CN104032031A - 一种rna聚合酶和连接酶偶联反应介导的定量检测核酸的pcr分析方法 - Google Patents

一种rna聚合酶和连接酶偶联反应介导的定量检测核酸的pcr分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种RNA聚合酶和连接酶偶联反应介导的定量检测核酸的PCR分析方法，包括以下步骤：在靶标核酸存在下，连接酶介导寡核苷酸探针间3′端羟基和5′端磷酸基团反应形成磷酸二酯键，连接产物具有RNA聚合酶启动子序列，进而启动RNA聚合酶大量合成含有靶标核酸序列的RNA片段，该RNA片段能够充当靶标核酸继续介导寡核苷酸探针间的连接反应，RNA聚合酶的引入提高了连接反应效率，为后续的PCR反应提供了更多的扩增模板，实时测定反应体系中的荧光信号强度，与标准工作曲线对比，计算出靶标核酸的浓度。该方法具有灵敏度高、特异性强、设计简单、反应时间短等特点，可广泛应用于生物基础研究和临床诊断中的核酸检测。

Description

一种RNA聚合酶和连接酶偶联反应介导的定量检测核酸的PCR分析方法
技术领域
本发明属于分析检测领域，尤其涉及一种RNA聚合酶和连接酶偶联反应介导的定量检测核酸的PCR分析方法。
背景技术
特定序列核酸的检测在现代生物学和医学中非常重要。目前鉴别特定DNA和RNA序列的用途有很多，包括在法医学中的个人识别，基础生物学和应用医学中的基因和基因组测序，食品和环境样本中微生物鉴定，人类患者中病原体鉴定，癌症和抗药性诊断，疾病进展和药物治疗响应中的遗传预测等。目前核酸检测的方法主要有聚合酶链式反应(PCR)，核酸序列依赖性扩增(NASBA)，环介导等温扩增(LAMP)，链置换扩增(SDA)，滚环扩增(RCA)等。其中PCR方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单等优点，是核酸检测分析最常用的方法。典型的PCR方法是扩增模板高温变性、引物和扩增模板退火、引物延伸三步反应组成一个循环，经过多次循环反应，使得低浓度的长片段靶标核酸可以被扩增到可检测的水平。但是，短链核酸序列不能直接利用PCR方法进行扩增。因此，一些基于寡核苷酸探针连接的PCR技术便发展起来，例如连接酶介导的PCR方法，该方法一般分为两步。第一步是设计两条寡核苷酸探针均有部分序列与靶标核酸的一半序列互补，当两条寡核苷酸探针退火结合到靶标核酸模板上后，连接酶催化两条寡核苷酸探针间3′端羟基和5′端磷酸基团反应形成磷酸二酯键；第二步是以连接产物为扩增模板的PCR反应。该类方法由于较低的连接效率，导致检测灵敏度低。
发明内容
针对现有连接酶介导的PCR方法灵敏度不高的问题，本发明的目的是提供一种RNA聚合酶和连接酶偶联反应介导的高灵敏检测核酸的PCR分析方法。
本发明的设计思路如下：
利用RNA聚合酶和连接酶偶联反应介导的定量检测核酸的PCR分析方法如下：设计两条寡核苷酸探针，其中上游寡核苷酸探针3′末端带有羟基、序列与靶标核酸的一半序列互补；下游寡核苷酸探针5′末端带有磷酸基团、序列与靶标核酸另一半序列互补，3′末端序列为RNA聚合酶启动子序列。当靶标核酸与寡核苷酸探针杂交后，连接酶催化上游寡核苷酸探针3′端羟基和下游寡核苷酸探针5′端磷酸基团形成磷酸二酯键，形成的连接产物带有RNA聚合酶启动子序列。含有RNA聚合酶启动子序列的正向引物与连接产物杂交形成具有双链RNA聚合酶启动子结构的转录模板，RNA聚合酶识别此转录模板，合成大量含有靶标核酸序列的RNA片段，该RNA片段能够充当靶标核酸与寡核苷酸探针进行杂交，从而启动连接酶进行连接反应。连接产物又可作为转录模板，如此循环，连接更多的寡核苷酸探针，为后续的PCR反应提供了大量的扩增模板。PCR反应中，在DNA聚合酶、正向引物、反向引物等共同作用下，以连接产物为模板，扩增得到大量双链DNA，染料SYBR Green I与双链DNA结合产生荧光信号，实时测定反应体系中的荧光信号强度，与标准工作曲线对比，计算出靶标核酸的浓度。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种RNA聚合酶和连接酶偶联反应介导的定量检测核酸的PCR分析方法，所述PCR分析方法为非诊断和治疗的分析方法，包括以下步骤：
