CN114196738A - 一种检测microRNA的方法和试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测microRNA的方法和试剂。该方法利用磁珠捕获microRNA得到模板，再将模板加入由具有线性引物和茎环引物的连接引物、扩增引物、连接酶以及扩增缓冲液组成的试剂中进行荧光PCR检测。该方法可在一个反应体系中同时满足连接与扩增的需求，操作简单，特异性好，灵敏度高，可以实现一步法，简化了实际操作步骤，缩短了反应时间。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更为具体的是涉及一种检测microRNA的方法和试剂。
背景技术
快速准确的聚合酶链式反应已普遍应用于各类临床疾病的诊断治疗。该技术在耐热DNA聚合酶的作用下，通过循环温度的辅助，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，进行半保留复制。近年来，肿瘤疾病的发病率日益增加，而miRNA具有理想肿瘤标志物的特征，在癌细胞和组织中有特异性表达谱，且成熟的miRNA在血清、血浆或其他体液中均存在，大大增加了检测的可能性。因此，基于miRNA的生物标志物检测在往后的常规临床实践中会占据及其重要的位置。
传统的连接酶链式反应是将设计好的一对线性寡核苷酸探针杂交到目标DNA的相邻序列上，杂交后两条探针相邻但并未连接。在加入连接酶后，他们之间形成的缺口被连接酶所连接，形成一条完整的链，再由连接产物的引物来进行温度循环扩增，然后再将得到的产物进行检测。然而线性探针的结构简单，无空间约束去阻止其结合双链组DNA，又由于样本中干扰因素较多，无法保证结合的敏感性、特异性，且连接与检测无法一步进行，反应时间长，其实用性较低。综上所述，需建立一种简单、快速、高灵敏度与高特异性的miRNA检测方法。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种检测microRNA的方法和试剂。该方法利用磁珠特异性捕获microRNA模板，以磁珠为模板RNA载体，将捕获了RNA的磁珠加入以茎环引物、5’端具有Poly(A)尾的线性引物、扩增引物、连接酶以及扩增缓冲液组成的试剂中实现一步法，简化了实际操作步骤，缩短了反应时间，具有较高的灵敏度及特异性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种检测microRNA的试剂，检测试剂包括连接引物、扩增引物及探针。其中连接引物包括一条线性引物和一条茎环引物，扩增引物是microRNA经连接反应后生产的cDNA设计。
以靶标为模板设计两条连接引物A和B；
在靶标存在的情况下，引物A和引物B退火杂交到靶标上，经过连接酶的高效催化，引物A的3’端与引物B的5’端之间的缺口被连接，得到连接产物；
在连接产物中加入扩增引物、探针及DNA聚合酶后，经过重复循环变性-退火-延伸，得到荧光信号，从而实现对目标的检测。
优选的，所述引物A为一条线性引物，由一段Poly(A)尾结构序列以及一段与靶标3’端杂交的序列组成，引物A3’端含羟基；靠近3’端的碱基点为连接点；
优选的，所述引物B为一条茎环引物，由一段与靶标5’端杂交的序列及茎环结构序列组成，引物B 5’端进行磷酸化修饰；靠近5’端的碱基点为连接点；
优选的，其中一条扩增引物可在连接引物A的基础上进行设计，降低了引物设计的复杂性；
优选的，反应体系同时满足连接及扩增反应的进行。
本发明还提供了一种检测microRNA的方法，采用本发明所述试剂，包括以下步骤：样本处理，捕获作为反应模板的靶RNA；将反应试剂加入至PCR反应管中，所述反应试剂包括连接引物和扩增引物；向PCR反应管中加入步骤1中处理好的模板；启动连接扩增一步法反应程序；反应结束，进行结果分析。
本发明扩增反应原理介绍：如图1所示，当磁珠捕获靶RNA后，将捕获靶RNA的磁珠加入以茎环引物、5’端具有Poly(A)尾的线性引物、扩增引物、连接酶以及扩增缓冲液组成的试剂中。引物A的Poly(A)尾结构会引导引物A优先识别磁珠并与磁珠上的靶RNA杂交，引物B的茎环结构具有空间约束性，可以阻止引物B结合试剂中可能杂交形成的双链DNA，由于引物A和引物B分别含有一段与靶RNA序列互补的核苷酸序列，两条引物与靶RNA杂交后，经过DNA连接酶的高效催化形成完整的单链cDNA(连接产物)。该连接产物具有一条与靶RNA完全互补的核苷酸序列，且满足作为荧光PCR的模板的要求，可通过扩增引物进行放大扩增，水解探针释放荧光信号进行检测，提高了扩增特异性。
本发明设计了一种检测microRNA的方法和试剂，其目的在于高效、快速且特异性地检出microRNA。如图1所示，当磁珠捕获靶RNA后，将捕获靶RNA的磁珠加入以茎环引物、5’端具有Poly(A)尾的线性引物、扩增引物、连接酶以及扩增缓冲液组成的试剂中。引物A的Poly(A)尾结构会引导引物A优先识别磁珠并与磁珠上的靶RNA杂交，引物B的茎环结构具有空间约束性，可以阻止引物B结合试剂中可能杂交形成的双链DNA，由于引物A和引物B分别含有一段与靶RNA序列互补的核苷酸序列，两条引物与靶RNA杂交后，经过DNA连接酶的高效催化形成完整的单链cDNA。该条单链cDNA具有一条与靶RNA完全互补的核苷酸序列，提高了扩增特异性，且满足作为荧光PCR的模板的要求，可通过扩增引物进行放大扩增，水解探针释放荧光信号进行检测。本发明实现一步法检测，缩短了检测的总时间，简化了操作步骤。
