CN117778540A - 一种基于可编程DNA条形码编码指数扩增对miRNA的一锅法多重检测方法 - Google Patents
一种基于可编程DNA条形码编码指数扩增对miRNA的一锅法多重检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于可编程DNA条形码编码指数扩增对miRNA的一锅法多重检测方法：S1、EXPAR扩增模板、探针设计：针对每种待测miRNA，设计其EXPAR扩增模板，所述扩增模板由五个结构域组成：B‑N‑X‑N‑X，其中X代表miRNA识别位点，N包含Nt.BsmAI的切口位点，而B代表不同扩增模板具有的独特熔解温度编码序列的互补序列；S2、绘制标准曲线；S3、待测样品检测。本发明适用于在多种复杂混合物中同时检测多重microRNA，整个流程均可在实时荧光PCR仪上一次性完成，特异性好、灵敏度高，操作简便，反应时间短且结果判定简单迅速，具有优异的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于可编程DNA条形码编码指数扩增对miRNA的一锅法多重检测方法。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一类短序列、单链、非编码RNA，通过诱导mRNA切割或翻译抑制来调节转录后水平的基因表达。miRNA在细胞分化、细胞凋亡、增殖、发育、代谢和病毒感染中具有重要的调控功能。越来越多的研究表明，miRNA表达失调与不同疾病(尤其是癌症)的发生、进展和转移有着错综复杂的联系。鉴于miRNA在体液中的相对稳定性，它们通常被认为是用于诊断目的的有前途的生物标志物。然而，miRNA的调控是一个复杂且协调的网络，因为一个miRNA可以调控多个mRNA，而多个miRNA可以协同控制一个mRNA。因此，仅基于一种特定的miRNA很难进行诊断，而多种miRNA的组合可以提高诊断的准确性。
目前，通常使用RT-qPCR、微阵列、核酸测序来检测microRNA，但是这些方法周期长，操作复杂且费用高昂。相比之下，等温核酸扩增(Isothermal nucleic acidamplification)已成为一种很有前途的替代方案，在恒定的温度下能够实现快速有效的扩增。在过去的三十年中，已经开发了许多等温核酸扩增技术，采用各种扩增机制，具有非凡的灵敏度。这些方法被广泛探索用于检测miRNA，包括滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、环介导的等温扩增和指数扩增反应(EXPAR)。在这些方法中，EXPAR具有灵敏度高、成本低、动力学突出等优点，可在30分钟以内恒定温度下提供106-109倍的寡核苷酸扩增。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种基于可编程DNA条形码编码指数扩增对miRNA的一锅法多重检测方法。
本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：
一种基于可编程DNA条形码编码指数扩增对miRNA的一锅法多重检测方法，包括以下步骤：
S1、EXPAR扩增模板、探针设计
针对每种待测miRNA，设计其EXPAR扩增模板，所述扩增模板由五个结构域组成：B-N-X-N-X，其中X代表miRNA识别位点，N包含Nt.BsmAI的切口位点，而B代表不同扩增模板具有的独特熔解温度编码序列的互补序列；根据不同miRNA，不同扩增模板包含独特熔解温度编码序列，通过熔解曲线可区分不同miRNA；
所述探针包括与采用EXPAR反应所获得的3’末端为富G序列的扩增产物互补的序列区域，富G区与荧光探针结合后可以猝灭荧光，产生荧光信号；探针序列是在原始编码序列中引入一个或两个碱基突变来设计一系列条形码链，从中选出可以清楚地区分不同miRNA熔体温度的编码序列；
S2、绘制标准曲线
