
d：72℃延伸30s，b-d循环35个反应；
e：72℃延伸10min。
单引物PCR扩增结果如图1中1-6泳道所示，结果可以看出三种共生菌单引物对扩增未出现非特异扩增条带，因而引物具有较高的特异性，而且引物浓度为0.2μm/L和0.4μm/L对单引物扩增结果影响不大。
(2)多重PCR扩增实验的引物浓度梯度筛选：
以混合质粒为模板，考察多重PCR反应体系中每一种引物对浓度分别为0.2μm/L和0.4μm/L时的PCR扩增反应效果。其中，混合质粒是由相同浓度的实施例2制备得到的三种质粒按相同体积混合而成的。例如浓度为104copies/μl的混合质粒是由浓度为3×104copies/μl的含有wsp基因片段的质粒、浓度为3×104copies/μl的含有yaeT基因的质粒和浓度为3×104copies/μl的含有gltA基因的质粒按等体积混合而成。
PCR扩增反应的反应体系为50μl：10×PCR Buffer(100mM/L Tris-HCl，500mM/LKCl)5μl，2.5mM/L的dNTPs 4μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，10μm/L的wsp-F 1.0-2.0μl，10μm/L的wsp-R 1.0-2.0μl，10μm/L的Ars-F 1.0-2.0μl，10μm/L的Ars-R 1.0-2.0μl，10μm/L的Reg-F 1.0-2.0μl，10μm/L的Reg-R 1.0-2.0μl，104copies/μl的混合质粒模板1μl，25mM/L的MgCl23μl，去离子水补至50μl。
PCR扩增反应的反应条件为：
a：94℃预变性4min；
b：94℃变性30s，
c：55℃退火30s，
d：72℃延伸30s，b-d循环35个反应；
e：72℃延伸10min。
多重PCR扩增结果如图1中7、8泳道所示，结果可以看出三种共生菌多重引物对扩增未出现非特异扩增条带，具有较高的特异性，而且引物浓度为0.4μm/L相对于0.2μm/L有较好的扩增效果。
(6)多重PCR反应体系中引物扩增灵敏度的检测
分别以浓度为102copies/μl、103copies/μl、104copies/μl、105copies/μl的混合质粒为模板，以三对引物对的混合物为引物(引物中每一种引物对的浓度均为0.4μm/L)，进行多重PCR扩增反应，考察多重PCR检测模板的灵敏度。
PCR扩增反应的反应体系为50μl：10×PCR Buffer(100mM/L Tris-HCl，500mM/LKCl)5μl，2.5mM/L的dNTPs 4μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，10μm/L的wsp-F 2.0μl，10μm/L的wsp-R 2.0μl，10μm/L的Ars-F 2.0μl，10μm/L的Ars-R2.0μl，10μm/L的Reg-F 2.0μl，10μm/L的Reg-R 2.0μl，混合质粒模板1μl，25mM/L的MgCl23μl，去离子水补至50μl。
PCR扩增反应的反应条件为：
a：94℃预变性4min；
b：94℃变性30s，
c：55℃退火30s，
d：72℃延伸30s，b-d循环35个反应；
e：72℃延伸10min。
多重PCR扩增结果如图1中泳道10-13所示，当混合质粒浓度为104copies/μl、105copies/μl时，多重PCR扩增后均出现特异性扩增条带，当混合质粒浓度为102copies/μl、103copies/μl时多重PCR扩增后未出现特异性扩增条带。因此，本发明构建的多重PCR反应体系最低可以检测到浓度为104copies/μl分别含有wsp基因、yaeT基因、gltA基因的混合质粒，具有较高的检测灵敏度。
实施例4：多重PCR检测蚜虫样品中共生菌的感染情况
分别以单独感染沃尔巴克氏菌的禾谷缢管蚜的总DNA、单独感染杀雄菌属的禾谷缢管蚜的总DNA、单独感染蚜虫U型共生菌的荻草谷网蚜的总DNA和未感染共生菌的荻草谷网蚜的总DNA为模板，判断本发明建立的多重PCR反应体系对蚜虫共生菌感染检测的效果。