利用靶标核酸与寡核苷酸探针杂交后，连接酶催化寡核苷酸探针之间的切口连接得到连接产物，所述连接产物含有RNA聚合酶启动子序列；所述含有RNA聚合酶启动子序列的正向引物与所述连接产物杂交，形成具有双链启动子结构的转录模板；RNA聚合酶识别所述转录模板，合成启动子下游的与探针序列互补的RNA片段，所述RNA片段能够充当靶标核酸与寡核苷酸探针杂交，介导连接酶催化寡核苷酸探针之间的连接反应；在PCR反应中，DNA聚合酶、正向引物、反向引物和dNTPs共同作用下，以连接产物为模板，得到大量双链DNA，染料SYBR Green I与双链DNA结合产生荧光信号，实时测定反应体系中的荧光信号强度，与标准工作曲线对比，计算出所述靶标核酸的浓度。
所述的标准工作曲线是由已知浓度的靶标核酸的标准溶液，按照所述操作步骤反应后，实时测定反应体系中的荧光信号强度并得到Ct值，计算空白对照组和实验组的Ct值之差ΔCt值，然后根据标准溶液中靶标核酸的浓度和体系中ΔCt值制作标准工作曲线。
所述靶标核酸为单链DNA或单链RNA。
所述寡核苷酸探针、正向引物和反向引物均为人工合成。
所述寡核苷酸探针包括上游寡核苷酸探针(探针1)和下游寡核苷酸探针(探针2)；
其中，所述探针1的3′末端带有羟基，且3′端序列与所述靶标核酸的3′端序列互补；
所述探针2的5′末端修饰磷酸基团，3′端含有所述RNA聚合酶启动子序列，5′端序列与靶标核酸5′端序列互补。
所述连接酶为商品化的DNA连接酶或RNA连接酶。
所述RNA聚合酶为T7RNA聚合酶，SP6RNA聚合酶或T3RNA聚合酶。
所述连接反应和转录反应体系由A、B两部分构成，其中，A部分包括2～20nM上游寡核苷酸探针，2～20nM下游寡核苷酸探针，2～20nM正向引物，靶标核酸和DEPC水；B部分包括20～500U连接酶，10～200U RNA聚合酶，100μM～5mM NTPs，和0.1～1.2U/μLRNase抑制剂。
所述PCR反应的体系包括200～800nM正向引物，200～800nM反向引物，50～500μMdNTPs和染料SYBR Green I和连接反应液。
所述连接反应和转录反应的步骤为：首先将A部分反应液在80～98℃变性2min，随后降温到20～40℃保持10～30min，然后加入B部分反应液，在20～40℃下反应10～100min；反应结束后，将反应液置于冰上。
所述PCR反应程序为：在80～98℃预变性20～30s；80～98℃变性5～30s，55～60℃退火和延伸20～60s，进行20～40次循环。
本发明与传统的连接酶介导的PCR方法相比，具有以下优点和良好效果：
1、灵敏度高：靶标核酸存在时介导寡核苷酸探针连接，连接产物带有RNA聚合酶启动子序列。具有持续转录活性的RNA聚合酶以连接产物为模板大量合成RNA片段，该RNA片段能够充当靶标核酸介导寡核苷酸探针连接，如此循环实现信号放大，极大地提高检测灵敏度；
2、选择性好：当干扰核酸与靶标核酸有单碱基差异时，会直接影响寡核苷酸探针的连接效率，从而造成PCR扩增信号的差异；
3、背景信号低：当不存在靶标核酸时，不能进行有效的寡核苷酸探针连接，无法产生后续PCR反应的扩增模板；
4、高通量检测：采用八联管或96孔PCR板，可以实现同时制作标准工作曲线和待测样本的检测，减少检测误差；
5、操作过程简单快速：操作过程简单，整个检测时间不超过2h；
6、无污染：整个检测过程不需要用到有机溶剂或有毒试剂；
7、灵敏度高、特异性强、操作简单、适用范围广等优点，是一种简便实用的分析技术。
附图说明
图1是利用T7RNA聚合酶和连接酶偶联反应介导的PCR方法定量分析DNA靶标的原理示意图；
