CN113999897A - 一种rt-pcr反应体系、rt-pcr方法及应用 - Google Patents
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- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Abstract
本发明提供了一种RT‑PCR反应体系、RT‑PCR方法及应用，涉及核酸扩增与检测技术领域。所述RT‑PCR反应体系包含反转录酶和Carrier RNA；其中，所述反转录酶为MMLV反转录酶，所述Carrier RNA在所述反应体系中的终浓度为0.1~0.3μg/μL。本发明解决了反转录酶在室温条件下放置时会产生非特异性反应，本发明的反应体系和方法可以解决RT‑PCR自动化过程中整板反应一致性的问题。
Description
技术领域
本发明涉及核酸扩增与检测技术领域，尤其是涉及一种RT-PCR反应体系、RT-PCR方法及应用。
背景技术
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是美国Mullis博士在1985年发明的核酸扩增技术，可以在体外短时间内扩增待测DNA片段，在医学检验、分子生物学基础研究、考古学研究、农业研究等领域有广泛的应用。
常规PCR反应体系包括Tris缓冲液、氯化钾、氯化镁、dNTP、添加剂、稳定剂等。随着PCR技术的推广，原来实验室手工操作已经不适合医学检验化验室的需求，自动化批量检测已经成为核酸检测的标准流程，大幅度提高了检测效率。
在采用自动化设备批量检测核酸样本时，样品按照进样顺序配制反应体系后进行PCR扩增、检测。样本检测的速度与自动化设备的加样器数量有关，目前市售自动化核酸检测设备一般配制2针、4针、8针、16针或96针，以配置4针为例，配制一个96孔板（96个PCR反应体系）需要1.5小时到2个小时的时间，这样第一组4个反应体系配好和最后一组4个反应体系要相差1.5小时左右的时间，意味着最后一组4个反应体系要在室温等1.5个小时才能上机进行反应，这样就会在第一组4个反应体系与最后一组4个反应体系之间产生时间差，因此最后一组4个反应体系内就会有副反应产生，可能会影响最后一组4个反应体系PCR反应结果的灵敏度和特异性。如何控制副反应的发生，是保证PCR反应灵敏度和可靠性的一个关键因素。自动化核酸检测设备若采用8针、16针或96针，虽可缩短室温等待的时间，但自动化核酸检测设备的成本较高，价格昂贵，且仅缩短了时间差，未从根本上解决副反应的发生。
对于副反应发生，以PCR反应常用的Taq酶为例，PCR反应为变性、退火和延伸三步的重复循环。在PCR反应开始前从室温升温到变性95摄氏度的过程中，Taq酶会发生非特异性反应，形成引物二聚体，从而会干扰后续的PCR反应。为解决这个问题，很多人都尝试把Taq酶活性用各种技术手段进行可逆的阻断封闭，在达到第一步变性反应的时候再释放出来，从而形成热启动。目前使用比较广泛的Taq酶的热启动方法有三种，即抗体修饰、化学修饰或配基修饰。
RT-PCR是RNA分子在反转录酶的参与下通过反转录合成DNA，然后再进行PCR的技术，目前的RT-PCR技术可以实现将两个反应放在同一体系中完成。RT-PCR在传染病检测方面有着很广泛的应用，尤其在新冠病毒检测领域有着广泛的应用，是病毒感染的金标准。在RT-PCR反应的自动化配制过程中，反转录酶也存在着一样的时间差问题，即在室温时产生非特异性反应，从而影响了PCR反应中整板的灵敏度和一致性。
虽然，Taq酶已经找到有效的热启动方法，但是还一直没有很好的方法解决反转录酶的室温非特异性反应，没有可以解决RT-PCR自动化过程中整板反应一致性的问题。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种RT-PCR反应体系、RT-PCR方法及应用，以解决反转录酶在室温条件下放置时会产生非特异性反应的问题，本发明的反应体系和方法可以解决RT-PCR自动化过程中整板反应一致性的问题。
本发明提供的技术方案如下：
在一个方面，本发明提供了一种RT-PCR反应体系，包含RNA模板、探针、上下游引物、DNA聚合酶、缓冲液、无机盐、dNTP、反转录酶和Carrier RNA，其中，所述反转录酶为MMLV反转录酶；所述Carrier RNA在所述反应体系中的终浓度为0.1~0.3 μg/μL。
