CN102209794A - 用于生物样本中低丰度rna种类特异性检测的方法 - Google Patents

用于生物样本中低丰度rna种类特异性检测的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102209794A
CN102209794A CN2009801456057A CN200980145605A CN102209794A CN 102209794 A CN102209794 A CN 102209794A CN 2009801456057 A CN2009801456057 A CN 2009801456057A CN 200980145605 A CN200980145605 A CN 200980145605A CN 102209794 A CN102209794 A CN 102209794A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mycoplasma
rna
pcr
cdna
rrna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2009801456057A
Other languages
English (en)
Inventor
托马斯·黑默勒
卡斯滕·乌尔班
弗朗茨·格鲁贝尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baxter Healthcare SA
Baxter International Inc
Original Assignee
Baxter Healthcare SA
Baxter International Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baxter Healthcare SA, Baxter International Inc filed Critical Baxter Healthcare SA
Publication of CN102209794A publication Critical patent/CN102209794A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Abstract

本发明涉及一种用于检测生物样本中低丰度RNA种类的方法和试剂盒，并且涉及一种用于检测生物样本中支原体污染的方法和试剂盒。

Description

用于生物样本中低丰度RNA种类特异性检测的方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测生物样本中低丰度RNA种类的方法和试剂盒，并且涉及一种用于检测生物样本中支原体污染的方法和试剂盒。
背景技术
最广泛推广和最成功的检测和分析RNA分子的方法是所谓的RT/PCR(逆转录/聚合酶链反应)。在这该方法中，RNA分子通过逆转录酶(RT)被转录成cDNA分子，然后通过基于的PCR方法被检测和/或分析。
该领域早期的研究人员已经使用禽类成髓瘤细胞病毒RT或莫洛尼鼠白血病病毒RT用于逆转录。然而，使用RNA作为模板用于cDNA合成的显著问题是这些嗜温的病毒性RT不能通过稳定的RNA二级结构合成cDNA。为了克服该问题，可以在提高的反应温度下进行逆转录，其可能分解二级RNA结构，另外提高引物延伸的特异性。这需要的使用热稳定性酶比如嗜热栖热菌Thermus thermophilus DNA聚合酶(Tth pol)用于逆转录，该酶在最适温度70℃下具有活性。
然而，热稳定性酶用于逆转录还会产生新的问题。特别地，当设法检测和/或分析生物样本中低丰度RNA种类时，用于逆转录的热稳定性酶可能在随后的RT/PCR步骤期间催化产生非特异性反应产物。这尤其会发生在样品具有大本底总RNA的情况中，并且导致标靶RNA检测极限的大幅度增加，达到远高于可能需要的水平例如生物药物产品的质量对照所需要水平。为了克服该问题，在逆转录之后所有的处理和RT/PCR步骤不得不在高温下并在热启动(hotstart)条件下进行。然而，这往往是不切实际的和不利的，特别是当以工业规模工作时。
特别相关的是，通常在大本底总RNA中低丰度RNA种类的灵敏检测的应用是生物样本中支原体污染的检测。