分别配制不同待测对象miRNA的不同浓度标准品溶液，分别建立每种待测miRNA的标准曲线，步骤如下：
S2.1、等温指数扩增反应：
配制溶液A：将目标miRNA的EXPAR扩增模板、每份标准品miRNA溶液、10×CutSmart混匀，在90-95℃加热2-5分钟，随后缓慢降低至室温得到溶液A；
配制溶液B：将dNTP、荧光标记探针、DEPC处理水、KF聚合酶和Nt.BsmAI内切酶在混匀配置成溶液B；
将溶液A与溶液B混合，孵育后灭活处理后得到溶液C；
S2.2、熔解曲线分析：
将溶液C进行EXPAR反应，生成熔解曲线图，图上的纵坐标即为荧光变化率dRFU/dT；
S2.3、标准曲线建立
以不同浓度标准品的log10[miRNA浓度]为横坐标，以log10(dRFU/dT)为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程；
S3、待测样品检测
S3.1、等温指数扩增反应：取待测品miRNA溶液按照S2.1中的方法进行等温指数扩增反应；
S3.2、熔解曲线分析：与步骤S2.2相同；
S3.3、待测样品浓度计算：
根据步骤S3.2得到的熔解曲线图获得待测品的荧光变化率dRFU/dT，代入步骤S2.3得到的回归方程中，计算即可得到待测miRNA样品的浓度。
所述待测miRNA包括miRNA-21、miRNA-9、miRNA-122中的一个或多个；
miRNA-21对应的扩增模板序列为：CCCTACTTCATCCAACTACTCCACGGAGACTCAACATCAGTCTGATAAGCTAGGAGACTCAACATCAGTCTGATAAGCTA-p’；
miRNA-9对应的扩增模板序列为：CCCTACTTCATCCAAGGACTCCACGGAGACTCATACAGCTAGATAACCAAAGAGGAGACTCATACAGCTAGATAACCAAAGA-p’；
miRNA-122对应的扩增模板序列为：CCCTACTTTATCCAAGTACTTCACGGAGACCAAACACCATTGTCACACTCCAGGAGACCAAACACCATTGTCACACTCCA-p’。
所述探针为荧光标记探针，探针序列是：HEX-CCCTACTTCATCCAACTACTCCAC-p’。
所述溶液A的总体积为3μL，含有：1μM扩增模板1μL、miRNA溶液1μL、10×CutSmart缓冲液1μL；当步骤S3.1中含有多个待测miRNA时，按照每种miRNA配制一份3μL的溶液A后混合所有的溶液A得到总的溶液A；
所述溶液B的总体积为7μL，含有：250μM dNTP 1μL、100nM荧光标记探针1μL、KF聚合酶0.2U和Nt.BsmAI内切酶1.5U、余量为DEPC处理水；当步骤S3.1中含有多个待测miRNA时，按照每种miRNA配制一份7μL的溶液B后混合所有的溶液B得到总的溶液B；
将总的溶液A、总的溶液B混合后得到总的溶液C，用于熔解曲线分析。
所述步骤S2.2和S3.2中熔解曲线分析方法为：将溶液C在90℃变性2分钟，梯度退火至25℃，按1℃/step的升温速率从45℃升温至90℃，并采集荧光信号，根据熔解曲线对反应产物进行分析。
所述步骤S2.2和S3.2中每5s测量每0.5℃的荧光发射，生成熔解曲线图。
所述步骤S2.3中，
miRNA-21的回归方程为：log10(dRFU/dT)＝0.1548×log10C+4.2617(R2＝0.9989)，miRNA-9的回归方程为：log10(dRFU/dT)＝0.1932×log10C+4.5256(R2＝0.9949)，miRNA-122的回归方程为：log10(dRFU/dT)＝0.1145×log10C+3.7461(R2＝0.9837)，其中，C为miRNA样品的浓度。
所述标准品为浓度为10fM～1nM的梯度浓度样品。
所述溶液A将各组分混匀后，在90℃水浴加热2分钟，随后缓慢降低至室温得到溶液A。
所述等温指数扩增反应将溶液A与溶液B混合，在36-38℃下孵育28-32分钟，并在80℃灭活处理20分钟得到溶液C。