图2是制备得到的DNA靶标工作曲线示意图；其中，(A)是不同浓度DNA靶标反应溶液的扩增曲线；(B)是不同浓度DNA靶标反应溶液的阈值循环数之差ΔCt(ΔCt＝Ct,空白对照-Ct,DNA target)与DNA靶标浓度对数值的工作曲线。
图3是特异性实验，其中，(A)的不同DNA靶标反应溶液的扩增曲线；(B)的实验数据比较柱状图；
图4是利用T7RNA聚合酶和T4RNA连接酶2偶联反应介导的PCR方法定量分析miRNA-122的原理示意图；
图5是利用SP6RNA聚合酶和T4DNA连接酶偶联反应介导的PCR方法定量分析DNA靶标的原理示意图；
图6是利用T3RNA聚合酶和T4RNA连接酶2偶联反应介导的PCR方法定量分析let-7a的原理示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明，下述实施例将有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容。
符号说明：
图1中，DNA靶标为5′-TTGAGGTGCATGTTTGTGCC-3′，探针1序列为5′-GGTATCCAGGGAAGTGGATACGAAGCGTTTCAGGCACAAACAT-3′，探针2序列为5′-(P)GCACCTCAACGCGGTGACCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC-3′，正向引物序列为5′-GATCACTAATACGACTCACTATAGG-3′，反向引物序列为5′-AGGGAAGTGGATACGAAGC-3′。
图2中，ΔCt为空白样本溶液和含有DNA靶标溶液的阈值循环数之差(ΔCt＝Ct,blank-Ct, DNA target)，定量PCR反应的阈值可以由荧光定量PCR仪自动设置，也可手动设置。-lg CDNA target为DNA靶标标准溶液中DNA靶标浓度的负对数。
图3中，ΔCt＝Ct,blank-Ct,DNA，其中Ct,blank为空白样本溶液(不含有DNA)的阈值循环数，Ct,DNA为分别含有5pM和500fM DNA靶标溶液的阈值循环数。
两条DNA连接探针分别为：上游寡核苷酸探针(探针1)，其3′末端带有羟基、序列与靶标核酸的一半序列互补；下游寡核苷酸探针(探针2)，其5′末端带有磷酸基团、序列与靶标核酸的一半序列互补，3′末端序列为T7启动子序列5′-CCCTATAGTGAGTCGTATTA-3′。
正向引物由两部分序列组成：T7启动子序列5′-TAATACGACTCACTATAGG-3′以及在T7启动子序列之前(5′端方向)多加6个碱基GATCAC。
T7RNA聚合酶和T4DNA连接酶偶联反应介导的定量检测核酸的PCR分析方法如下。设计两条寡核苷酸探针序列：探针1的3′末端带有羟基、序列与靶标核酸的一半序列互补；探针2的5′末端带有磷酸基团、序列与靶标核酸的一半序列互补，3′末端序列为T7启动子序列。当反应体系中存在靶标核酸时，靶标核酸作为连接模板使两条寡核苷酸探针连接，连接产物具有T7启动子序列，进而利用T7RNA聚合酶大量合成含有靶标核酸序列的RNA片段，该RNA片段能够充当靶标核酸介导寡核苷酸探针连接。该方法使连接反应中寡核苷酸探针的连接数量显著增加，为后续的PCR反应提供了大量的扩增模板。PCR反应中，扩增寡核苷酸探针连接后形成的模板，得到大量双链DNA，染料SYBR Green I与双链DNA结合产生荧光信号，实时测定反应体系中的荧光信号强度，与标准工作曲线对比，计算出靶标核酸的浓度。
本发明的方法可以进一步描述如下：
利用靶标核酸与寡核苷酸探针杂交后，连接酶介导寡核苷酸探针间3′端羟基和5′端磷酸基团反应形成磷酸二酯键，形成的连接产物带有RNA聚合酶启动子序列，可结合含有RNA聚合酶启动子序列的正向引物，形成具有双链RNA聚合酶启动子结构的转录模板。RNA聚合酶识别转录模板，合成大量含有靶标核酸序列的RNA片段，该RNA片段能够充当靶标核酸进行寡核苷酸探针连接。连接产物又可作为转录模板，如此循环，最终使更多寡核苷酸探针连接，为后续的PCR反应提供了大量的扩增模板。PCR反应中，在DNA聚合酶、正向引物、反向引物等共同作用下，扩增寡核苷酸探针连接后形成的模板，得到大量双链DNA，染料SYBR Green I与双链DNA结合产生荧光信号，实时测定反应体系中的荧光信号强度，与标准工作曲线对比，计算出靶标核酸的浓度。