在一个实施方案中，所述Carrier RNA在所述反应体系中的终浓度为0.2 μg/μL。
本申请偶然发现在采用MMLV反转录酶的RT-PCR反应体系中加入终浓度为0.1~0.3μg/μL的Carrier RNA，可大幅度降低MMLV反转录酶的室温下的非特异性反应，降低了RT-PCR反应体系在PCR扩增时的Ct值，使得采用MMLV反转录酶的RT-PCR反应体系在室温下放置2小时后其Ct值的增大数值仍在0~0.5之内。
在本发明中，Ct值是指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
MMLV反转录酶是RT-PCR反应中所使用的反转录酶种的一种，其是莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemin virus)反转录酶，亦称为M-MLVRTase。
Carrier RNA（载体RNA），又叫核酸助沉剂。通常在核酸提取环节，提取使用到的离心管壁多是聚丙烯的材料，管壁上有静电，会吸附核酸。在提取纯化过程中采用CarrierRNA可帮助核酸去除静电效应，保证核酸能很好被吸附到纯化柱上，提高洗脱效率，从而达到尽可能多的回收样本中核酸。
Carrier RNA有多种类型，本发明中使用的使用的Carrier RNA 包括多聚腺苷酸RNA或含有3’端多聚腺苷酸尾的carrier RNA，优选为Poly A（多聚腺苷酸RNA序列）。在一个具体的实施方案中，本发明所用Carrier RNA（Poly A）均为德国Qiagen公司销售的货号1017647产品。
在一个实施方案中，所述DNA聚合酶为耐热DNA聚合酶。
在一个实施方案中，所述缓冲液为Tris类缓冲物质和/或两性离子缓冲物质；所述Tris类缓冲物质选自Tris盐酸缓冲液和Tris硫酸缓冲液中的至少一种。
在一个实施方案中，所述缓冲液包含Tris-HCl；更优选地，所述缓冲液的pH值为6.5~8.5；例如包括但不限于6.5、7、7.5、8和8.5。
在一个实施方案中，所述RT-PCR反应为Real-time RT-PCR（RT-qPCR）。Real timeRT-PCR指的是qPCR+RT-PCR的组合，即将mRNA逆转录为cDNA后再作为模板进行实时荧光PCR分析。
在一个实施方案中，所述反应体系还包含无机盐类；优选地，所述无机盐类选自氯化镁和/或氯化钾。在一个可选实施方案中，所述反应体系还可包含其他组分例如甘油、吐温等。
在一个实施方案中，所述反应体系包括以下组分：10 mM的Tris HCl，100 mM的氯化钾，6 mM的氯化镁，200 μM的dNTP，0.04 U/μL 的Taq DNA聚合酶，0.4 U/μL 的MMLV反转录酶，0.1%的Tween®20和5%的甘油。
在一个实施方案中，所述反应体系还包括去离子水；所述RNA模板的浓度为0.1ng/μL，所述探针和上下游引物的浓度为200 μM。
本发明的RT-PCR反应体系（RT-PCR反应液或RT-PCR扩增试剂）可制备为荧光RT-PCR检测试剂盒。
在另一个方面，本发明提供了一种RT-PCR方法，所述方法包括使用前述RT-PCR反应体系或含有MMLV反转录酶和Carrier RNA的反转录试剂盒进行所述RT-PCR。在一个实施方案中，所述RT-PCR方法可以为实时荧光RT-PCR方法，即Real-time RT-PCR（RT-qPCR）。
在一个实施方案中，所述RT-PCR的反应条件如下：
PCR：50℃反转录，5~10 min；95℃变性，5~10 sec；50~60℃退火延伸，30 sec（如50℃反转录，10 min； 95℃变性，5 sec；60℃退火、延伸，30 sec），共50个循环，在结束后收集荧光。
在一个实施方案中，所述PCR反应还包括预变性步骤。
实时荧光PCR方法，包括以下步骤:
（a）制备实时荧光RT-PCR反应体系；
（b）将所述RT-PCR反应体系置于42℃的温度条件下进行反转录反应；
（c）将反转录反应后荧光RT-PCR反应体系置于95℃的温度条件下进行变性反应；再置于50~66℃的温度条件下进行退火，并于退火延伸时收集荧光信号，依次循环45-50次。