本发明方法中设计的EXPAR扩增模板由五个结构域组成：X-N-X-N-B，其中X代表miRNA识别位点，N包含Nt.BsmAI的切口位点，而B通过扩增可生成预先设计的编码序列。在目标miRNA存在的情况下，靶标与X结构域结合，并在KF聚合酶和dNTP的帮助下沿模板3'末端引发聚合反应，随后形成包含两个Nt.BsmAI识别位点(5'-GTCTC-3')的双链DNA。核酸内切酶在识别位点的下一个碱基处切割DNA单链，形成的3’末端通过DNA聚合酶继续沿着模板向前延伸。DNA聚合酶通过链置换活性将下游DNA链(X-N和B)置换下来。同时，生成的X'-N'链与另一个模板杂化并触发新的反应循环。最后，生成许多3’端富含G碱基的条形码链，随后与5’端带有HEX荧光基团荧光探针杂交并猝灭荧光信号，可通过生成的熔解曲线区分不同靶标。相反，在没有靶标的情况下，EXPAR反应未能被触发，从而抑制了下游反应。
本发明方法原理图如图1所示，将熔解温度编码序列与等温指数扩增反应(EXPAR)结合，通过EXPAR模板与靶标miRNA结合以触发释放大量具有明显区分Tm值的单链DNA(ssDNA)。随后所有生成的ssDNA链与用荧光基团标记的通用探针结合并淬灭荧光信号。最后，在反应后通过熔解曲线分析(MCA)，计算相应Tm值下的荧光变化率来量化miRNA的浓度，从而实现对扩增产物的鉴定。本发明适用于同时检测多个microRNA，整个流程均可在实时荧光PCR仪上完成，特异性好，结果判定简单，具有潜在的应用价值。
本发明的有益效果是：
(1)本发明适用于在多种复杂混合物中同时检测多重microRNA，整个流程均可在实时荧光PCR仪上一次性完成，特异性好，操作简便，反应时间短且结果判定简单迅速，具有优异的应用价值。
(2)本发明将微量，易降解的生物标志物通过EXPAR扩增使其易于检测，检测限低至fM级别。
(3)本发明与传统检测方法相比，提供了一个通用平台，只需要更换待测物序列即可完成模板的设计，且操作简单，反应迅速，不需要借助费用高昂的仪器设备，繁琐的样品处理步骤以及复杂的实验操作。
附图说明
图1是本发明用于检测目标microRNA的原理图。
图2是本发明用于检测目标物的可行性分析荧光响应图。
图3为本发明用于检测miRNA-21的溶解曲线图(A)和对应的标准曲线(B)，miRNA-9的溶解曲线图(C)和对应的标准曲线(D)，miRNA-122的溶解曲线图(E)和对应的标准曲线(F)。
图4为考察本发明方法特异性荧光响应图。
图5为考察本发明一锅多重检测miRNA热图。
图6以检测金方法RT-qPCR做对比考察本发明方法在检测细胞中目标miRNA的适用性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买得到。
主要试剂来源：
SYBR Green I：Solarbio公司；
KF聚合酶(Klenow fragment polymerase(3’→5’)exo-聚合酶)：New EnglandBiolabs(USA)公司；
Nt.BsmAI内切酶：New England Biolabs(USA)公司；
10×CutSmart缓冲液配方为：50mM KAc,20mM Tris-Ac,10mM Mg(Ac)2,100μg/mlBSA；购自New England Biolabs(USA)公司；
miRNA First Strand cDNA Synthesis试剂盒：生工(上海)公司；
Cham Q Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒：Vazyme Biotech公司(中国)。
以下实施例中使用的扩增模板、miRNA、探针序列如下表1中所示：
表1
注：表1中扩增模板序列中，双下划线部分代表B-N-X-N-X结构中的B，粗体斜体代表其中的N，单下划线代表其中的X。序列3'端的p'代表磷酸化修饰，防止非特异性扩增。
本发明实施例中基于可编程DNA条形码编码指数扩增对miRNA的一锅法多重检测方法，按照如下步骤操作：
