CN115895857A - 检测血液样品中的微小rna的pcr芯片和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测微小RNA即miRNA的方法，其包括以下步骤：(a)在含有微小RNA的待测样品加入聚腺苷酸加尾反应体系，得到3’端具有聚腺苷酸的RNA分子；(b)加入逆转录反应体系，得到逆转录的cDNA产物；其中，加入的通用逆转录引物的3’端为聚T寡核苷酸片段，5’端为延长标签序列片段；以及(c)在DNA扩增反应和荧光检测体系中对扩增产物进行检测，其中，扩增所采用的引物对包括：下游通用引物和特异性识别目标微小RNA的特异性上游引物。本发明提供的方法和试剂盒可方便、高通量和低成本地检测样品中的靶标miRNA。

Description

检测血液样品中的微小RNA的PCR芯片和方法

本申请要求2021年9月30日提交的、申请号为202111166707.6、发明名称为“检测微小RNA的PCR芯片和方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及在样品中检测微小RNA的方法和设备。更具体地说，本发明涉及使用逆转录和扩增反应以及荧光探针在样品中检测微小RNA的PCR芯片、设备和方法。

背景技术

液体活检可以早期检测及反映机体变化，预测疾病的发展方向。配合新一代的测序技术的液体活检技术，被《麻省理工大学科技评论》评选为"2015年十大突破技术"。外周血、唾液及尿液等体液循环miRNA作为检测标志物是属于目前研究液体活检的重要来源之一，提供了一种可用于疾病临床治疗决策及早期预警的很好的解决方案。

微小RNA(miRNA)是指长度为18～24个核苷酸的内源性小分子非编码RNA，普遍存在于各种生物中，通过对靶mRNA进行负调控，从而实现对靶基因的转录调控。随着研究的深入，发现miRNA以及非编码RNA家族，在生物体液中表达丰富，涉及到多种病理生理学过程，对生理条件的改变反应更直接，可作为一种有效的生物标志物。正因为如此，近年来科学家们越来越关注循环miRNA的研究。从研究发现循环miRNA在产前诊断、肺癌、肠癌、前列腺癌、糖尿病、和药物性肝损伤等疾病中的显著意义以来，人们就一直致力于循环miRNA可否用于临床疾病的无创诊断预警方面的应用研究。检测技术方法的不断进步，对于循环miRNA在疾病诊断中的应用研究有了实质性的进展。miRNA在人体各类组织细胞和血液中普遍存在，且具有时空表达特异性，组织特异性等特点。细胞miRNA的表达谱跟各种生理和病理状态息息相关，可以作为疾病预警和诊断的靶标。有别于组织活检的滞后性，利用液体活检技术可以早期预测及反映机体的变化，监控疾病的发展方向。作为循环标志物的一种，体液中循环miRNA具备以下优势：miRNA含量丰富易被检测、稳定性高、具有组织特异性以及具有免疫相关性等特点。

对于miRNA的检测方法，目前已有许多检测分析方法被报道，包括RNA印记法、微阵列芯片法、电化学生物传感器法和实时荧光定量PCR方法等。RNA印记法特异性较高，但该方法灵敏度低且步骤繁琐，不适用于高通量检测。微阵列芯片放可快速高通量检测，但该检测方法重现性和准确性较差。电化学生物传感器检测miRNA需要对其进行电活性标记，操作步骤复杂，且灵敏度不高，对于低水平表达的miRNA检出效果差。

本领域已经开发了各种基于实时荧光定量PCR(qPCR)的miRNA检测技术，但都存在一定的问题。基于SYBR Green的荧光定量PCR可用于检测液体中游离miRNA的表达量，但SYBR Green存在非特异性与双链DNA结合发光导致假阳性的缺陷。另外，还报道了利用茎环引物和miRNA加尾等方法对miRNA进行逆转录扩增检测的方法。但现有的方法存在检测步骤繁琐，探针和/或引物设计复杂，检测成本较高，或者是无法满足高通量检测要求的问题。

本领域还需要更好的检测微小RNA的方法和设备，达到操作方便，高通量、灵敏度高、选择性好、分析快速和整体成本效益好的目的。

发明内容

本发明提供了一种采用PCR芯片检测样品中的微小RNA(microRNA，miRNA)的方法，其包括以下步骤：

(a)在含有待测样品加入聚腺苷酸加尾反应体系，得到3’端具有聚腺苷酸的RNA分子；

所述加尾反应体系含有：用于催化聚腺苷酸加尾反应的酶、用于加尾反应的底物；

(b)加入逆转录反应体系，得到逆转录的cDNA产物；

所述催化体系含有：用于催化逆转录反应的酶、通用逆转录引物、用于逆转录反应的底物；

其中，所述通用逆转录引物的3’端为聚T寡核苷酸片段，5’端为延长标签序列片段；

(c)将得到的cDNA逆转录产物加入到PCR芯片上进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，检测所述扩增产物的存在与否和/或数量，从而获得所述微小RNA的检测结果。在其中一种实施方式中，步骤(c)通过荧光探针法在所述聚合酶链式反应的循环扩增步骤中通过检测报告基团的信号获得所述微小RNA的检测结果。