在另一个方面，本发明提供了上述反应体系在反转录PCR中的应用，优选地，所述反应体系应用于自动化核酸检测中，即以自动化核酸检测设备进行RT-PCR。在自动化核酸检测中，不同各组的反应体系的配制时间差，使得反应体系内就会有副反应产生，可能会影响组间反应体系PCR反应结果的灵敏度和特异性；因此，在这种情况下，更需要克服反转录酶在室温时产生非特异性反应，从而影响了PCR反应中整板的灵敏度和一致性的问题。
有益效果：
本发明提供的反应体系可以大幅度降低MMLV反转录酶的室温下的非特异性反应，降低了RT-PCR反应体系在PCR扩增时的Ct值；
本发明提供的反应体系和反应方法解决了RT-PCR自动化过程中整板反应一致性的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的等待60 min MMLV体系Carrier RNA（Poly A）0.2 μg/μL溶解曲线;
图2为本发明提供的等待60 min MMLV体系Carrier RNA（Poly A）0 μg/μL溶解曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种RT-PCR反应体系和实时PCR方法，所述RT-PCR反应体系为一步法，具体如下：
RT-PCR模板：总RNA 0.1 ng/μl (从鸡肝脏组织提取)；
上游引物（下文引物A）：5’-CGCGGCCCCCAGCGCCTCTT-3’（SEQ ID No.1）
下游引物（下文引物B）：5’-GCCCGCGGCGCCCAGTAGCA-3’（SEQ ID No.2）
探针：5’FAM-CGCGGCCCCCAGCGCCTCTT-BHQ2-3’（SEQ ID No.3）。
RT-PCR反应体系（50 μL）：
| 试剂 | 添加量 |
| Tris HCl pH=8.5 | 10 mM |
| 氯化钾 | 100 mM |
| 氯化镁 | 6 mM |
| dNTP | 200 μM |
| Taq DNA聚合酶 | 2 U |
| MMLV反转录酶 | 20 U |
| 引物A | 200 μM |
| 引物B | 200 μM |
| 探针 | 200 μM |
| Tween®20 | 0.1% |
| RT-PCR模板 | 5 μL |
| 甘油 | 5% |
此外，所述RT-PCR反应体系中还含有终浓度为0.1 μg/μL的Carrier RNA（PolyA）。所用Carrier RNA（Poly A）均为德国Qiagen公司销售的货号1017647产品。本RT-PCR反应体系中Taq DNA聚合酶的终浓度为0.04 U/μL, MMLV反转录酶的终浓度为0. 4 U/μL。
将上述试剂添加至PCR管后，用去离子水补齐至50 μL体系，混匀等待上机反应。
在120分钟内一共重复配制三组上述反应体系。
其中，A组配制完成后，在室温静置120分钟；B组配制完成后，在室温静置60分钟；C组配制完成后不在室温静置，立即上机。
A、B、C三组反应管一起放置在宏石SLAN 48P仪器（全自动定量PCR仪）中在下述扩增反应条件下进行50个循环扩增，获得对应A、B、C三组反应的Ct值。对每组实验各进行8次，求出每组的平均Ct值。
扩增条件为：
| 温度 | 时间 | |
| 反转录 | 50℃ | 10 min |
| 变性 | 95℃ | 5 sec |
| 退火、延伸 | 60℃ | 30 sec |
实施例2
本实施例2与实施例1基本相同，区别仅在于，RT-PCR反应体系中Carrier RNA（Poly A）的终浓度为0.2 μg/μL。
实施例3
本实施例3与实施例1基本相同，区别仅在于，RT-PCR反应体系中Carrier RNA（Poly A）的终浓度为0.3 μg/μL。
实施例4
本实施例4与实施例1基本相同，区别仅在于，RT-PCR反应体系中Carrier RNA（Poly A）的终浓度为0.4 μg/μL。
对比例1
该对比例1与实施例1的区别仅在于，RT-PCR反应体系中不含Carrier RNA（PolyA）(也即Carrier RNA（Poly A）的终浓度为0 μg/μL)。
对比例2
该对比例1与对比例1的区别仅在于，RT-PCR反应体系中含有终浓度为0.02 μg/μL的Carrier RNA（Poly A）。
对比例3