S1、EXPAR扩增模板、探针设计
针对每种待测miRNA，设计其EXPAR扩增模板，所述扩增模板由五个结构域组成：B-N-X-N-X；
S2、绘制标准曲线
分别配制不同待测对象miRNA的不同浓度标准品溶液，分别建立每种待测miRNA的标准曲线，步骤如下：
S2.1、等温指数扩增反应：
配制溶液A：将目标miRNA的EXPAR扩增模板、每份标准品miRNA溶液、10×CutSmart混匀，在90℃加热2分钟，随后缓慢降低至室温得到溶液A；
配制溶液B：将dNTP、荧光标记探针、DEPC处理水、KF聚合酶和Nt.BsmAI内切酶在混匀配置成溶液B；
将溶液A与溶液B混合，在37℃下孵育30分钟，并在80℃灭活处理20分钟得到溶液C；
S2.2、熔解曲线分析：
将溶液C进行EXPAR反应，将溶液C在90℃变性2分钟，梯度退火至25℃，按1℃/step的升温速率从45℃升温至90℃，每5s测量每0.5℃的荧光发射，采集荧光信号，生成熔解曲线图，图上的纵坐标即为荧光变化率dRFU/dT；
S2.3、标准曲线建立
以不同浓度标准品的log10[miRNA浓度]为横坐标，以log10(dRFU/dT)为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程；
S3、待测样品检测
S3.1、等温指数扩增反应：取待测品miRNA溶液按照S2.1中的方法进行等温指数扩增反应；
S3.2、熔解曲线分析：与步骤S2.2相同；
S3.3、待测样品浓度计算：
根据步骤S3.2得到的溶解曲线图获得待测品的荧光变化率dRFU/dT，代入步骤S2.3得到的回归方程中，计算即可得到待测miRNA样品的浓度。
具体研究过程如下：
实施例1、以miRNA-21为目标物进行可行性分析
一种基于可编程DNA条形码编码指数扩增对miRNA的多重检测方法的可行性分析，按照以下步骤操作：
首先将针对目标microRNA的扩增模板1μM 1μL，不同浓度(1pM、10pM、100pM、1nM)目标microRNA 1μL，10×CutSmart缓冲液1μL混匀，在90℃水浴加热2分钟，随后缓慢降低至室温得到3μL溶液A。将250μM dNTP 1μL、SYBR Green I 1μL、DEPC处理水、KF聚合酶(3’→5’exo-)0.2U和Nt.BsmAI内切酶1.5U在冰上混匀配置成7μL溶液B。随后立即将溶液A与溶液B混合，在CFX 96实时荧光定量PCR检测系统上于37℃孵育30分钟，同时以5s的间隔监测荧光强度。
结果如图2所示的5条荧光曲线分别为a：未经目标物启动的EXPAR反应的荧光信号、b:由1pM目标物启动的EXPAR反应的荧光信号、c:由10pM目标物启动的EXPAR反应的荧光信号、d：由100pM目标物启动的EXPAR反应的荧光信号、e：由1nM目标物启动的EXPAR反应的荧光信号。以上结果说明，当miRNA-21的浓度从1pM增加到1nM时，荧光信号显著增加。相比之下，在没有miRNA-21的情况下，荧光信号的增加可以忽略不计。根据这些结果，确认了EXPAR的可行性。
实施例2、本发明方法灵敏度分析
以miRNA-21为检测对象进行本发明方法的灵敏度分析，按照以下步骤操作：
(1)等温指数扩增反应：首先将针对目标microRNA(miRNA-21)的扩增模板1μM1μL，不同浓度(10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、500pM)目标microRNA 1μL，10×CutSmart缓冲液1μL混匀，在90℃水浴加热2分钟，随后缓慢降低至室温得到3μL溶液A。将250μM dNTP 1μL、100nM荧光标记探针1μL、DEPC处理水、KF聚合酶(3’→5’exo-)0.2U和Nt.BsmAI内切酶1.5U在冰上混匀配置成7μL溶液B。随后立即将溶液A与溶液B混合，在37℃下孵育30分钟，并在80℃灭活处理20分钟得到溶液C。