在本发明的其中又一个方面，步骤(c)中将得到的cDNA逆转录产物加入到PCR芯片上进行聚合酶链式反应(PCR)扩增得到扩增产物，所述PCR芯片包括基板和位于基板上的反应孔，反应孔中具有扩增引物对和通用荧光探针，其中，所述扩增引物对包括：下游通用引物和特异性识别微小RNA的特异性上游引物；其中所述通用荧光探针的3’和5’端分别标记了报告基团或淬灭基团，

在所述聚合酶链式反应的循环扩增步骤中检测报告基团的信号，从而获得所述微小RNA的检测结果，

其中，所述下游通用引物特异性识别所述通用逆转录引物的序列；以及所述通用荧光探针可特异性与所述特异性上游引物和下游通用引物的扩增产物杂交。

微小RNA(microRNA，miRNA)是大小为20-25个核苷酸不等的RNA分子，术语非编码RNA家族。miRNA通过“发夹前体”加工，并可在基因表达中作为负调节物，向下调节许多基因。微小RNA首先作为长“原始转录物”被转录(也被称为原始微小RNA)。然后，这些“原始转录物”被缩短，从其缩短至约70个核苷酸，产生所谓的“茎环结构”，也称为“前-miRNA”。前-miRNA被输出到胞质内，在此被进一步加工，由此产生长约22个核苷酸的天然miRNA分子。

在本发明的方法中，当样品中存在目标微小RNA(或称为靶miRNA)时，经过步骤(a)的加尾反应和(b)的逆转录，由于采用了其3’端具有聚T寡核苷酸片段的通用逆转录引物，可一次性获得样品中所有miRNA模板，达到了大通量的目的。在步骤(c)中，通过加入目标微小RNA的特异性上游引物对前面步骤获得的miRNA文库进行扩增，可以对一个或多个目标微小RNA进行扩增以便于下一步的检测。同时，通过采用识别前述通用逆转录引物中的序列的通用下游扩增引物，可以简化下游引物的设计并降低检测应用的成本。当样品中存在目标微小RNA时，可特异性地获得包括目标微小RNA序列和所述通用逆转录引物序列的扩增子产物。同时，在步骤(c)中，所述探针与包括目标微小RNA序列和所述通用逆转录引物序列的扩增子发生杂交，并在循环扩增的每一个步骤被水解，由此探针上的报告基团脱落和离开淬灭基团，释放荧光信号，从而提供所述微小RNA的检测结果。通过采用识别和结合所述通用逆转录引物的聚T寡核苷酸片段和所述延长标签序列片段中的一个或多个碱基的通用荧光探针，也可简化探针的设计并降低检测应用的成本。

在本发明的其中一个方面，步骤(a)中所述聚腺苷酸加尾反应体系中催化聚腺苷酸加尾反应的酶为具有聚腺苷酸化活性的酶。本领域技术人员已知许多具有聚腺苷酸化活性的酶。聚腺苷酸化活性为使用核糖核酸的3’-端作为底物，在合适的缓冲液中在该3’-端能加上核糖核苷酸，优选为加上至少10-20个核糖核苷酸。所述聚腺苷酸化活性的酶以腺嘌呤-5’-三磷酸作为底物。可用于本发明的具有聚腺苷酸化活性的酶包括：大肠杆菌聚腺苷酸聚合酶、酵母聚腺苷酸聚合酶、牛聚腺苷酸聚合酶、青蛙聚腺苷酸聚合酶、人聚腺苷酸聚合酶和植物聚腺苷酸聚合酶等。在本发明的其中一个方面，步骤(a)中采用的具有聚腺苷酸化活性的酶是大肠杆菌聚腺苷酸聚合酶。

在本发明的其中一个方面，步骤(a)中所述聚腺苷酸加尾反应体系中包括用于加尾反应的底物，例如为三磷酸腺苷(ATP)。在本发明的其中一个方面，步骤(a)中所述聚腺苷酸加尾反应体系中还包括适于酶反应的缓冲液成分。

在本发明的其中一个方面，步骤(b)中逆转录反应体系的酶为具有逆转录酶活性的酶，其可选自来自病毒、细菌和真核细胞，特别是来自热稳定生物的酶。在本发明的说明书中，逆转录和反转录这两个术语都可用于表示以RNA为模板合成DNA的过程。

可用于本发明的具有逆转录酶活性的酶包括：HIV逆转录酶、M-MLV逆转录酶，EAIV逆转录酶，AMV逆转录酶，嗜热栖热菌DNA聚合酶I，M-MLV RNA酶H，Superscript，Superscript II，Superscript III，Sensiscript逆转录酶，ThermoScript和Thermo-X等。在本发明的其中一个方面，步骤(b)中采用的逆转录酶是M-MLV逆转录酶。