支原体是具有已知最小的能自我复制的基因组中之一的细菌性微生物。而大多数支原体是天生地无害的共生体，它们中有些能感染它们的天然寄主并且引起严重程度不同的疾病。支原体，尤其是支原体属和莱德劳无胆甾原体(Acholeplasma)属中的种类，也频繁地引起原始细胞系和连续细胞系的污染，并且代表了涉及来源于细胞的生物制品和药物产品的研发和生产中的研究实验室和工业实验室的严重问题。这样，尽管在细胞系增殖加工和处理期间通常采用所有的预防措施，支原体污染仍然经常引起问题。
对于细胞系和来源于细胞的生物制品的支原体测试，推荐的分析方案包括使用肉汤/琼脂培养和指示剂细胞系测试。肉汤/琼脂培养方法的目的在于检测可培养的支原体试剂，而指示剂细胞系被用于检测挑剔的不可培养的支原体种类。尽管这两个方法的组合使得能够进行有效的支原体检测，但是总体测试工序是昂贵的、费力的且耗时的(最少28天)。此外，存在许多不可培养的支原体种类，它们不适用该方法。
人们最近开发出新颖的以扩增核酸、尤其是来源于支原体的核蛋白体RNA为基础的支原体测试方法。就成本、分析的灵敏度、简单性和时间而言，这些方法具有某些优点。然而，目前可利用的方法中的检测限仍然在生物药物产品的质量控制所需要之上，特别是当使用具有总RNA或其他高分子大本底的样品工作时。
因此，在该技术领域仍需要改善当前的RT/PCR方法，以便允许提高生物样本中低丰度RNA种类的检测限。
通过权利要求中表征的实施方式实现了上述问题的解决。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种改进的用于检测生物样本中低丰度RNA种类的方法。特别地，本发明涉及用于检测生物样本中低丰度RNA种类的所述方法和试剂盒。进一步地，本发明的另一个目的是提供一种改进的用于检测样品中支原体污染的方法和试剂盒。
具体实施方式
在一个方面，本发明涉及一种用于检测生物样本中低丰度标靶RNA种类的方法，包括下述步骤：
(a)使用逆转录酶(RT)，将RNA逆转录成cDNA；
(b)使RT失活；以及
(c)通过聚合酶链反应(PCR)检测标靶cDNA。
在此使用的术语“生物样本”涉及任何含有或者怀疑含有生物学相关高分子的样本，例如来源于生物药物产品生产工艺中多个阶段的样本，例如疫苗或者重组体蛋白、细胞培养上清液、细胞裂解液、细胞抽提物、食品或者环境的样品；来源于人或动物身体的样本，比如全血、血清、血浆、尿液、体液或者斑迹；任何生物来源的其它样品；以及任何含有或者怀疑含有RNA的其他组合物。
在本发明的一种优选实施方式中，生物样本具有细胞组分大本底。
在此使用的术语“细胞组分”涉及细胞器、蛋白质、多肽、细胞膜、脂类、核酸，特别是非靶向RNA种类、以及其组合或片段。
在本发明的另一个优选的实施方式中，生物样本具有总RNA大本底。
在此使用的术语“总RNA大本底”是指这样一种情况：标靶RNA在104个总RNA分子中以少于一个分子存在，优选在106个总RNA分子中以少于一个分子存在，更优选在108个总RNA分子中以少于一个分子存在，最优选在1010个总RNA分子中以少于一个分子存在。
在本发明的一种优选实施方式中，标靶RNA存在的含量少于每毫升样本中10000个拷贝、优选少于每毫升样本中1000个拷贝、更优选每毫升样本中少于100个拷贝、并且最优选少于每毫升样本中10个拷贝。
根据本发明的一个优选实施方式，根据本发明的方法使用RT将RNA逆转录成cDNA是在热启动条件下进行的。
在此使用的术语“热启动条件”涉及任何下述条件：其中在加入引物延伸的酶之前，将反应混合物加热至或高于引物/核酸复合物的解链温度，或者其中引物延伸的酶在室温下无活性、并且通过高温活化步骤被活化，所述高温活化步骤在引物/核酸复合物的解链温度或高于此温度下进行。
在本发明的一种优选实施方式中，本发明的方法进一步包括在使用RT将RNA逆转录成cDNA后，使用相同的RT扩增标靶cDNA的步骤。该进一步的步骤被称作“PrimePCR”，并且优选在热启动条件下进行5至15个循环，更优选在热启动条件下进行5至11个循环，并且最优选在热启动条件下进行5或10个循环。
因此，在另一个方面，本发明涉及一种用于检测生物样本中低丰度RNA种类的方法，包括下述步骤：
(a)使用逆转录酶(RT)，将RNA逆转录成cDNA；
(b)使用步骤(a)中的RT，通过聚合酶链反应(PCR)扩增cDNA；
(c)使RT失活；以及
(d)通过PCR检测标靶cDNA。
本领域中已知的兼具RT(即RNA依赖性DNA聚合酶)和DNA聚合酶(即DNA依赖性DNA聚合酶)活性的酶包括例如嗜热栖热菌Thermus thermophilus DNA聚合酶(Tth pol)。特定酶显示出特定活性的条件也是本技术领域公知的。就Tth pol而言，逆转录酶活性被Mn2+离子促进，并且DNA聚合酶活性被Mg2+离子促进。