附图说明
构成本发明的附图部分用来提供对本发明的进一步理解，本发明的实施例及其说明用于解释本发明，但并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明内容所述的检测microRNA实验原理图；
图2为经磁珠处理的模板与未经磁珠处理的模板的荧光检测结果对比图；图2结果显示用本发明方法和试剂检测两种处理方式的模板均可出现信号，且模板经过磁珠处理后用本发明试剂进行检测的信号值高于未经磁珠处理检测的信号值，本发明方法和试剂可以更为灵敏地检测出靶标。
图3为应用本发明所述一步法对模板的扩增结果；图3结果显示用本发明方法及试剂对0.3aM、3aM、30aM、0.3fM、3fM五个不同含量模板进行检测，当模板浓度达到0.3aM时，样本仍可检出信号，且信号明显不影响判读。说明本发明方法及试剂具有较高的灵敏度。
图4为对比方法两步法对模板的扩增结果。
图5为应用本发明方法进行标准曲线分析的结果；图5结构显示表示对图3的结果进行标准曲线分析，本发明方法标准曲线的相关系数为0.995(介于0.95-1.05之间)，说明存在较好的线性关系，可用于靶RNA的定量。
图6为应用对比方法两步法进行标准曲线分析的结果；图6结果为为对图4的结果进行标准曲线分析的结果图，标准曲线的相关系数为0.976(介于0.95-1.05之间)，作为图5的对照图。
图7为本发明方法设计的连接引物组与部分位点突变的连接引物组对靶RNA特异性识别的对比结果；图7为实施例4的检测结果，其中具有扩增曲线的为本发明方法和试剂的检测结果，无扩增曲线的为使用位点突变的连接引物A1-A12与连接引物B组合的检测结果。
图8为本发明方法设计的连接引物组对不同位点突变的靶RNA的特异性识别的对比结果。为实施例4的检测结果，其中具有扩增曲线的为针对靶RNA的检测结果，无扩增曲线的为针对位点突变RNA的检测结果。
具体实施方式
为了使本发明的技术方法、优势及目的更加清晰易懂，下面结合具体实施例及相关附图，对本发明进行详细的说明。此处描述的实施例仅用于解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1
本实施例以miR-21a模板序列为例
通过miR-base数据库获得miR-21a的序列，设计出连接引物，扩增引物和探针，所有引物均以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，探针以高效液相色谱法纯化。miRNA、连接引物、扩增引物及探针的碱基序列见表1。
表1
探针的修饰：FAM，6-Carboxyfluorescein(6-羧基荧光素)；MGB，Minor GrooveBinder(非荧光淬灭基团)。
引物修饰：连接引物B 5’端磷酸化修饰，增加连接效率；且具有一段茎环结构，防止结合试剂中可能杂交形成的双链DNA；连接引物A5’端带有Poly(A)尾结构，优先于其他单链DNA结合靶标。
连接引物A与连接引物B下划线部分序列分别为与靶标序列互补的核苷酸序列，两者杂交到靶标序列后，在DNA连接酶的高效催化下形成完整的单链cDNA。该条单链cDNA具有一条与靶RNA完全互补的核苷酸序列，可以提高扩增特异性。
连接引物A和连接引物B连接后形成的单链cDNA满足扩增的要求，可以直接作为扩增模板进行扩增反应。
扩增引物C在连接引物A的基础上去掉Poly(A)结构，随机增加五个碱基，可用于扩增反应。扩增引物D和探针在以连接引物A、连接引物B连接后形成的cDNA为模板的基础上进行设计，设计方式为常规的引物探针设计方法。
实施例2
(1)样本处理
将同一样本等量置于两个离心管中，其中一管为模板1；
在另一管样本内加入磁珠，混匀，放入磁力架中，弃上清，得到模板2。
(2)连接反应
连接引物A和连接引物B退火杂交到靶标上，在连接酶的高效催化下连接引物A的3’端与连接引物B的5’端之间的缺口被连接形成目的连接产物。本发明使用的20μL的反应体系包含2μL连接缓冲液，1μL DNA连接酶，14.2μL ddH2O，0.8μL连接引物A，0.8μL连接引物B和2μL模板。
连接体系及程序如表2：
(3)荧光PCR反应
以连接产物作为扩增模板，在两条扩增引物和DNA聚合酶的作用下形成大量含有目标序列的双链DNA产物，实现对其的指数型放大，加入的探针经过水解释放荧光信号，实现对miRNA的检测。
使用仪器：ABI 7500实时荧光PCR仪
扩增体系及程序如表3：
表3
步骤：1、按照(1)中样本处理方式进行样本处理；(2)准备用于普通PCR反应的反应管，按照表2配制连接反应体系，加入反应管中，再加入模板，使用表二连接程序进行连接反应，该反应可在普通PCR仪上进行；(3)连接结束后，得到20μL连接产物，另取一根用于荧光PCR反应的反应管，按照表3配制扩增反应体系，加入反应管中，再取2μL连接产物加入扩增反应体系，使用表3程序进行扩增反应，扩增结束后，在ABI 7500实时荧光PCR仪上进行结果分析。
上述反应对磁珠处理的模板与未经磁珠处理的模板进行了对比，在实时荧光PCR仪上对结果进行观察，其扩增结果如图2，图中信号高的一组为磁珠处理模板的结果，信号低的为未经磁珠处理的模板的结果，每个模板做三个平行。
结论：样本在未经磁珠处理和经过磁珠处理后均可用本发明的试剂完成检测，经过磁珠处理后的样本的结果信号比未经磁珠处理的样本信号高，且均一性好，结果显示，本发明方法和试剂可以灵敏的检测出靶标。
实施例3