在本发明的其中一个方面，步骤(b)中所述逆转录反应体系中还包括适于逆转录酶反应的缓冲液成分，包括二价离子，例如Mg²⁺和Mn²⁺。

在本发明的其中一个方面，步骤(b)中所述逆转录反应体系中还包括逆转录引物。在本发明的方法中，所述逆转录引物是一种通用引物，即可用于将样品中各种微小RNA都逆转录生成对应的cDNA的引物。所述通用逆转录引物的3’端具有聚T寡核苷酸片段，其能够识别在步骤(a)中聚腺苷酸化的miRNA。在本发明中，所述通用逆转录引物的3’端的聚T寡核苷酸片段具有大于10个碱基，例如具有约10-20个碱基，优选为15个碱基。在本发明中，所述通用逆转录引物的5’端为大于约20个碱基(例如为20-30个碱基)的延长标签序列片段。在本发明的其中又一个方面，在所述通用逆转录引物的3’端，即所述聚T寡核苷酸片段的上游还包括锚定碱基序列，用于结合到聚腺苷酸片段的5’末端。所述锚定碱基序列例如为VN，其中“V”代表dATP、dGTP或dCTP；“N”代表dATP、dTTP、dGTP、dCTP中的任意一种。

在本发明的其中一个方面，所述方法中的步骤(a)和(b)为一步反应，即在所述含微小RNA的待测样品同时加入所述加尾反应体系和逆转录反应体系进行加尾反应和逆转录反应，形成逆转录的cDNA产物。

本领域技术人员能通过使用各种酶的对应量、一种或多种合适的温育温度和温育时间，使得催化聚腺苷酸加尾反应的酶和逆转录酶活性在同一个反应体系和溶液条件下发挥其活性，将待测样品中的微小RNA转化为对应的cDNA。

在本发明的其中一个方面，步骤(c)中可采用本领域已知的各种扩增方式对得到的cDNA逆转录产物进行扩增，检测所述扩增产物的存在与否和/或数量，从而获得所述微小RNA的检测结果。

在本发明的其中一种实施方式中，步骤(c)中采用聚合酶链式反应即PCR对得到的cDNA逆转录产物进行扩增，并通过荧光探针法在所述聚合酶链式反应的循环扩增步骤中通过检测报告基团的信号获得所述微小RNA的检测结果。

术语“PCR”或“聚合酶链式反应”是指使用热稳定的DNA聚合酶扩增某种靶核酸分子的反应。聚合酶链式反应的反应体系中包括DNA聚合酶，以及能够与靶核酸特异性杂交的寡核苷酸引物(正向引物和反向引物)、用于PCR扩增反应的底物如脱氧核苷酸(dNTP)混合物、二价离子如Mg2+等的反应缓冲液。“DNA聚合酶”是催化脱氧核苷酸的聚合的酶，该酶将在退火至多核苷酸模板序列的引物的3’端开始合成，并将继续朝向模板链的5’端。本领域已知的各种DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶等都可以用于本发明。通过PCR反应产生的DNA分子称为“扩增产物”。"引物"一般指的是在具有催化与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件(例如具有聚合酶和互补序列的模板，以及在合适的温度)下能够作为沿着互补链合成的起始点的寡核苷酸。在聚合反应体系中，引物可以为一条或多条。术语“引物对”表示一组或一对引物，其包括与扩增的核酸序列的5'末端的互补序列杂交的5'有义引物(有时称为“正向”或“上游”)以及与扩增的序列的3'末端杂交的3'反义引物(有时称为“反向”或“下游”)。

在本发明中，步骤(c)中用于对前面步骤得到的cDNA逆转录产物进行PCR扩增的引物对中的所述下游通用引物识别所述通用逆转录引物，即具有与所述通用逆转录引物的全部或部分互补的序列。在本发明的其中一个方面，所述下游通用引物识别所述通用逆转录引物的延长标签序列片段，例如具有与所述通用逆转录引物的延长标签序列的5’端片段互补的序列。

另外，步骤(c)中用于对前面步骤得到的cDNA逆转录产物进行PCR扩增的引物对中的所述特异性上游引物特异性识别目标微小RNA的全长或部分。优选的，所述特异性上游引物具有对应与目标miRNA的全长的序列。例如所述特异性上游引物具有与miRNA的全长的序列，其中将miRNA中的碱基U变为T。在本发明的其中又一个方面，所述特异性上游引物的Tm值(DNA熔解温度)为60-65度，优选为60度。

在本发明中，步骤(c)中所述通用荧光探针可特异性地与前述特异性上游引物和下游通用引物的扩增产物杂交。

在本发明的其中一个方面，所述通用荧光探针识别和结合所述扩增产物中对应所述通用逆转录引物的片段，即具有与所述通用逆转录引物的全部或部分互补的序列。例如，所述探针识别和结合所述通用逆转录引物的聚T寡核苷酸片段和所述延长标签序列片段中的一个或多个碱基。

在本发明的其中一个方面，所述通用荧光探针的长度为约15-30个碱基，优选为19-24个碱基，例如为19个碱基。在本发明的其中一个方面，所述通用荧光探针的5’端具有约10-15个寡聚腺苷酸，以及3’端还具有一个或多个与所述通用逆转录引物的延长标签序列片段互补的碱基。

在本发明的方法的步骤(c)中，采用荧光探针，或称为TaqMan检测探针来检测PCR扩增产物。探针是指含有与靶标序列(如PCR扩增产物)互补和能够形成杂交的核酸分子。所述荧光探针的3’和5’端分别标记了报告基团或淬灭基团，所述报告基团的信号可被淬灭基团淬灭。所述探针可特异性与所述特异性上游引物和下游通用引物的扩增产物杂交。所述探针在识别和与扩增产物形成DNA双链后，可以通过DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性被水解，从而释放所述报告基团和淬灭基团。