PCR扩增反应的反应体系为50μl：10×PCR Buffer 5μl；2.5mM/L的dNTPs 4μl；5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，10μm/L的wsp-F 2.0μl，10μm/L的wsp-R 2.0μl，10μm/L的Ars-F2.0μl，10μm/L的Ars-R 2.0μl，10μm/L的Reg-F 2.0μl，10μm/L的Reg-R 2.0μl，蚜虫DNA模板1μl，25mM/L的MgCl23μl，去离子水补至50μl。
PCR扩增反应的反应条件为：
a：94℃预变性4min；
b：94℃变性30s，
c：55℃退火30s，
d：72℃延伸30s，b-d循环35个反应；
e：72℃延伸10min。
多重PCR检测蚜虫样品中共生菌的感染情况的结果如图2所示，结果显示，在感染蚜虫共生菌的蚜虫样品中出现了与感染的共生菌相对应的特异性扩增条带，而在未感染蚜虫共生菌的蚜虫样品中无特异性扩增条带出现。因此，本发明设计的引物组对蚜虫种群中三种共生菌的感染检测具有较高的特异性，本发明的多重PCR检测方法可以应用在蚜虫样品三种共生菌感染检测的相关工作中。

Claims (3)

1.一种蚜虫共生菌多重PCR检测的引物组，其特征在于，所述引物组是由检测沃尔巴克氏菌(Wolbachia pipientis)、杀雄菌属(Arsenophonus)和蚜虫U型共生菌(Regiella insecticola)的引物对组成；
所述检测沃尔巴克氏菌引物对的上下游引物的核苷酸序列为：
上游引物Wol-F：5'-ATAGCTGGTGGTGGTGCATT-3'(SEQIDNO.1)，
下游引物Wol-R：5'-TGCACCAACAGTGCTGTAAAC-3'(SEQIDNO.2)；
所述检测杀雄菌引物对的上下游引物的核苷酸序列为：
上游引物Ars-F：5'-AGCGCTATTTTCAACGGGTA-3'(SEQIDNO.3)，
下游引物Ars-R：5'-CGATTACTCGGTAGCGGTGT-3'(SEQIDNO.4)；
所述检测蚜虫U型共生菌引物对的上下游引物的核苷酸序列为：
上游引物Reg-F：5'-ACTGCTCCATCGTGGTTTTC-3'(SEQIDNO.5)，
下游引物Reg-R：5'-CCACGAAAAAGATGCCAAAT-3'(SEQIDNO.6)。
2.一种蚜虫共生菌多重PCR检测的方法，其特征在于，将权利要求1所述的引物组与待测蚜虫样品的总DNA进行多重PCR反应，反应结束后对PCR反应产物进行电泳分析，以确定蚜虫样品中是否含有蚜虫共生菌，具体包括以下步骤：(1)引物合成：合成权利要求1所述的引物组中的三种引物对；
(2)DNA模板提取：提取蚜虫样品的总DNA；
(3)多重PCR扩增反应：以步骤(2)提取得到的总DNA为模板，以权利要求1所述的引物组为引物，进行PCR扩增反应；
所述PCR扩增反应的反应体系为50μl：10×PCR Buffer5μl，2.5mM/L的dNTPs4μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，10μm/L的wsp-F2.0μl，10μm/L的wsp-R2.0μl，10μm/L的Ars-F2.0μl，10μm/L的Ars-R2.0μl，10μm/L的Reg-F2.0μl，10μm/L的Reg-R2.0μl，DNA模板1μl，25mM/L的MgCl23μl，去离子水补至50μl；
PCR扩增反应的反应条件为：
a：94℃预变性4min；
b：94℃变性30s，
c：55℃退火30s，
d：72℃延伸30s，b-d循环35个反应；
e：72℃延伸10min；
(4)多重PCR产物分析：将步骤(3)中得到的多重PCR扩增产物进行电泳分析。
3.权利要求1所述的引物组在检测蚜虫样品共生菌感染情况中的应用。
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