标准工作曲线是由已知浓度的DNA靶标的标准溶液，按照所述PCR方法进行定量分析，实时测定反应体系中的扩增荧光信号强度并得出阈值循环数，然后根据标准溶液中DNA靶标的浓度和体系中阈值循环数制作标准工作曲线。
实施例1
利用T7RNA聚合酶和T4DNA连接酶偶联反应介导的PCR检测DNA靶标(5′-TTGAGGTGCATGTTTGTGCC-3′)的分析方法，检测原理如图1所示。探针1中与DNA靶标互补的序列(5′-GGCACAAACAT-3′)，探针2中与DNA靶标互补的序列(5′-GCACCTCAA-3′)以及T7启动子序列(5′-CCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC-3′)。
下面对DNA靶标检测的具体实施来进一步说明本发明。其中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。具体操作步骤如下：
首先制备A部分连接反应液。在200μL PCR管中加入1μL转录缓冲溶液(20mMTris-HCl，3mM MgCl2，5mM DTT，5mM NaCl和1mM亚精胺，pH为7.9)，1μL探针1溶液(5nM)，1μL探针2溶液(5nM)，1μL正向引物溶液(5nM)，1μL DNA靶标溶液，0.25μL DEPC水。将反应液A置于PCR仪，于95℃变性2min；随后降温至25℃保持10min。
制备B部分连接反应液。在200μL PCR管中加入2μL T4DNA连接酶缓冲液(50mMTris-HCl，10mM MgCl2，1mM DTT，1mM ATP和25μg/ml BSA，pH为7.5)，0.75μL T4DNA连接酶(150U)，1μL T7RNA聚合酶(20U)，0.8μL NTPs(2mM)，0.2μL RNase抑制剂(8U)。
向上述5.25μL反应液A中加入4.75μL反应液B，构成10μL连接反应液，25℃反应15min，之后将反应液置于冰上，终止连接反应。
制备PCR反应液。在八联管或96孔PCR板中加入12.5μL PCR Mix(1×)，0.4μL正向引物(200nM)，0.4μL反向引物(200nM)，1.7μL DEPC水。
将上述10μL连接液加入到PCR反应液中，混合均匀后置于荧光定量PCR仪，于94℃预变性30s；94℃变性5s，60℃退火和延伸30s，共进行40次循环，仪器实时测定溶液的荧光信号强度，并给出阈值循环数(Ct值)，计算空白样本与含DNA实验样本的Ct值之差ΔCt值。
工作曲线的制作：分别准备已知浓度的DNA靶标标准溶液，浓度分别为500pM、50pM、5pM、500fM、50fM和5fM，以及空白样本(不含有DNA靶标，即DNA靶标浓度为0)，按照上述步骤进行操作，测定各个反应液的荧光扩增曲线，如附图2(A)所示。然后根据DNA靶标标准溶液的浓度的负对数值和阈值循环数之差ΔCt值制作标准工作曲线，如附图2(B)所示，DNA靶标标准溶液的浓度负对数值与阈值循环数之差ΔCt值在5fM～500pM范围内呈线性关系，线性方程为ΔCt＝3.37lgCDNA target+49.79。
附图3所示为本发明方法的特异性实验，分别选取与DNA靶标存在1个碱基、2个碱基、3个碱基以及12个碱基差异的DNA序列(DNA MT-1，MT-2，MT-3，MT-12)作为DNA靶标的对照样本，以及空白样本(不含DNA)。MT-1序列为5′-TTGAGGTGCATCTTTGTGCC-3′，MT-2序列为5′-TTGAGGTGCTTCTTTGTGCC-3′，MT-3序列为5′-TTGAGGTCCTTCTTTGTGCC-3′，MT-12序列为5′-TTCTCGTAGCTCATTCACAC-3′。如附图3(A)为各个DNA序列浓度为5pM的反应液的荧光扩增曲线，附图3(B)为各个DNA序列浓度为500fM的反应液的荧光扩增曲线，如附图3(C)为各个DNA序列浓度反应液的阈值循环数与空白样本的阈值循环数之差(ΔCt＝Ct,blank-Ct,DNA)的柱状图，实验结果表明该方法特异性强。