在本发明的一种优选实施方式中，在本发明的方法中使用的RT是嗜热栖热菌Thermus thermophilus DNA聚合酶(Tth pol)。在进一步优选的实施方式中，Tth pol是通过重组法产生的(rTth-pol)。
在本发明的另一个优选的实施方式中，RT在本发明的方法中被失活，优选通过选自于下组的方法失活：热处理、用苯酚处理、用蛋白酶K处理、以及用离液(chaotropic)试剂处理。
根据本发明的热处理包括加热含有RT的反应混合物至80-100℃、优选至90-100℃、更优选至95℃。热处理的持续时间是15至90分钟、优选30至75分钟、更优选60分钟。在特别优选的实施方式中，热处理包括加热含有RT的反应混合物至95℃保持60分钟。
根据本发明用蛋白酶K处理包括向反应混合物中加入1至10个单位的蛋白酶K，更优选加入2至5个单位的蛋白酶K，最优选加入5个单位的蛋白酶K。蛋白酶K处理的持续时间是30至90分钟、优选45至75分钟、最优选60分钟。在特别优选的实施方式中，用蛋白酶K处理包括加入5个单位的蛋白酶K保持60分钟。
在本发明的一种优选实施方式中，在本发明的方法中通过用离液试剂处理使RT失活。根据本发明用离液试剂处理包括向含有RT的反应混合物中加入一定含量的离液试剂并保持足以使RT失活的一段时间。特定的离液试剂含量和时间为本领域技术人员所熟知。在本发明的更优选的实施方式中，离液试剂选自下组：脲，高氯酸锂和胍盐。在最优选的实施方式中，离液试剂是胍盐。
在本发明进一步优选的实施方式中，本发明的方法还包括在使用离液试剂使RT失活后从反应混合物中除去离液试剂的步骤。从反应混合物中除去离液试剂的方法为本领域技术人员所熟知，并且包括例如通过使用DNA结合性离心柱(spin column)纯化反应混合物中包含的核酸。
通过PCR检测标靶cDNA也被称为“boost PCR”。在本发明的一种优选实施方式中，在本发明方法中的聚合酶链反应(PCR)是实时PCR。
在此使用的术语“实时PCR”涉及任何基于聚合酶链反应(PCR)、并且允许扩增并同时定量标靶DNA分子的方法。
在本发明的一种优选实施方式中，标靶RNA源自于支原体。在此使用的术语“支原体”涉及任何柔膜细菌纲的成员，包括支原体属(Mycoplasma)、脲原体属(Ureaplasma)、中间原体属(Mesoplasma)、虫原体属(Entomoplasma)、螺原体属(Spiroplasma)，无胆甾原体属(Acholeplasma)、无甾醇原体属(Asteroleplasma)、以及热原体属(Thermoplasma)。在本发明更优选的实施方式中，支原体选自下组：莱德劳无胆甾原体(Acholeplasma laidlawii)、鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)、猪鼻炎支原体(Mycoplasma hyorhinis)，人支原体(Mycoplasma hominis)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans)、滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)、以及口腔支原体(Mycoplasma orale)。
在本发明进一步优选的实施方式中，标靶RNA是16S核蛋白体RNA(16SrRNA)。
在另一个方面，本发明涉及一种用于检测生物样本中支原体污染的方法，包括下述步骤：
(a)从样本中提取总RNA；
(b)使用逆转录酶(RT)，将RNA逆转录成cDNA；
(c)使用步骤(b)中的RT，通过聚合酶链反应(PCR)扩增来源于支原体16S核蛋白体RNA(16S rRNA)的cDNA；
(d)通过添加离液试剂使RT失活；
(e)从反应混合物中除去离液试剂；以及
(f)通过聚合酶链反应(PCR)检测来源于支原体16S rRNA的cDNA。
从样本中提取总RNA的手段为本领域技术人员所熟知，并且包括用苯酚/氯仿提取和用异丙醇沉淀。
在本发明的一种优选实施方式中，待检测的支原体污染是样品中大约10cfu/mL支原体以下的污染。
用于支原体16S rRNA逆转录的引物、以及用于通过PCR扩增来源于支原体16S rRNA的cDNA的引物为本领域技术人员所熟知。
在本发明的一种优选实施方式中，用于检测样品中支原体污染的方法中使用RT将RNA逆转录成cDNA是在热启动条件下进行的。