按照实施例2中磁珠处理样本的方式进行样本处理得到模板。
同样的模板分别以两步法与一步法的方式进行检测对比。
总反应体系：20μL
1、一步法：
一步法操作步骤是：1、准备用于荧光PCR反应的反应管，按照表4将各组分加入同一反应管中，再加入处理好的模板；2、混匀离心；3、将反应管放入ABI 7500实时荧光PCR仪中，根据表5设置程序进行连接扩增一步反应；4、程序结束后，在ABI 7500实时荧光PCR仪进行结果分析。
一步法检测体系如表4：
| 组份 | 用量(μL) |
| DNA连接酶 | 0.5 |
| Taq酶 | 0.4 |
| MgCl<sub>2</sub>(250mM) | 0.8 |
| Tris-HCl(1M，PH9.0) | 1 |
| DTT(100mM) | 0.2 |
| ATP(10mM) | 2 |
| dNTP Mix(10mM) | 0.8 |
| KCl(1M) | 1 |
| 连接引物A(10μM) | 0.4 |
| 扩增引物C(10μM) | 0.4 |
| 扩增引物D(10μM) | 0.4 |
| 探针(10μM) | 0.4 |
| 连接引物B(10μM) | 0.4 |
| 模板 | 2 |
| 纯化水 | UP to 20 |
表4
使用仪器：ABI 7500实时荧光PCR仪
一步法程序如表5：
表5
2、两步法：
两步法的操作步骤是：参见实施例2
两步法连接体系及程序：参见实施例2表2
两步法扩增体系及程序：参见实施例2表3
表4、表5为本发明方法及试剂组合，表2、表3为两步法及试剂组合，通过两种方法的对比得知，本发明方法操作简单，且操作时间，程序时间较两步法更为简短。
由图3、图4得知，本发明方法与两步法对于模板的检出结果一致，当模板浓度达到0.3aM时，样本仍可检出信号，且信号明显不影响判读。说明本发明方法及试剂具有较高的灵敏度。
通过对0.3aM、3aM、30aM、0.3fM、3fM五个不同含量模板的结果进行标准曲线分析，参照图5、图6结果得知，本发明方法标准曲线的相关系数为0.995(介于0.95-1.05之间)，说明存在较好的线性关系，可用于靶RNA的定量。
实施例4本发明的特异性验证实验
采用实施例1中表1的引物、探针和miR-21a序列，在连接引物A的序列基础上再另行设计几组突变的连接引物,在miR-21a的序列基础上再设计几组突变microRNA。所有引物均以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
新设计的连接引物的碱基序列见表8。
表8
连接引物A1至连接引物A12序列中小写的部分为突变点，其余部分序列与连接引物A一致；
miR-21a-1至miR-21a-4序列中小写的部分为突变点，其余部分序列与miR-21a一致。
按照实施例3中一步法的体系及程序进行检测，模板为合成RNA。
通过不同位点突变的连接引物A与连接引物B的组合对比不同位点突变的连接引物对miR-21a模板的特异性连接效果；通过对不同位点突变的模板检测对比连接引物A和连接引物B对于不同位点突变的miR-21a模板的特异性连接效果。
按照上述方式，得到结果如图7、图8。根据图7结果显示，本发明方法设计的连接引物A与连接引物B在DNA连接酶的催化下能够特异识别靶RNA，进行连接产生连接产物cDNA，之后扩增产生信号；不同位点突变的连接引物A1至连接引物A12无法识别靶RNA与连接引物B连接，无信号产生。根据图8结果显示，本发明中的连接引物A与连接引物B能特异性识别靶RNA进行连接生成连接产物cDNA，之后扩增产生信号，对于位点突变RNA连接引物A和连接引物B无法识别进行连接，最终无扩增信号产生。上述结果表明本发明方法设计的连接体系能够特异性识别靶RNA进行连接并通过本发明的试剂扩增产生信号。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 杭州百迈生物股份有限公司
<120> 一种检测microRNA的方法和试剂
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 2
<211> 36
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aatcaacatc agtctg 36
<210> 3
<211> 52
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ataagctaca cgataggtca cgcttatgga gcctgggacg tgacctatcg tg 52
<210> 4
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgcctcaac atcagtctg 19
<210> 5
<211> 16
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cacgtcccag gctcca 16
<210> 6
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctacacgata ggtcacgct 19
<210> 7
<211> 36
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aatcaacatc agtctc 36
<210> 8
<211> 36