该对比例3与对比例1的区别仅在于，RT-PCR反应体系中还含有终浓度为0.04 μg/μL的Carrier RNA（Poly A）。
以上实施例1~4、对比例1~3的Ct值结果如表1所示。
表1. MMLV体系下不同Carrier RNA（Poly A）终浓度的平均Ct值
| 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | |
| Carrier RNA（Poly A）终浓度μg/μL | 0 | 0.02 | 0.04 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 |
| 等待120min | 37.02 | 34.26 | 33.50 | 32.82 | 32.42 | 32.55 | 33.42 |
| 等待60min | 34.66 | 33.68 | 32.97 | 32.58 | 32.12 | 32.43 | 32.93 |
| 等待0min | 32.36 | 32.27 | 32.31 | 32.39 | 32.28 | 32.30 | 32.37 |
与不加Carrier RNA（Poly A）并等待0 min相比平均Ct值的增大数值如表2所示。
表2. MMLV体系下不同Carrier RNA（Poly A）终浓度的平均Ct值增大数值
| Carrier RNA（Poly A）终浓度μg/μL | 0 | 0.02 | 0.04 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 |
| 等待120min | 4.66 | 1.90 | 1.14 | 0.46 | 0.06 | 0.19 | 1.06 |
| 等待60min | 2.30 | 1.32 | 0.61 | 0.22 | -0.24 | 0.07 | 0.57 |
| 等待0min | 0 | -0.09 | -0.05 | 0.03 | -0.08 | -0.06 | 0.01 |
与不加Carrier RNA（Poly A）并等待0 min相比，在不加Carrier RNA（Poly A）并等待60 min时平均Ct值增大了2.30，等待120 min时平均Ct值更是增大了4.66。通过表2数值可知，在0~2小时内的等待时间越长，平均Ct值的增大数值越大。
Carrier RNA（Poly A）的加入使得MMLV体系的平均Ct值的增大数值减小。在相同等待时间下，MMLV体系平均Ct值的增大数值在Carrier RNA（Poly A）终浓度0~0.2 μg/μL内随着Carrier RNA（Poly A）终浓度的增大而减小；在Carrier RNA（Poly A）终浓度0.2~0.4μg/μL时平均Ct值的增大数值随着Carrier RNA（Poly A）终浓度的增大而增大。在CarrierRNA（Poly A）终浓度为0.4 μg/μL时，在等待时间为120 min时平均Ct值的增大数值为1.06，在等待时间为60min时平均Ct值的增大数值为0.57。
在MMLV体系内Carrier RNA（Poly A）终浓度在0.1~0.3 μg/μL内，平均Ct值的增大数值小于0.5，为本领域公知的可忽略水平。MMLV体系内Carrier RNA（Poly A）终浓度为0.2μg/μL时，平均Ct值增大数值最小，在2小时内仅为0.06。
图1为等待60 min MMLV体系Carrier RNA（Poly A）0.2 μg/μL溶解曲线；图2为等待60 min MMLV体系Carrier RNA（Poly A）0 μg/μL溶解曲线。
由图2（也即对比例1中B组溶解曲线）中可知，在MMLV体系内未加入Carrier RNA（Poly A）时，在RT-PCR反应内76-78℃时会发生非特异性反应，使得RT-PCR反应的Ct值增大。
由图1（实施例2中B组溶解曲线）中可知，在MMLV体系内加入Carrier RNA（Poly A）的终浓度为0.2 μg/μL时，在RT-PCR反应内未发生非特异性反应，使得RT-PCR反应的Ct值减小。
推测因为在MMLV体系内加入Carrier RNA（Poly A）使得抑制了本应在等待期间发生的非特异性反应，进而使得平均Ct值增大数值减小，从根本上解决了等待期间RT-PCR反应体系内副反应的发生，产生了本领域普通技术人员预料不到的技术效果。