在本发明的另一个优选的实施方式中，在用于检测样品中支原体污染的方法中使用的RT是嗜热栖热菌Thermus thermophilus DNA聚合酶(Tth pol)。在进一步优选的实施方式中，Tth pol是通过重组法产生的(rTth-pol)。
在本发明进一步优选的实施方式中，在用于检测样品中支原体污染的方法中使用的离液试剂选自下组：脲，高氯酸锂和胍盐。在最优选的实施方式中，离液试剂是胍盐。
在本发明进一步优选的一个实施方式中，在用于检测样品中支原体污染的方法中使用的PCR是实时PCR。
在另一个方面，本发明涉及一种用于检测生物样本中低丰度标靶RNA种类的试剂盒，其包括至少一种RT和用于使RT失活的手段。用于使RT失活的手段可以是蛋白酶K或离液试剂。该试剂盒可以进一步包括例如用于逆转录的引物、用于检测特异性cDNA的引物、载体RNA、校准物RNA、校准物DNA、合适的酶、缓冲液、试剂、反应容器和耗材。
在另一个方面，本发明涉及一种用于检测生物样本中支原体污染的试剂盒，其包括至少一种重组嗜热栖热菌Thermits thermophilus DNA聚合酶(rTth-pol)、适用于支原体16S rRNA逆转录的引物、适用于扩增来源于支原体16S rRNA的cDNA的引物、用于使rTth-pol失活的离液试剂、用于从反应混合物中除去离液试剂的装置、以及用于通过PCR例如实时PCR检测来源于支原体16S rRNA的cDNA的引物。用于除去离液试剂的装置可以是DNA结合性离心柱。该试剂盒可以进一步包括例如用于从样本中提取总RNA的手段、载体RNA、校准物RNA、校准物DNA、合适的酶、缓冲液、试剂、反应容器和/或耗材。用于提取总RNA的手段可以是苯酚、氯仿和异丙醇、或含有苯酚、氯仿和异丙醇的缓冲液。以下用实施例进一步阐明本发明，但并不是对本发明作任何限制。
实施例
一般工序：
该方法从离心所关注的生物样本开始，接着从样本团块中提取总RNA。然后使用重组嗜热栖热菌Thermus thermophilus DNA聚合酶(rTth-pol)，在Mn2+存在的条件下在热启动条件下将RNA逆转录成cDNA。在Mn2+螯合并且加入Mg2+后，在热启动条件下，rTth-pol进行PCR扩增5个循环，或者10个循环(Prime PCR)。然后将PCR反应产物转入含有胍的缓冲液以使rTth-pol失活。基于离心柱(spin column)的试剂盒进行纯化，得到纯化的Prime PCR的PCR产物，然后在双重的实时PCR(boost PCR)中与DNA标准(校准物DNA)一起共扩增。作为选择之一，可以在RNA提取开始时将RNA标准(校准物RNA)加入，以便从开始就标准化并控制该工序。
实验工序：
RNA提取。所有步骤在2mL反应试管中进行。将2mL的样品在4℃下以1000rpm离心10min。将团块再悬浮于1mL的RNA-BeeTM(Tel-Test公司，德克萨斯州)，加入5μL的1mg/ml酵母tRNA，并且样品在离心机中于70℃和1000rpm下孵育20分钟。此后，加入110μL氯仿，并且通过在13000rpm下离心5分钟而将各相分离。通过将500μL异丙醇加入得到的上层相中来沉淀RNA，并且样品被保存在干冰上5分钟。通过在13000rpm下离心15分钟收集RNA团块，用500μL 70％乙醇洗涤，并且样品在13000rpm下离心10min。弃去上清液，将RNA团块溶于250μL的bidest水中。(bdH2O)。
逆转录。将6μLRT混合物(1μL 10x逆转录缓冲液(APPLY BIOSYSTEM，奥地利)、1μL的10mM MnCl2、0.5μL的10μM反向引物、0.8μL的2.5mM各种dNTP，2.2μL(5.5U)rTth-pol和0.5μLbdH2O)加至4μL的RNA萃取物中。逆转录在80℃下进行2min，在62℃下5分钟，在70℃下10min，并且在80℃下2min。
Prime PCR。将预先加热至85℃±5℃的40μL PCR混合物(4μL10x螯合缓冲液(APPLY BIOSYSTEM，奥地利)、5μL的25mM MgCl2、2.5μL的10μM正向引物、2μL的10μM反向引物和26.5μL的bdH2O)加至从逆转录得到的反应混合物中。根据下面的方案进行PCR：80℃下2min，95℃下2min，5x(在95℃下10秒，62℃下30秒，72℃下30秒)。