实施例2
利用T7RNA聚合酶和T4RNA连接酶2偶联反应介导的PCR检测miR-122(5′-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3′)的分析方法，检测原理如图4所示。探针1序列(5′-GGTATCCAGGGAAGTGGATACGAAGAATGCACAAACACCATTG-3′)，探针2序列(5′-(P)TCACACTCCACGCTGTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC-3′)，正向引物序列(5′-GGGAAGTGGATACGAAGAATGC-3′)，反向引物序列(5′-GATCACTAATACGACTCACTATAGG-3′)。
下面对靶miR-122检测的具体实施来进一步说明本发明。其中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。具体操作步骤如下：
首先制备A部分连接反应液。在200μL PCR管中加入1μL转录缓冲溶液(20mMTris-HCl，3mM MgCl2，5mM DTT，5mM NaCl和1mM亚精胺，pH为7.9)，1μL探针1溶液(5nM)，1μL探针2溶液(5nM)，1μL正向引物溶液(5nM)，1μL miR-122溶液，1.8μL DEPC水。将反应液A置于PCR仪，于95℃变性2min；随后降温至37℃保持10min。
制备B部分连接反应液。在200μL PCR管中加入1μL T4RNA连接酶2缓冲液(50mMTris-HCl，2mM MgCl2，1mM DTT，400μM ATP，pH为7.5)，0.2μL T4RNA连接酶2(2U)，1μL T7RNA聚合酶(20U)，0.8μL NTPs(2mM)，0.2μL RNase抑制剂(8U)。
向上述6.8μL反应液A中加入3.2μL反应液B，构成10μL连接反应液，37℃反应1h，之后将反应液置于冰上，终止连接反应。
制备PCR反应液。在八联管或96孔PCR板中加入12.5μL PCR Mix(1×)，0.4μL正向引物(200nM)，0.4μL反向引物(200nM)，1.7μL DEPC水。
将上述10μL连接液加入到PCR反应液中，混合均匀后置于荧光定量PCR仪，于94℃预变性30s；94℃变性5s，60℃退火和延伸30s，共进行40次循环，仪器实时测定溶液的荧光信号强度，并给出阈值循环数(Ct值)，计算空白样本与含miR-122实验样本的Ct值之差ΔCt值。
工作曲线的制作：分别准备已知浓度的miR-122标准溶液，以及空白样本(不含有miR-122，即miR-122浓度为0)，按照上述步骤进行操作，测定各个反应液的荧光扩增曲线。得出阈值循环数(Ct)。然后根据miR-122标准溶液浓度的负对数值和其阈值循环数之差(ΔCt)制作标准工作曲线。
实施例3
利用SP6RNA聚合酶和T4DNA连接酶偶联反应介导的PCR检测来自呼吸道合胞体病毒(RSV)的DNA靶标(5′-TATTTGCCCCATTTTT-3′)的分析方法，检测原理如图5所示。探针1序列(5′-GGTATCCAGGGAAGTGGATACGAAGCGTCGATAAAAATGG-3′)，探针2序列(5′-(P)GGCAAATACCTTTGCTTCGCTTCTATAGTGTCACCTAAAT-3′)，正向引物序列(5′-ATTTAGGTGACACTATAGAAGCG-3′)，反向引物序列(5′-AGGGAAGTGGATACGAAGC-3′)。
下面对DNA靶标检测的具体实施来进一步说明本发明。其中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。具体操作步骤如下：