实施例5
本实施例5与实施例2的区别在于，等待时间仅为60 min，重复做8次，所用RT-PCR引物、探针如下：
上游引物：5’-CGCAGGTCTACAAGTGGGATC-3’（SEQ ID No.4）
下游引物：5’-AAGGACAGAAGCTCAAGCTCATT-3’（SEQ ID No.5）
探针：5’FAM-CAACAACGAGCGCAGCAATATCATCATC-BHQ1-3’（SEQ ID No.6）。
对比例4
本对比例4与实施例5的区别在于，不加入Carrier RNA（Poly A）。
实施例5、对比例4的结果如表3所示。
表3 MMLV体系下室温等待60min后不同Carrier RNA（Poly A）终浓度Ct值
| 实验例 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 均值 |
| 实施例5 | 32.71 | 32.92 | 32.67 | 32.60 | 32.62 | 32.59 | 32.65 | 32.59 | 32.67 |
| 对比例4 | 34.13 | 34.95 | 34.29 | 34.98 | 34.07 | 34.41 | 34.69 | 34.48 | 34.50 |
| Ct值降低值 | 1.42 | 2.03 | 1.62 | 2.38 | 1.45 | 1.82 | 2.04 | 1.89 | 1.83 |
实施例5、对比例4的结果如上表3所示，加入Carrier RNA（Poly A）后，Ct值均降低。
SEQ ID No.6与SEQ ID No.3、SEQ ID No.5与SEQ ID No.2、SEQ ID No.4与SEQ IDNo.1均不同，实施例1~5、对比例1~4的数据对比可知，对于不同的探针和引物对，CarrierRNA（Poly A）的加入均可使得采用MMLV反转录酶的RT-PCR反应体系在等待60 min后的Ct值降低，减小数值在1.42以上，减小数值均值为1.83，Ct值降低效果明显。
对比例5
本对比例5与对比例1的区别在于，RT-PCR反应体系终所采用的反转录酶为AMV，添加量为5U。
对比例6
本对比例6与对比例2的区别在于，RT-PCR反应体系终所采用的反转录酶为AMV，添加量为5U。
对比例7
本对比例7与对比例3的区别在于，RT-PCR反应体系终所采用的反转录酶为AMV，添加量为5U。
对比例8
本对比例8与实施例1的区别在于，RT-PCR反应体系终所采用的反转录酶为AMV，添加量为5U。
对比例9
本对比例9与实施例2的区别在于，RT-PCR反应体系终所采用的反转录酶为AMV，添加量为5U。
对比例10
本对比例10与实施例3的区别在于，RT-PCR反应体系终所采用的反转录酶为AMV，添加量为5U。
对比例11
本对比例11与实施例4的区别在于，RT-PCR反应体系终所采用的反转录酶为AMV，添加量为5U。
对比例5~11的Ct值结果如表4所示，平均Ct值增大数值如表5所示。
表4. AMV体系下不同Carrier RNA（Poly A）终浓度的平均Ct值
| Carrier RNA（Poly A）终浓度 μg/μL | 0 | 0.02 | 0.04 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 |
| 等待120 min | 37.42 | 37.26 | 37.48 | 37.69 | 37.82 | 37.57 | 37.65 |
| 等待60 min | 34.59 | 34.72 | 34.57 | 34.83 | 34.67 | 34.89 | 34.69 |
| 等待0 min | 32.28 | 32.20 | 32.42 | 32.27 | 32.32 | 32.16 | 32.30 |
表5. AMV体系下不同Carrier RNA（Poly A）终浓度的平均Ct值增大数值
| Carrier RNA（Poly A）终浓度 μg/μL | 0 | 0.02 | 0.04 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 |