RT失活。在prime PCR后，将50μL仍然在热反应的混合物加至253μL失活缓冲液(3μL载体RNA(1μg/μL酵母tRNA)和250μL缓冲液PBI(Qiaquick PCR纯化试剂盒；Qiagen公司，德国))并混合物。将样本施加于在2mL接收管中的Qiaquick微型离心柱(Qiagen公司，德国)，并且在13000rpm下离心1min。弃去接收管，将离心柱置于新鲜的接收管中，加入750μL缓冲液PE(Qiaquick PCR纯化试剂盒；Qiagen公司，德国)，并且样品于13000rpm下离心1min。再次弃去接收管，并且在新鲜的接收管中将离心柱于13000rpm下离心1min。然后将离心柱置于新鲜的1.5mL反应试管中，加入50μL的10mM Tris(pH 8.0)，并且通过在13000rpm下离心1min洗脱DNA。
Boost PCR。将10μL洗脱的DNA放进光学试管中，并且加入5μL作为对照物的校准物DNA和35μL TMPCR混合物(1x TaqMan缓冲液A(APPLY BIOSYSTEM，奥地利)、5mM MgCl2、200nM每种引物、100nM每种探针、200μM的每种dNTP、9％甘油(wt/体积)、0.05％明胶(wt/体积)、0.01％吐温20(wt/体积)、2.5U AmpliTaq Gold聚合酶(APPLY BIOSYSTEM，奥地利))。根据下面的方案进行实时PCR：95℃下10min，40x(95℃下15秒，62℃下1min)。
实施例1：检测来源于疫苗制造工艺的样本中的滑液囊支原体
来源于疫苗制造工艺的样本中被掺入不同含量的滑液囊支原体，并且根据上述实验工序进行操作。为了表明RT失活的有益效果(样本1至6)，对照样品被包括进来，其中RT未被失活(样本7至12)，或者其中根本没有加入RT(样本13至18)。在RNA提取、逆转录、prime PCR和RT失活后，通过实时PCR分析样本cDNA的存在。在该boost PCR之前，将限定含量的校准物DNA加至反应混合物中。使用不同组的引物，将该校准物DNA与标靶核酸一起扩增。使用不同的标记物探针区分来自校准物DNA和标靶DNA的信号。用于prime PCR和boost PCR的引物对于支原体16S rRNA是特异性的。结果概括于表1中，显示出来自实时PCR的Ct值，即检测特异性PCR产物所需要的循环数。较低的值意味着更简便的检测，反之Ct值40表明在整个实时PCR运行中没有产品可被检测到。
表1：检测来源于疫苗制造工艺的样本中的滑液囊支原体
表1中的结果明显地表明，有活性的RT的存在(样本7至12)的确不允许检测出甚至100cfu/mL滑液囊支原体，而RT失活允许检测出甚至少到10cfu/mL的滑液囊支原体。对于在没有失活RT的样品中的校准物DNA的Ct值的提高表明，在不失活的情况下，RT能催化导致非特异性的反应产物的反应，所述反应产物在boost PCR期间可干扰校准物DNA和标靶DNA的特异性产物的产生。该解释得到了下述事实的支持：在根本未加入RT的样品(样本13至18)中，对于校准物DNA的Ct值再次与其中RT被失活的样品(样本1至6)处于在同一水平上。
实施例2：检测来源于疫苗制造工艺的样本中的发酵支原体
与实施例1中相同的样本被掺入不同含量的发酵支原体，并且根据上述实验工序进行操作。为了表明RT失活的有益效果(样本1至6)，对照样品被包括进来，其中RT未被失活(样本7至12)。在RNA提取、逆转录、prime PCR和RT失活后，通过实时PCR分析样本cDNA的存在。在该boost PCR之前，将限定含量的校准物DNA加至反应混合物中。用于prime PCR和boost PCR的引物对于支原体16S rRNA再次是特异性的。结果概括于表2中，显示出来自于实时PCR的Ct值。
表2：检测来源于疫苗制造工艺的样本中的发酵支原体
Figure BPA00001372366100101
表2中的结果证实，有活性的RT的存在(样本7至12)的确不允许检测出甚至100cfu/mL的发酵支原体，而RT失活允许检测出甚至少到10cfu/mL的发酵支原体。对于在没有失活RT的样品中校准物DNA的Ct值的提高再次证实，在不失活的情况下，RT能催化导致非特异性的反应产物的反应，所述反应产物可在boost PCR期间干扰校准物DNA和标靶DNA的特异性产物的产生。
实施例3：检测来源于重组体蛋白制造工艺的样本中的发酵支原体
来源于重组体蛋白制造工艺的样本中被掺入不同含量的发酵支原体，并且根据上述实验工序进行操作。RT失活的有益有效果如表3所示，样本1到6。至于来源于疫苗制造工艺的样品，该工序也允许检测出少到10cfu/mL的掺入用于制造重组体蛋白的细胞混悬液中的发酵支原体。
表3：检测来源于重组体蛋白制造工艺的样本中的发酵支原体