(2)熔解曲线分析：将溶液C在90℃变性2分钟，梯度退火至25℃，按1℃/step的升温速率从45℃升温至90℃，并采集荧光信号，根据熔解曲线对反应产物进行分析。
结果如图3所示，图3显示了检测体系中熔解曲线荧光强度与目标物浓度之间的关系。图中结果表明，荧光强度随着目标物浓度增加而升高，同时根据空白样品的背景信号平均值以及3σ方法，计算得检测限为3.3fM。
采用同样的方法计算得miRNA-9和miRNA-122检测限分别为2.9fM和1.7fM，说明本发明检测方法检测结果灵敏度高。
miRNA-21的回归方程为：log10(dRFU/dT)＝0.1548×log10C+4.2617(R2＝0.9989)，
miRNA-9的回归方程为：log10(dRFU/dT)＝0.1932×log10C+4.5256(R2＝0.9949)，
miRNA-122的回归方程为：log10(dRFU/dT)＝0.1145×log10C+3.7461(R2＝0.9837)。
实施例3、本发明方法的特异性分析
本实施例采用干扰物miRNA-141、miRNA-155、miRNA-199a分别进行特异性检测实验，将每种干扰物分别用miRNA-21的扩增模板进行等温指数扩增反应。
按照以下步骤操作：
(1)等温指数扩增反应：首先将针对miRNA-21的扩增模板1μM 1μL，待测microRNA10pM 1μL，10×CutSmart缓冲液1μL混匀，在90℃水浴加热2分钟，随后缓慢降低至室温得到3μL溶液A。将250μM dNTP 1μL、100nM荧光标记探针1μL、DEPC处理水、KF聚合酶(3’→5’exo-)0.2U和Nt.BsmAI内切酶1.5U在冰上混匀配置成7μL溶液B。随后立即将溶液A与溶液B混合，在37℃下孵育30分钟，并在80℃灭活处理20分钟得到溶液C。
(2)熔解曲线分析：将溶液C在90℃变性2分钟，梯度退火至25℃，按1℃/step的升温速率从45℃升温至90℃，并采集荧光信号，根据熔解曲线图对反应产物进行分析。
结果如图4所示，我们选择了具有高度序列同源性的三个对照miRNA作为干扰物进行测试。当miRNA-141、miRNA-155、miRNA-199存在时，无法检测到明显的荧光信号，说明干扰miRNA基本无法激活E-EXPAR反应；而当有且只有一个错配碱基的M1存在时产生，产生的荧光值略微大于错配碱基数达到2个的M2产生的荧光值，但整体体系荧光强度明显低于miRNA-21为目标物时产生的荧光值。以上结果表明，E-EXPAR反应具有较好的选择性。
实施例4
本实施例探究了本发明方法应用于多重检测microRNA的能力。以靶标浓度为100nM的miRNA-21，miRNA-122，miRNA-9为例，在一个反应体系中同时加入三种靶标的对应扩增模板，同时检测其中一个、两个或者三个目标物，包括以下步骤：
(1)等温指数扩增反应：首先将针对不同目标microRNA的扩增模板1μM 1μL，目标microRNA 10nM 1μL，10×CutSmart缓冲液1μL混匀，在90℃水浴加热2分钟，随后缓慢降低至室温得到3μL溶液A。将250nM dNTP 1μL、100nM荧光标记探针1μL、DEPC处理水、KF聚合酶(3’→5’exo-)0.2U和Nt.BsmAI内切酶1.5U在冰上混匀配置成7μL溶液B。随后立即将溶液A与溶液B混合，在37℃下孵育30分钟，并在80℃灭活处理20分钟得到溶液C。每个目标物的溶液A为3μL，每个目标物的溶液B为7μL，当有多个目标物时，则将多个目标物的溶液A混合在一起得到总的溶液A，将多个目标物的溶液B混合在一起得到总的溶液B，将总的溶液A、总的溶液B混合得到的总的溶液C用于下一步实验。
(2)熔解曲线分析：将溶液C在90℃变性2分钟，梯度退火至25℃，按1℃/step的升温速率从45℃升温至90℃，并采集荧光信号，根据熔解曲线对反应产物进行分析。