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aatcaacatc agtcta 36
<210> 9
<211> 36
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aatcaacatc agtctt 36
<210> 10
<211> 36
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aatcaacatc agtcag 36
<210> 11
<211> 36
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aatcaacatc agtgtg 36
<210> 12
<211> 36
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aatcaacatc aggctg 36
<210> 13
<211> 36
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aatcaacatc actctg 36
<210> 14
<211> 36
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aatcaacatc cgtctg 36
<210> 15
<211> 36
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aatcaacatc actctc 36
<210> 16
<211> 36
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aatcaacatc actcta 36
<210> 17
<211> 36
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aatcaacatc actctt 36
<210> 18
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
uagcuuacca gacugauguu ga 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
uagauuauca gacugauguu ga 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
uagauuauca gacugauguu ga 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
uagauuacca gacugauguu ga 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
uagcuugcca gacugauguu ga 22
Claims (10)
1.检测microRNA的试剂，包括用于连接反应的连接引物和用于扩增反应的扩增引物，其特征在于，所述连接引物包括一条线性引物和一条茎环引物，所述扩增引物是microRNA经连接反应后生产的cDNA设计。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述线性引物包括一段Poly(A)尾结构序列以及一段与所述靶标microRNA的3’端杂交的序列组成。
3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述茎环引物包括一段与靶标microRNA的5’端杂交的序列及茎环结构序列组成，茎环引物的5’端进行磷酸化修饰；靠近5’端的碱基点为连接点。
4.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，其中一条扩增引物是在线性引物的基础上去掉Poly(A)结构，并随机增加五个碱基。
5.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，还包括探针。
6.一种检测microRNA的方法，包括以下步骤：
(1)样本处理，捕获作为反应模板的靶RNA；
(2)将反应试剂加入至PCR反应管中，所述反应试剂包括连接引物和扩增引物；
(3)向PCR反应管中加入步骤1中处理好的模板；
(4)启动连接扩增一步法反应程序；
(5)反应结束，进行结果分析；
其中所述的连接引物和扩增引物选自权利要求1至5之一所述的试剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤1包括向样本内加入磁珠，混匀，弃上清，得到模板。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR反应为实时荧光PCR。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述反应试剂还包括探针。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述一步法反应程序包括37℃，15min，循环1次；95℃，5min，循环1次；95℃，15s，60℃，35s，循环40次。
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