Claims (23)

1.一种用于检测生物样本中低丰度标靶RNA种类的方法，其包括下述步骤：
(a)使用逆转录酶(RT)，将RNA逆转录成cDNA；
(b)使RT失活；以及
(c)通过聚合酶链反应(PCR)检测标靶cDNA。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物样本具有细胞组分大本底。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物样本具有总RNA大本底。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)是在热启动条件下进行的。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括在步骤(a)之后，使用步骤(a)中的所述RT扩增标靶cDNA的步骤。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RT是重组的嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)DNA聚合酶(rTth-pol)。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中通过选自于下组的方法使所述RT失活：热处理、用苯酚处理、用蛋白酶K处理、以及用离液试剂处理。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，通过用离液试剂处理使所述RT失活。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括在步骤(b)之后从反应混合物中除去所述离液试剂的步骤。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述离液试剂选自下组：脲、高氯酸锂和胍盐。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述离液试剂是胍盐。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中的聚合酶链反应(PCR)是实时PCR。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标靶RNA源自于支原体。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述支原体选自下组：莱德劳无胆甾原体、鸡败血支原体、猪鼻炎支原体、人支原体、发酵支原体、滑液囊支原体、以及口腔支原体。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述标靶RNA是16S核蛋白体RNA。
16.一种用于检测生物样本中支原体污染的方法，其包括下述步骤：
(a)从生物样本中提取总RNA；
(b)使用逆转录酶(RT)，将RNA逆转录成cDNA；
(c)使用步骤(b)中的RT，通过聚合酶链反应(PCR)扩增来源于支原体16S核蛋白体RNA(16S rRNA)的cDNA；
(d)通过添加离液试剂使RT失活；
(e)从反应混合物中除去所述离液试剂；以及
(f)通过聚合酶链反应(PCR)检测来源于支原体16S rRNA的cDNA。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，步骤(b)是在热启动条件下进行的。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述RT是重组的嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)DNA聚合酶(rTth-pol)。
19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述离液试剂选自下组：脲、高氯酸锂和胍盐。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述离液试剂是胍盐。
21.如权利要求16所述的方法，其特征在于，步骤(f)中的聚合酶链反应(PCR)是实时PCR。
22.一种用于检测在总RNA大本底中的低丰度标靶RNA种类的试剂盒，其包含至少一种逆转录酶(RT)和用于使RT失活的装置。
23.一种用于检测生物样本中支原体污染的试剂盒，其包含至少一种重组嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)DNA聚合酶(rTth-pol)、适用于支原体16S rRNA逆转录的引物、适用于扩增来源于支原体16S核蛋白体RNA(16S rRNA)的cDNA的引物、用于使所述rTth-pol失活的离液试剂、用于从反应混合物中除去所述离液试剂的装置、以及用于通过实时PCR检测来源于支原体16S rRNA的cDNA的引物。
CN2009801456057A 2008-11-14 2009-11-12 用于生物样本中低丰度rna种类特异性检测的方法 Pending CN102209794A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11485808P 2008-11-14 2008-11-14
US61/114,858 2008-11-14
PCT/EP2009/008071 WO2010054819A1 (en) 2008-11-14 2009-11-12 Method for the specific detection of low abundance rna species in a biological sample