术语"报告基团"一般指的是产生可检测的荧光或发光辐射的发射的部分，该发射可以被转移给足够接近的适当的FRET猝灭剂。通常，这样的分子是染料。术语"猝灭基团"通常指的是减少和/或能够减少可检测的荧光或发光辐射的发射的部分。猝灭分子导致来自报道分子的荧光发射减少，由此报道分子/猝灭分子形成FRET对。术语"FRET"(荧光共振能量转移或

型共振能量转移)通常指的是两个染料分子的电子状态之间的动态距离依赖的相互作用，其中能量从供体染料分子转移到受体染料分子而没有来自供体分子的光子发射。

在本发明的其中一个方面，步骤(c)中所述通用荧光探针的3’和5’端分别标记了报告基团或淬灭基团。在本发明的其中一个方面，所述探针的3’标记淬灭基团和5’端标记报告基团。

在本发明的其中一个方面，其中所述报告基团为荧光报告基团。在本发明的其中一个方面，所述报告基团选自FAM、VIC、HEX,、TET、TAMRA等，优选为FAM。

在本发明的其中一个方面，其中所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB等，优选为MGB。

在本发明的其中一个方面，其中所述PCR芯片包括检测以下微小RNA的扩增引物对：

(a)待测微小RNA；

(b)质控用微小RNA；

(c)数据标准化分析用微小RNA。

在本发明的方法中，通过质控模块来监测样品的质量问题，以及用于提供PCR反应过程的阳性和阴性参照。通常采用受试者体液内表达稳定以及样品本身性质相关的循环miRNA作为检测靶标。在本发明的其中一个方面，所述质控用微小RNA为受试者中稳定表达的微小RNA(例如为let-7i-5p，miR-222-3p，miR-30e-5p，miR-148b-3p，miR-484-5p，miR-93-5p，miR-425-5p等)和/或检测样品性质的微小RNA(例如为miR-23a-3p，miR-451a等)。

在本发明的方法中，通过数据标准化分析模块对反应过程的效率进行校正，用于对待检测靶标miRNA数据进行标准化处理和分析。在本发明的其中一个方面，所述数据标准化分析用微小RNA为对应于待测微小RNA的外源物种的微小RNA。

在本发明的其中一个方面，上述检测微小RNA的方法用于体外检测的应用。

在本发明的其中一个方面，上述体外检测微小RNA的方法用于非诊断性和非治疗性的应用。

本发明还提供了用于实施前述本发明的方法的PCR芯片。如前所述，所述方法包括在待测样品加入聚腺苷酸加尾反应体系，得到3’端具有聚腺苷酸的RNA分子，以及加入逆转录反应体系，得到逆转录的cDNA产物；其中，所述的通用逆转录引物的3’端为聚T寡核苷酸片段，5’端为延长标签序列片段。

本发明通过的所述PCR芯片包括基板和位于基板上的反应孔，反应孔中具有扩增引物对和通用荧光探针，其中，所述扩增引物对包括：下游通用引物和特异性识别微小RNA的特异性上游引物；其中所述通用荧光探针的3’和5’端分别标记了报告基团或淬灭基团，