首先制备A部分连接反应液。在200μL PCR管中加入1μL转录缓冲溶液(20mMTris-HCl，3mM MgCl2，5mM DTT，5mM NaCl和1mM亚精胺，pH为7.9)，1μL探针1溶液(5nM)，1μL探针2溶液(5nM)，1μL正向引物溶液(5nM)，1μL DNA靶标溶液，0.25μL DEPC水。将反应液A置于PCR仪，于95℃变性2min；随后降温至37℃保持10min。
制备B部分连接反应液。在200μL PCR管中加入2μL T4DNA连接酶缓冲液(50mMTris-HCl，10mM MgCl2，1mM DTT，1mM ATP和25μg/ml BSA，pH为7.5)，0.75μL T4DNA连接酶(150U)，1μL SP6RNA聚合酶(20U)，0.8μL NTPs(2mM)，0.2μL RNase抑制剂(8U)。
向上述5.25μL反应液A中加入4.75μL反应液B，构成10μL连接反应液，37℃反应60min，之后将反应液置于冰上，终止连接反应。
制备PCR反应液。在八联管或96孔PCR板中加入12.5μL PCR Mix(1×)，0.4μL正向引物(200nM)，0.4μL反向引物(200nM)，1.7μL DEPC水。
将上述10μL连接液加入到PCR反应液中，混合均匀后置于荧光定量PCR仪，于94℃预变性30s；94℃变性5s，60℃退火和延伸30s，共进行40次循环，仪器实时测定溶液的荧光信号强度，并给出阈值循环数(Ct值)，计算空白样本与含DNA靶标实验样本的Ct值之差ΔCt值。
工作曲线的制作：分别准备已知浓度的DNA靶标标准溶液，以及空白样本(不含有DNA靶标)，按照上述步骤进行操作，测定各个反应液的荧光扩增曲线。得出阈值循环数(Ct)。然后根据DNA靶标标准溶液浓度的负对数值和其阈值循环数之差(ΔCt)制作标准工作曲线。
实施例4
利用T3RNA聚合酶和T4RNA连接酶2偶联反应介导的PCR检测let-7a(5′-TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT-3′)的分析方法，检测原理如图6所示。探针1序列(5′-GGTATCCAGGGAAGTGGATACGAAGCGTCGATAACTATACAAC-3′)，探针2序列(5′-(P)CTACTACCTCACCTTTGCTTTCTCCCTTTAGTGAGGGTTAATT-3′)，正向引物序列(5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3′)，反向引物序列(5′-GATCACTAATACGACTCACTATAGG-3′)。
下面对let-7a检测的具体实施来进一步说明本发明。其中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。具体操作步骤如下：
首先制备A部分连接反应液。在200μL PCR管中加入1μL转录缓冲溶液(20mMTris-HCl，3mM MgCl2，5mM DTT，5mM NaCl和1mM亚精胺，pH为7.9)，1μL探针1溶液(5nM)，1μL探针2溶液(5nM)，1μL正向引物溶液(5nM)，1μL let-7a溶液，1.8μL DEPC水。将反应液A置于PCR仪，于95℃变性2min；随后降温至37℃保持10min。
制备B部分连接反应液。在200μL PCR管中加入1μL T4RNA连接酶2缓冲液(50mMTris-HCl，2mM MgCl2，1mM DTT，400μM ATP，pH为7.5)，0.2μL T4RNA连接酶2(2U)，1μL T3RNA聚合酶(20U)，0.8μL NTPs(2mM)，0.2μL RNase抑制剂(8U)。
向上述6.8μL反应液A中加入3.2μL反应液B，构成10μL连接反应液，37℃反应1h，之后将反应液置于冰上，终止连接反应。