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102209794A true CN102209794A (zh) 2011-10-05

Family

ID=41508316

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009801456057A Pending CN102209794A (zh) 2008-11-14 2009-11-12 用于生物样本中低丰度rna种类特异性检测的方法

Country Status (13)

Country Link
US (2) US8288101B2 (zh)
EP (1) EP2347013B1 (zh)
JP (1) JP5470400B2 (zh)
CN (1) CN102209794A (zh)
AU (1) AU2009315891B2 (zh)
BR (1) BRPI0921147B1 (zh)
CA (1) CA2743503A1 (zh)
DK (1) DK2347013T3 (zh)
HK (1) HK1159692A1 (zh)
IL (1) IL212644A (zh)
RU (1) RU2524115C9 (zh)
SG (1) SG171735A1 (zh)
WO (1) WO2010054819A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105385676A (zh) * 2015-11-05 2016-03-09 杭州易文赛生物技术有限公司 一种提取dna的方法和解离染色质的方法以及高氯酸盐的用途
CN113999897A (zh) * 2021-12-31 2022-02-01 北京金诺美生物技术有限公司 一种rt-pcr反应体系、rt-pcr方法及应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2019243332B2 (en) * 2018-03-26 2022-07-07 Mitsui Chemicals, Inc. Bacterial identification method using RNA of sample bacteria, and kit therefor
CN109055479A (zh) * 2018-09-10 2018-12-21 山东省科学院生态研究所 一种地形逆温区域灰霾空气污染程度检测预警方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060257871A1 (en) * 2002-11-12 2006-11-16 Franck Chaubron One step real-time rt pcr kits for the universal detection of organisms in industrial products

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5889159A (en) * 1993-10-29 1999-03-30 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Monoclonal antibodies to tumor marker TC1 and methods for use of same
US5512462A (en) * 1994-02-25 1996-04-30 Hoffmann-La Roche Inc. Methods and reagents for the polymerase chain reaction amplification of long DNA sequences
EP1477561B1 (en) 1996-10-17 2008-12-10 Mitsubishi Chemical Corporation Molecule assigning genotype to phenotype and use thereof
DE69939388D1 (de) * 1998-09-24 2008-10-02 Innogenetics Nv Identizierung von microorganismen,die akute atemwegsinfektionen verursachen
US6132997A (en) * 1999-05-28 2000-10-17 Agilent Technologies Method for linear mRNA amplification
US20030124654A1 (en) * 2002-01-03 2003-07-03 Reliance Life Sciences Private Limited Method and device for the rapid clinical diagnosis of hepatitis C virus (HCV) infection in biological samples
US20050250112A1 (en) * 2004-05-07 2005-11-10 Padmabandu Gothami A Nucleic acids, compositions, methods, and kits for detecting mycoplasma and acholeplasma species
RU2274449C1 (ru) * 2004-10-19 2006-04-20 Кировская государственная медицинская академия (КГМА) Способ повышения чувствительности метода пцр диагностики микоплазменной урогенитальной инфекции у больных с выраженным экссудативным воспалением
JP2009072062A (ja) * 2006-04-07 2009-04-09 Institute Of Physical & Chemical Research 核酸の５’末端を単離するための方法およびその適用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060257871A1 (en) * 2002-11-12 2006-11-16 Franck Chaubron One step real-time rt pcr kits for the universal detection of organisms in industrial products