其中，所述下游通用引物特异性识别通用逆转录引物的序列；以及所述通用荧光探针可特异性与所述特异性上游引物和下游通用引物的扩增产物杂交。

在本发明的其中一个方面，所述下游通用引物特异性识别所述通用逆转录引物的延长标签序列片段。

在本发明的其中一个方面，所述特异性上游引物特异性识别目标miRNA的全长或部分，优选的，所述特异性上游引物具有对应与目标miRNA的全长的序列。

在本发明的其中一个方面，所述通用荧光探针识别和结合所述扩增产物中对应所述通用逆转录引物的片段。

在本发明的其中一个方面，所述通用荧光探针识别和结合所述通用逆转录引物的聚T寡核苷酸片段和所述延长标签序列片段中的一个或多个碱基。

在本发明的其中一个方面，所述通用荧光探针的长度为约15-30个碱基，优选为19-24个碱基，例如为19个碱基。

在本发明的其中一个方面，所述通用荧光探针的5’端具有约10-15个寡聚腺苷酸，以及3’端还具有一个或多个与所述通用逆转录引物的延长标签序列片段互补的碱基。

在本发明的其中一个方面，所述PCR芯片包括检测以下微小RNA的扩增引物对：

(a)待测微小RNA；

(b)质控用微小RNA；

(c)数据标准化分析用微小RNA。

本发明还提供了用于实施前述本发明的检测微小RNA的方法的设备，其包括：

用于安装前述PCR芯片的芯片座；

至少一个加热块，其设置为可与所述PCR芯片接触和传导热。

在本发明的其中一个方面，所述设备还包括：

驱动部，用于控制所述芯片座进行移动。

在本发明的其中一个方面，所述设备还包括：

光源，其可在聚合酶链式反应的循环扩增步骤提供激发光；

以及

光检测单元，用于检测在PCR芯片的反应孔中产生的荧光。

本发明还提供了用于实施前述本发明的方法的试剂盒。本发明提供的试剂盒包括：

(a)聚腺苷酸加尾反应体系，其含有：用于催化聚腺苷酸加尾反应的酶、用于加尾反应的底物；

(b)逆转录反应体系，其含有：用于催化逆转录反应的酶、通用逆转录引物；

(c)PCR芯片，其包括基板和位于基板上的反应孔，反应孔中具有扩增引物对和通用荧光探针。

在本发明的其中一个方面，所述试剂盒还包括：用于催化聚合酶链反应的酶、用于PCR扩增反应的底物。在本发明的其中又一个方面，所述用于PCR扩增反应的底物也可预置于所述PCR芯片的反应孔中。

本发明提供的试剂盒中的用于催化聚腺苷酸加尾反应的酶、用于加尾反应的底物；用于催化逆转录反应的酶、通用逆转录引物；以及所述用于催化聚合酶链反应的酶、用于PCR扩增反应的底物、下游通用引物和特异性识别目标微小RNA的特异性上游引物、通用荧光探针如前描述和定义。

在本发明的其中一个方面，所述试剂盒中的聚腺苷酸加尾反应体系和逆转录反应体系配置在一个反应体系中。本发明的方法和试剂盒适于将聚腺苷酸加尾反应和逆转录反应在一步法中进行，即在一个反应体系同时进行加尾反应和逆转录反应，得到逆转录的cDNA产物。在同时包含聚腺苷酸加尾反应体系和逆转录反应体系中，包括了聚腺苷酸加尾反应和逆转录反应需要的酶和底物，并且通过调节各种酶的对应量、缓冲液的离子浓度等条件，使得催化聚腺苷酸加尾反应的酶和逆转录酶活性在同一个反应体系和溶液条件下发挥其活性。

采用本发明的方法和试剂盒能够非常高效地和准确地检测样品中的目标miRNA。具体的，本发明的方法通过一步法将miRNA加尾和逆转录同时进行，利用通用逆转录引物序列，通用一次逆转录反应就为所有miRNA加尾，并完成所有miRNA的PCR模板制备；另外，通过通用荧光探针，可用于逆转录后所有miRNA的检测，包括通过特异性上游扩增引物来对具体的目标miRNA进行特异性检测。

本发明提供的方法克服了现有技术的检测方法的缺陷，具有以下优点：一、快速获得所有靶标miRNA逆转录产物；二、对于加尾后miRNA的序列，设计出通用荧光探针，提高检测的灵敏性和特异性；三、基于miRNA的快速逆转录产物和通用荧光探针的设计，可对样本中的miRNA进行高通量的检测，解决了对于miRNA检测利用定制化Taqman探针以及高通量检测成本高、耗时长的问题。本发明对从临床液体样本处理、批量miRNA的获得、以及利用PCR芯片高通量检测靶标miRNA的研究提供了平台基础。

在本发明中,有关术语具有现有的生物技术、有机化学、无机化学等领域的常规定义。具体的，有关术语可如以下说明和定义。

术语"样品"指的是包含或推测包含目标微小RNA的任何物质。例如从个体分离的组织或液体样品，包括但不限于，例如，皮肤、血液、脊髓液、淋巴液、滑液、尿、泪液、血细胞、器官、肿瘤，以及体外细胞培养组分样品。优选的，所述样品为血浆、血清、淋巴液、尿液、唾液、乳汁、精液、阴道分泌液、泪液、脊髓液等体液样品。

术语"互补"是指公知的Watson-Crick碱基配对，包括双链DNA中碱基对腺嘌呤-胸腺嘧啶和鸟嘌呤-胞嘧啶之间，或者RNA/DNA杂交分子中腺嘌呤-尿嘧啶和鸟嘌呤-胞嘧啶之间的配对，以及非常规核苷酸或衍生物之间的类似组合。术语核酸序列的互补物指的是当与核酸序列对应以便一条序列的5'末端与另一条的3'末端配对时处于"反向平行结合"的寡核苷酸。互补通常是指完全的互补，但有时不是完全的，例如可以包含错配碱基对或不匹配碱基，但仍能形成比较稳定的双链结构的情况。

术语"靶微小RNA"或"靶核酸序列"指的是要检测的微小RNA或要扩增的核酸序列。靶序列通常具有与引物或探针互补的序列，或为位于用于扩增的两引物序列之间的序列。

如本文所用，术语“Ct值(阈值循环)”是指用于在指数期范围内实时测量扩增产物的实时PCR的循环数，此时测量的荧光强度显著提高至远高于实时PCR中的基线水平的程度。其反映了靶RNA的初始模板的量。