| 等待120 min | 5.14 | 4.98 | 5.20 | 5.41 | 5.54 | 5.29 | 5.37 |
| 等待60 min | 2.31 | 2.44 | 2.29 | 2.55 | 2.39 | 2.61 | 2.41 |
| 等待0 min | 0 | -0.08 | 0.14 | -0.01 | 0.04 | -0.12 | 0.02 |
在0~2小时内的等待时间越长，平均Ct值的增大数值越大。Carrier RNA（Poly A）的加入未使得AMV体系的平均Ct值的增大数值减小。在相同等待时间下，AMV体系的平均Ct值的增大数值在Carrier RNA（Poly A）终浓度0~0.4 μg/μL内未随着Carrier RNA（Poly A）终浓度的变化而变化，等待60 min时平均Ct值的增大数值始终在2.29~2.61之间，等待120min时平均Ct值的增大数值始终在4.98~5.54之间。说明Carrier RNA（Poly A）的使用对AMV体系未有降低Ct值增大数值的作用，从而说明终浓度为0.1~0.4 μg/μL的Carrier RNA（Poly A）的使用对MMLV体系减小等待2小时内Ct值增大数值的作用具有专属性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京金诺美生物技术有限公司
<120> 一种RT-PCR反应体系、RT-PCR方法及应用
<130> PA21036169
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgcggccccc agcgcctctt 20
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<211> 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaggacagaa gctcaagctc att 23
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caacaacgag cgcagcaata tcatcatc 28
Claims (10)
1.一种RT-PCR反应体系，其特征在于，所述反应体系包含RNA模板、探针、上下游引物、DNA聚合酶、缓冲液、无机盐、dNTP、反转录酶和Carrier RNA，其中，所述反转录酶为MMLV反转录酶；所述Carrier RNA在所述反应体系中的终浓度为0.1~0.3 μg/μL。
2.根据权利要求1所述的RT-PCR反应体系，其特征在于，所述Carrier RNA在所述反应体系中的终浓度为0.2 μg/μL。
3.根据权利要求1所述的RT-PCR反应体系，其特征在于，所述Carrier RNA为多聚腺苷酸RNA或含有3’端多聚腺苷酸尾的carrier RNA。
4.根据权利要求1所述的RT-PCR反应体系，其特征在于，所述DNA聚合酶为耐热DNA聚合酶。
5.根据权利要求1所述的RT-PCR反应体系，其特征在于，所述缓冲液包括Tris-HCl缓冲液；所述缓冲液的pH值为6.5~8.5。
6.根据权利要求1至5任一项所述的RT-PCR反应体系，其特征在于，所述反应体系包括以下组分：
10 mM的Tris HCl，100 mM的氯化钾，6 mM的氯化镁，200 μM的dNTP，0.04 U/μL 的TaqDNA聚合酶，0.4 U/μL的MMLV反转录酶，0.1%的Tween®20和5%的甘油。
7.根据权利要求6所述的RT-PCR反应体系，其特征在于，所述反应体系还包括去离子水；所述RNA模板的浓度为0.1 ng/μL，所述探针和上下游引物的浓度为200 μM。
8.一种RT-PCR方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1~7中任一项所述的反应体系进行所述RT-PCR。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述RT-PCR为Real-time RT-PCR。
10.权利要求1~7中任一项所述的反应体系在自动化核酸检测的反转录PCR中的应用。
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