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DARRELL P ET AL: "Reverse Transcriptase(RT) Inhibition of PCR at Low Concentrations of Template and Its Implications for Quantitative RT-PCR", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *
G.HAUKENES ET AL: "Highly Sensitive Method to Detect mRNAs in Individual Cells by Direct RT-PCR Using Tth DNA Polymerase", 《BIOTECHNIQUES》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105385676A (zh) * 2015-11-05 2016-03-09 杭州易文赛生物技术有限公司 一种提取dna的方法和解离染色质的方法以及高氯酸盐的用途
CN105385676B (zh) * 2015-11-05 2018-10-02 杭州易文赛生物技术有限公司 一种提取dna的方法和解离染色质的方法以及高氯酸盐的用途
CN113999897A (zh) * 2021-12-31 2022-02-01 北京金诺美生物技术有限公司 一种rt-pcr反应体系、rt-pcr方法及应用
CN113999897B (zh) * 2021-12-31 2022-04-01 北京金诺美生物技术有限公司 一种rt-pcr反应体系、rt-pcr方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
SG171735A1 (en) 2011-07-28
IL212644A (en) 2015-04-30
EP2347013B1 (en) 2014-06-18
DK2347013T3 (da) 2014-08-11
RU2524115C9 (ru) 2014-12-10
CA2743503A1 (en) 2010-05-20
US20100124748A1 (en) 2010-05-20
BRPI0921147B1 (pt) 2019-12-03
BRPI0921147A2 (pt) 2016-02-23
US8288101B2 (en) 2012-10-16
AU2009315891A1 (en) 2010-05-20
AU2009315891B2 (en) 2013-03-28
RU2011123897A (ru) 2012-12-20
IL212644A0 (en) 2011-07-31
HK1159692A1 (zh) 2012-08-03
US20130004958A1 (en) 2013-01-03
EP2347013A1 (en) 2011-07-27
RU2524115C2 (ru) 2014-07-27
JP2012508567A (ja) 2012-04-12
JP5470400B2 (ja) 2014-04-16
WO2010054819A1 (en) 2010-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Garneau et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA
Feinstein et al. Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil
EP1877576B1 (en) Methods for determining sequence variants using ultra-deep sequencing
Burtscher et al. Evaluation of the use of PCR and reverse transcriptase PCR for detection of pathogenic bacteria in biosolids from anaerobic digestors and aerobic composters
Yang et al. Direct metatranscriptome RNA-seq and multiplex RT-PCR amplicon sequencing on Nanopore MinION–promising strategies for multiplex identification of viable pathogens in food
Braun et al. Microevolution of anthrax from a young ancestor (MAYA) suggests a soil-borne life cycle of Bacillus anthracis
CN103866034A (zh) 一种胃液中幽门螺杆菌多重实时荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法
US11028431B2 (en) Detection of short homopolymeric repeats
TWI810144B (zh) 核酸偵測和定量方法及組合物
JP2015039320A (ja) 複数細菌の同時検出及び／又は定量方法
Okuni et al. Isolation of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis from Ugandan cattle and strain differentiation using optimised DNA typing techniques
Sonawane et al. Molecular epidemiology of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in ruminants in different parts of India
CN102209794A (zh) 用于生物样本中低丰度rna种类特异性检测的方法
Wagner et al. Application of denaturing high-performance liquid chromatography in microbial ecology: fermentor sludge, compost, and soil community profiling
Bölske et al. Diagnosis of paratuberculosis by PCR.
Aviv et al. Real-time reverse transcription PCR as a tool to study virulence gene regulation in bacterial pathogens
KR102009326B1 (ko) cpa와 cpe 타겟 유전자를 통해 클로스트리디움 퍼프린젠스를 검출할 수 있는 Singleplex Real-Time PCR 키트 개발
JP5835683B2 (ja) 牛ａ群ロタウイルスおよび牛コロナウイルスの迅速同時検出方法
CN105132563B (zh) 一种蚜虫共生菌多重pcr检测的引物组和检测方法
Kovac et al. DNA-based assays
JP2008536518A (ja) 標的ゲノムの分画による生物の核酸ベースの検出の感度の増大
JP6671620B1 (ja) ヨーネ菌検出用プローブ、それを用いたヨーネ菌の検出方法並びにヨーネ菌検出用キット
CN104032000A (zh) 蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒
CN106939335A (zh) 一种检测人血清中抵抗慢加急性肝衰竭控制基因的方法
JP2007228868A (ja) Ｌａｍｐ法を用いたジフテリア毒素遺伝子検出方法およびこの方法に用いるプライマーセット

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20111005