结果如图5所示，只有在存在每个目标物相应的miRNA的情况下，才能观察到在相应的熔解温度下具有深色块的分布，整个反应时间只需要约60分钟，且整个实验过程只需要一种荧光探针，操作简便，避免了复杂的核酸设计和高额成本，在临床疾病诊断与核酸检测预后等反面具有可观的应用潜力。
实施例5、本发明方法适用性分析
本实施例以miRNA-21、miRNA-9和miRNA-122为检测对象，探究了采用检测金方法RT-qPCR做对比本发明方法的适用性。
(1)细胞样本中miRNAs的提取
将1mL Trizol裂解液加入培养G2/L02细胞六孔板中室温裂解10分钟，以完全分离核酸和蛋白复合物，随后移至1.5mL无酶EP管中。每个样品中加入200μl氯仿，剧烈震荡15秒，室温放置3分钟后，12000rpm，4℃离心15分钟。吸取400μl上清液至同体积异丙醇中，混匀并在室温下静置10-20分钟后以12000rpm，4℃离心10分钟。弃除异丙醇，加入1mL 75％乙醇，12000rpm，4℃离心3分钟，重复三次，弃除乙醇液，室温干燥5分钟，加入20μl DEPC水溶解沉淀，并于-80℃冻存。
(2)RT-qPCR
利用miRNA First Strand cDNA Synthesis试剂盒对提取的循环miRNA进行逆转录。使用Cham Q Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒通过实时荧光定量PCR仪器进行qPCR，选择U6作为外部参比。使用合成miRNA-21/miRNA-122/miRNA-9获得的标准曲线将循环阈值(CT)转换为miRNA-21/miRNA-122/miRNA-9浓度。反应循环参数是95℃下30秒；95℃5秒，50℃30秒，40个循环。
(3)本发明方法
按照实施例4中的方法进行。
将步骤(1)提取的细胞样本中miRNAs按照本发明方法进行检测，计算得知其中的miRNAs含量。
结果如图6B所示，与L02相比，HepG2中miRNA-21、miRNA-9的表达水平显著升高，而HepG2中miRNA-122的表达水平较低，这与RT-qPCR结果(图6A)以及报告的参考文献一致，说明本发明方法检测结果准确可靠。
Claims (10)
1.一种基于可编程DNA条形码编码指数扩增对miRNA的一锅法多重检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、EXPAR扩增模板、探针设计
针对每种待测miRNA，设计其EXPAR扩增模板，所述扩增模板由五个结构域组成：B-N-X-N-X，其中X代表miRNA识别位点，N包含Nt.BsmAI的切口位点，而B代表不同扩增模板具有的独特熔解温度编码序列的互补序列；
所述探针包括与采用EXPAR反应所获得的3’末端为富G序列的扩增产物互补的序列区域；
S2、绘制标准曲线
分别配制不同待测对象miRNA的不同浓度标准品溶液，分别建立每种待测miRNA的标准曲线，步骤如下：
S2.1、等温指数扩增反应：
配制溶液A：将目标miRNA的EXPAR扩增模板、每份标准品miRNA溶液、10×CutSmart混匀，在90-95℃加热2-5分钟，随后缓慢降低至室温得到溶液A；
配制溶液B：将dNTP、荧光标记探针、DEPC处理水、KF聚合酶和Nt.BsmAI内切酶在混匀配置成溶液B；
将溶液A与溶液B混合，孵育后灭活处理后得到溶液C；
S2.2、熔解曲线分析：
将溶液C进行EXPAR反应，生成熔解曲线图，图上的纵坐标即为荧光变化率dRFU/dT；
S2.3、标准曲线建立
以不同浓度标准品的log10[miRNA浓度]为横坐标，以log10(dRFU/dT)为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程；
S3、待测样品检测
S3.1、等温指数扩增反应：取待测品miRNA溶液按照S2.1中的方法进行等温指数扩增反应；
S3.2、熔解曲线分析：与步骤S2.2相同；
S3.3、待测样品浓度计算：