附图说明

图1为本发明示例性的利用PCR芯片来检测样品中的miRNA的方法的流程示意图。

图2为示例性的检测样品中的miRNA的芯片的质控模块检测结果(溶血指标检测)。

图3为示例性的检测样品中的miRNA的芯片的质控模块检测结果(内参指标检测)。

图4为示例性的检测样品中的miRNA的芯片的数据标准化分析模块检测结果。

图5为示例性的检测样品中的miRNA的芯片的核心模块检测结果。图5上方图示出扩增曲线。图5下方图为结果柱形图。

具体实施方式

通过以下实施例进一步说明本发明，但这些实施例不在任何方面限制本发明。

实施例1样品溶液中游离miRNA提取、检测以及定量

实验仪器和试剂：

PCR仪(ABI Veriti)、荧光定量PCR(ABI StepOne Plus)、八连管(Axygen#PCR-0208-C)、荧光定量96孔PCR板(ABI#4346906)、PCR封板膜(ABI#4306311)低温高速离心机(Eppendorf 5424R)、冷冻干燥机(LABCONCO),自动移液工作站(Eppendorf)、超净工作台(浙江苏净净化设备有限公司)EP管、移液枪(Eppendorf)、通用核酸提取试剂盒(GeneDoTech#GD-101)、荧光探针、引物(上海艾博思生物科技有限公司)、一步法逆转录试剂盒(GeneDoTech#GD-102)、探针法荧光定量PCR试剂(Takara#RR390A)

以下引物和探针由上海艾博思生物科技有限公司合成和提供。引物及探针序列如下：

SEQ ID No.1：cel-miR-39上游引物：CACCGGGTGTAAATCAGCTTG

SEQ ID No.2：cel-miR-54上游引物：CAGTACCCGTAATCTTCATAATCCGAG

SEQ ID No.3：cel-miR-238上游引物：AGTTTGTACTCCGATGCCATTCAG

SEQ ID No.4：hsa-miR-23a上游引物：GATCACATTGCCAGGGATTTCC

SEQ ID No.5：hsa-miR-451a上游引物：GCAGAAACCGTTACCATTACTGAGTT

SEQ ID No.6：let-7i-5p上游引物：CAGTGAGGTAGTAGTTTGTGCTGTT

SEQ ID No.7：hsa-miR-30e-5p上游引物：CAGTGTAAACATCCTTGACTGGAAG

SEQ ID No.8：hsa-miR-148b上游引物：AGTCAGTGCATCACAGAACTTTGT

SEQ ID No.9：hsa-miR-222-3p上游引物：GCTACATCTGGCTACTGGGT

SEQ ID No.10：hsa-miR-425-5p上游引物：GACACGATCACTCCCGTTGA

SEQ ID No.11：hsa-miR-484上游引物：CTCAGTCCCCTCCCGAT

SEQ ID No.12：hsa-miR-1上游引物：GCGCAGTGGAATGTAAAGAAGTATGTAT

SEQ ID No.13：hsa-miR-21上游引物：ACCAGTCGATGGGCTGT

SEQ ID No.14：hsa-miR-155上游引物：CAGTTAATGCTAATCGTGATAGGGGTT

SEQ ID No.15：hsa-miR-16上游引物：GTAGCAGCACGTAAATATTGGCG

SEQ ID No.16：通用下游引物：GTCCGAGCAGCACGATC

SEQ ID No.17：通用荧光探针：FAM-5’-AAAAAAAAAAAAAAACTGG-3’-MGB

实验步骤：

a)血浆标本收集

从志愿者收集正常人外周血血浆样本，使用EDTA抗凝管采集外周血3ml，室温放置1h，1600g离心10min，吸取上层血浆，按照每200μl一管进行分装，冻存于-80℃冰箱。

b)血浆游离miRNA提取

取新鲜血浆200ul，按照miRNA提取试剂盒说明，每200μl血浆加入800μl的裂解液，颠倒混匀3-5次，加入系列稀释浓度cel-miR-39mimic的外源参照物，以及10ul的助提取剂(50ng/μl tRNA),向上一步匀浆好的EP管中加入200μl氯仿，并将其盖住。涡旋或剧烈摇动15s，充分混合。在室温(15-25℃)下，将EP管放置在实验台上静置2-3分钟。在4℃以12,000g离心15分钟。离心后，样品分成3层：上层是含有RNA的无色水层，白色含有蛋白的中间层，和较低的红色有机层。将上层水相(～500μl)转移到新的EP管中。避免接触到其他层。加入等体积的异丙醇，使用移液枪上下吸取几次来彻底混匀。室温放置10-15min。将上一步中混合液取500μl转入RNase-free吸附柱中，8,000g,离心30秒,弃掉流出液，再将剩余混合液转入RNase-free吸附柱中，8,000g,离心30秒,弃掉流出液。向RNase-free吸附柱中加入750μl的已经加入75％乙醇的清洗液，8,000g,离心30秒,轻轻倒掉上流出液。加入500μl的75％的乙醇，8,000g,离心2分钟,轻轻倒掉上流出液，向吸附柱中加入15μl无核酸酶水，室温静置1min。12,000g,离心1分钟，弃掉吸附柱，立即进行逆转录或-80℃冰箱保存。

c)miRNA的一步法逆转录：

本实施例中采取的本发明示例性的检测miRNA的方法的流程如图1所示。所述方法包括：步骤1：在含有微小RNA的待测样品加入加尾反应体系，得到3’端具有聚腺苷酸的RNA分子；步骤2：加入逆转录反应体系，得到逆转录的cDNA产物，其中加入的通用逆转录引物的3’端为10-20个碱基的oligo(dT)片段，5’端为大于约20个碱基的延长标签序列片段；步骤3：对得到的cDNA逆转录产物进行PCR扩增，形成扩增产物，其中加入的引物对包括：识别和结合所述通用逆转录引物的下游通用扩增引物和识别微小RNA序列的特异性上游扩增引物；步骤4：在PCR反应体系中加入通用荧光探针，所述探针识别和结合所述通用逆转录引物的oligo(dT)片段和所述延长标签序列片段中的一个或多个碱基，以及在PCR的每个循环扩增步骤中检测荧光报告基团的信号。