制备PCR反应液。在八联管或96孔PCR板中加入12.5μL PCR Mix(1×)，0.4μL正向引物(200nM)，0.4μL反向引物(200nM)，1.7μL DEPC水。
将上述10μL连接液加入到PCR反应液中，混合均匀后置于荧光定量PCR仪，于94℃预变性30s；94℃变性5s，60℃退火和延伸30s，共进行40次循环，仪器实时测定溶液的荧光信号强度，并给出阈值循环数(Ct值)，计算空白样本与含let-7a实验样本的Ct值之差ΔCt值。
工作曲线的制作：分别准备已知浓度的let-7a标准溶液，以及空白样本(不含有let-7a)，按照上述步骤进行操作，测定各个反应液的荧光扩增曲线。得出阈值循环数(Ct)。然后根据let-7a标准溶液浓度的负对数值和其阈值循环数之差(ΔCt)制作标准工作曲线。

Claims (10)

1.一种RNA聚合酶和连接酶偶联反应介导的定量检测核酸的PCR分析方法，其特征在于，所述PCR分析方法为非诊断和治疗的分析方法，包括以下步骤：
利用靶标核酸与寡核苷酸探针杂交后，连接酶催化寡核苷酸探针之间的切口连接得到连接产物，所述连接产物含有RNA聚合酶启动子序列；所述含有RNA聚合酶启动子序列的正向引物与所述连接产物杂交，形成具有双链启动子结构的转录模板；RNA聚合酶识别所述转录模板，合成启动子下游的与探针序列互补的RNA片段，所述RNA片段能够充当靶标核酸与寡核苷酸探针杂交，介导连接酶催化寡核苷酸探针之间的连接反应；在PCR反应中，DNA聚合酶、正向引物、反向引物和dNTPs共同作用下，以连接产物为模板，得到大量双链DNA，染料SYBR Green I与双链DNA结合产生荧光信号，实时测定反应体系中的荧光信号强度，与标准工作曲线对比，计算出所述靶标核酸的浓度。
2.根据权利要求1所述的定量检测核酸的PCR分析方法，其特征在于，所述靶标核酸为单链DNA或单链RNA。
3.根据权利要求1所述的定量检测核酸的PCR分析方法，其特征在于，所述寡核苷酸探针、正向引物和反向引物均为人工合成。
4.根据权利要求1所述的定量检测核酸的PCR分析方法，其特征在于，所述寡核苷酸探针包括上游寡核苷酸探针和下游寡核苷酸探针；
其中，所述上游寡核苷酸探针的3′末端带有羟基，且3′端序列与所述靶标核酸的3′端序列互补；
所述下游寡核苷酸探针的5′末端修饰磷酸基团，3′端含有所述RNA聚合酶启动子序列，5′端序列与靶标核酸5′端序列互补。
5.根据权利要求1所述的定量检测核酸的PCR分析方法，其特征在于，所述连接酶为商品化的DNA连接酶或RNA连接酶。
6.根据权利要求1所述的定量检测核酸的PCR分析方法，其特征在于，所述RNA聚合酶为T7RNA聚合酶，SP6RNA聚合酶或T3RNA聚合酶。
7.根据权利要求1所述的定量检测核酸的PCR分析方法，其特征在于，所述连接反应和转录反应体系由A、B两部分构成，其中，A部分包括2～20nM上游寡核苷酸探针，2～20nM下游寡核苷酸探针，2～20nM正向引物，以及核酸和DEPC水；B部分包括20～500U连接酶，10～200U RNA聚合酶，100μM～5mM NTPs，和0.1～1.2U/μL RNase抑制剂。
8.根据权利要求1所述的定量检测核酸的PCR分析方法，其特征在于，所述PCR反应体系包括200～800nM正向引物，200～800nM反向引物，50～500μM dNTPs和染料SYBRGreen I和连接反应液。
9.根据权利要求7所述的连接反应和转录反应体系，其特征在于，所述反应步骤为：首先将A部分反应液在80～98℃变性2min，随后降温到20～40℃保持10～30min，然后加入B部分反应液，在20～40℃下反应10～100min；反应结束后，将反应液置于冰上。
10.根据权利要求8所述的PCR反应体系，其特征在于，所述PCR反应程序为：在80～98℃预变性20～30s；80～98℃变性5～30s，55～60℃退火和延伸20～60s，进行20～40次循环。
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