根据步骤S3.2得到的熔解曲线图获得待测品的荧光变化率dRFU/dT，代入步骤S2.3得到的回归方程中，计算即可得到待测miRNA样品的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待测miRNA包括miRNA-21、miRNA-9、miRNA-122中的一个或多个；
miRNA-21对应的扩增模板序列为：CCCTACTTCATCCAACTACTCCACGGAGACTCAACATCAGTCTGATAAGCTAGGAG ACTCAACATCAGTCTGATAAGCTA-p’；
miRNA-9对应的扩增模板序列为：CCCTACTTCATCCAAGGACTCCACGGAGACTCATACAGCTAGATAACCAAAGAGGA GACTCATACAGCTAGATAACCAAAGA-p’；
miRNA-122对应的扩增模板序列为：CCCTACTTTATCCAAGTACTTCACGGAGACCAAACACCATTGTCACACTCCAGGAG ACCAAACACCATTGTCACACTCCA-p’。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述探针为荧光标记探针，探针序列是：HEX-CCCTACTTCATCCAACTACTCCAC-p’。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于：
所述溶液A的总体积为3μL，含有：1μM扩增模板1μL、miRNA溶液1μL、10×CutSmart缓冲液1μL；当步骤S3.1中含有多个待测miRNA时，按照每种miRNA配制一份3μL的溶液A后混合所有的溶液A得到总的溶液A；
所述溶液B的总体积为7μL，含有：250μM dNTP 1μL、100nM荧光标记探针1μL、KF聚合酶0.2U和Nt.BsmAI内切酶1.5U、余量为DEPC处理水；当步骤S3.1中含有多个待测miRNA时，按照每种miRNA配制一份7μL的溶液B后混合所有的溶液B得到总的溶液B；
将总的溶液A、总的溶液B混合后得到总的溶液C，用于熔解曲线分析。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤S2.2和S3.2中熔解曲线分析方法为：将溶液C在90℃变性2分钟，梯度退火至25℃，按1℃/step的升温速率从45℃升温至90℃，并采集荧光信号，根据熔解曲线对反应产物进行分析。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤S2.2和S3.2中每5s测量每0.5℃的荧光发射，生成熔解曲线图。
7.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述步骤S2.3中，
miRNA-21的回归方程为：log10(dRFU/dT)＝0.1548×log10C+4.2617(R2＝0.9989)，
miRNA-9的回归方程为：log10(dRFU/dT)＝0.1932×log10C+4.5256(R2＝0.9949)，
miRNA-122的回归方程为：log10(dRFU/dT)＝0.1145×log10C+3.7461(R2＝0.9837)，
其中，C为miRNA样品的浓度。
8.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述标准品为浓度为10fM～1nM的梯度浓度样品。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述溶液A将各组分混匀后，在90℃水浴加热2分钟，随后缓慢降低至室温得到溶液A。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述等温指数扩增反应将溶液A与溶液B混合，在36-38℃下孵育28-32分钟，并在80℃灭活处理20分钟得到溶液C。
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