在本实施例给出的优选的技术方案中，步骤1和2为一步法，即在同一个反应体系中进行，在所述含微小RNA的待测样品同时加入所述加尾反应体系和逆转录反应体系进行加尾反应和逆转录反应，从而形成逆转录的cDNA产物。

具体的，本实施例中的方法步骤包括：

一步法加尾和逆转录：

取5μl的总RNA加入5μl的无核酸水稀释，加到8连管中，继续加入1μl的M-MLV逆转录酶和0.4μl的聚合酶A,再加8.6μl的逆转录混合液(工作浓度：dNTP 1mM,ATP 0.1mM,250mM NaCl,50mM Tris-HCl 10mM MgCl2,通用逆转录引物1μM)，充分混合后，使用移液枪混匀3-5次，将8连管放到PCR仪中，设置程序：42℃60min，95℃5min，4℃5min。

d)PCR芯片准备

配制上游特异性引物、下游通用引物储液浓度均为10μM，按照1:1混合均匀，上下游引物浓度均为5μM；配制通用探针溶液，最终浓度为5μM，将引物混合液和通用探针溶液混合均匀后，按照检测miRNA的数量分装至第一块96孔板中，作为储液板。

准备新的PCR板作为芯片检测板，利用自动移液工作站将储液板中的引物/探针混合液按照反应体积每个孔分装2μl，将PCR芯片板转移至无菌超净工作台中，打开风机(0.3m/s),干燥8hr，待其反应孔内液体干燥后，使用PCR封板膜封板待用。

本发明提供的方法和设备中提供的PCR芯片包括三个主要模块：核心检测模块、质控模块和数据标准化分析模块。

核心检测模块，扩增和检测的对象包括任意待检测miRNA的组合，可将特异性上游引物、通用下游引物以及通用探针预置在芯片的反应孔内。

质控模块，用于监测样品本身的质量问题以及PCR反应过程的阳性和阴性参照。扩增和检测的对象包括受试物种(如人类)体液液内稳定表达的miRNA(包括let-7i-5p,miR-222-3p,miR-30e-5p,miR-148b-3p,miR-484-5p,miR-93-5p,miR-425-5p等)、空白对照、可用于检测样品性质的miRNA(miR-23a-3p,miR-451a等)。

数据标准化分析模块，用于对反应过程的效率进行校正，导出结果可用于对待检测靶标miRNA数据进行标准化处理和分析。扩增和检测的对象包括外源物种miRNA(cel-miR-39,cel-miR-43,cel-miR-43,cel-miR-54,cel-miR-238,cel-miR-239b等)。

e)探针法实时荧光定量PCR：

10μl荧光定量反应体系包括：2x PCR反应液(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl₂等)5μl，miRNA cDNA产物(10倍稀释后产物)1μl，ROX Dye 0.2μl，无核酸酶水2.3μl。

荧光定量PCR仪反应程序：95℃30s，40循环(95℃5s，60℃30s)。

PCR芯片不同模块检测结果如下。

图2为芯片的质控模块检测结果(溶血指标检测)。图2显示血浆质控指标hsa-miR-23a和hsa-miR-451a扩增Ct值，当二者delta Ct(hsa-miR-23a)-Ct(hsa-miR-451a)>7时，该血液样本出现溶血，视为不合格，需重新收取样本进行提取和逆转录。

图3为芯片的质控模块检测结果(内参指标检测)。图3显示内参指标扩增Ct值，该内参为血浆内表达稳定的miRNA，其扩增的均一性可用于检测样本质量，NTC为阴性对照孔，未见其扩增。根据内参基因筛选软件Bestkeeper(https://www.gene-quantification.de/bestkeeper.html)计算规则，对该组内参进行稳定性分析，将6个候选内参基因的Ct值直接输入Bestkeeper软件，计算Ct值的标准差(SD)和变异系数(CV),通过比较Ct值的标准偏差(SD)和内参组的均值(mean)获得变异系数(CV)，变异系数(CV)越小，则该组内参的稳定性越高。

如表1所示，该PCR芯片内参组的变异系数(CV)的阈值设定为10％，当内参组变异系数(CV)大于10％时，则认为该样本质量发生改变，需重新提取样本进行检测。

表1内参指标扩增Ct值分析

图4为芯片的数据标准化分析模块检测结果。数据标准化分析模块通过检测加入的三个外源物种spike in(cel-miR-39、54、238)，扩增曲线结果见图4。Ct值的如表2所示。变异系数(CV)小于10％，表明样本处理和扩增过程稳定性，样品的逆转录和扩增效率也是稳定的。外参Ct值可用于对待检测靶标miRNA的数据进行标准化处理。

表2外参指标扩增Ct值分析

图5为芯片的核心模块检测结果。靶标miRNAs(miR-1,miR-21,miR-155，miR-16)的扩增曲线如图5上方图所示。根据2-△Ct计算靶标miRNA相对外参的相对表达量，其中△Ct＝Ct(靶标miRNA)－Ct(外参均值)，结果如图5下方所示柱形图。对于不同PCR芯片上靶标miRNA相对表达量，可用2-△△Ct计算方法，△△Ct＝{Ct(靶标miRNA)－Ct(外参均值)}_芯片1－{Ct(靶标miRNA)－Ct(外参均值)}_芯片2，可对于不同芯片上的靶标miRNA的表达量进行比较。具体结果见下表3，其为扩增靶标miRNA的Ct数值和计算的相对表达量。

表3靶标miRNA扩增Ct值分析

靶标miRNA	Ct值	△Ct	2-△Ct
				miR-1	31.75	2.91	0.13304627
miR-21	26.99	-1.85	3.60500185
				miR-155	31.76	2.92	0.13212726
miR-16	24.24	-4.6	24.2514651

实验证明，本发明提供的方法具有以下优点：一、能快速获得所有靶标miRNA逆转录产物；二、对于加尾后miRNA的序列，通过通用荧光探针，提高了检测的灵敏性和特异性；三、基于miRNA的快速逆转录产物和通用荧光探针的设计，可对样本中的miRNA进行高通量的检测，解决了对于miRNA检测利用定制化Taqman探针以及高通量检测成本高、耗时长的问题。本发明对从临床液体样本处理、批量miRNA的获得、以及利用PCR芯片高通量检测靶标miRNA的研究提供了平台基础。

除非另外指出，本发明的实践将使用生物技术、有机化学、无机化学等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。本文所提到的所有专利、专利申请与科技论文均据此通过引用结合到本文。

Claims (10)

1.一种PCR芯片，其具有基板和位于基板上的反应孔，所述芯片包括以下模块和其中的检测微小RNA的扩增引物对：

(a)待测微小RNA；

(b)质控用微小RNA；(分成样品质控和内参)

(c)数据标准化分析用微小RNA。

2.根据权利要求1所述的PCR芯片，其中所述质控用微小RNA为受试者中稳定表达的微小RNA(例如为let-7i-5p，miR-222-3p，miR-30e-5p，miR-148b-3p，miR-484-5p，miR-93-5p，miR-425-5p等)和/或检测样品性质的微小RNA(例如为miR-23a-3p，miR-451a等)。

3.根据权利要求1所述的PCR芯片，其中所述数据标准化分析用微小RNA为对应于待测微小RNA的外源物种的微小RNA。

4.根据权利要求1所述的PCR芯片，在所述芯片上进行的检测方法包括：在待测样品加入聚腺苷酸加尾反应体系，得到3’端具有聚腺苷酸的RNA分子，以及加入逆转录反应体系，得到逆转录的cDNA产物；其中，所述的通用逆转录引物的3’端为聚T寡核苷酸片段，5’端为延长标签序列片段；

其中，所述PCR芯片的反应孔中具有扩增引物对，所述扩增引物对包括：下游通用引物和特异性识别微小RNA的特异性上游引物；其中所述通用荧光探针的3’和5’端分别标记了报告基团或淬灭基团，

其中，所述下游通用引物特异性识别通用逆转录引物的序列；以及所述通用荧光探针可特异性与所述特异性上游引物和下游通用引物的扩增产物杂交。

5.根据权利要求4所述的PCR芯片，其中在所述芯片上进行的检测方法包括：用通用荧光探针检测所述特异性上游引物和下游通用引物的扩增产物；其中所述通用荧光探针的3’和5’端分别标记了报告基团或淬灭基团，可特异性与所述特异性上游引物和下游通用引物的扩增产物杂交，

其中所述通用荧光探针设置在所述反应孔中。

6.根据权利要求4所述的PCR芯片，其中所述下游通用引物特异性识别所述通用逆转录引物的延长标签序列片段。

7.根据权利要求4所述的PCR芯片，其中所述特异性上游引物特异性识别目标miRNA的全长或部分，优选的，所述特异性上游引物具有对应与目标miRNA的全长的序列。

8.根据权利要求1所述的PCR芯片，其中在所述芯片上进行的检测方法包括：用非特异性结合核酸的试剂(如SYBR GREEN)检测所述特异性上游引物和下游通用引物的扩增产物。

9.根据权利要求1所述的PCR芯片，其为用于检测血液样品(血浆、血清、脊髓液等)的PCR芯片。

10.一种用于检测微小RNA的设备，其包括：

用于安装根据权利要求1-9中任一项所定义的PCR芯片的芯片座；

至少一个加热块，其设置为可与所述PCR芯片接触和传导热，

任选的，所述设备还包括以下结构中一个或多个：

驱动部，用于控制所述芯片座进行移动；

光源，其可在聚合酶链式反应的循环扩增步骤提供激发光；

以及

光检测单元，用于检测在PCR芯片的反应孔中产生的荧光。

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